從血液中分離循環(huán)腫瘤細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從血液中分離循環(huán)腫瘤細胞的方法，該方法包括如下步驟：A.將血液樣品與能夠特異性結合循環(huán)腫瘤細胞表面獨特抗原的抗體-標記單鏈多核苷酸復合物混合并孵育；B.將孵育后的血液樣品流經微流控芯片，芯片的微通道內至少有一個表面負載有單鏈多核苷酸，通過多核苷酸與抗體-標記單鏈多核苷酸復合物中的標記單鏈多核苷酸的特異性結合將循環(huán)腫瘤細胞從血液中分離出來并固定在芯片表面，以實現循環(huán)腫瘤細胞與血液樣品的分離。本發(fā)明中的芯片的微通道具有特殊的幾何結構，能夠增加血液中細胞與微通道表面接觸的幾率，從而提高循環(huán)腫瘤細胞的捕獲效率，且芯片無需進行抗體負載，整個捕獲過程操作簡便，同時芯片也易于長期保存。
【專利說明】從血液中分離循環(huán)腫瘤細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物與醫(yī)學檢測，涉及一種從混合細胞群體中分離稀有細胞的方法，特別涉及一種從血液樣品中分離循環(huán)腫瘤細胞的方法。
【背景技術】
[0002]稀有細胞是指生物樣本中存在的數量稀少卻具有重要生物學功能或臨床檢測意義的細胞，如人外周血中的循環(huán)腫瘤細胞、循環(huán)內皮細胞、被病毒感染的細胞，以及實體腫瘤中的腫瘤干細胞等。由于稀有細胞數量極其稀少，對其檢測猶如大海撈針，而對其進一步的分析就更加困難，因此急需發(fā)展能夠高效、快速的將稀有細胞從復雜生物樣本中分離出來的方法與工具。 [0003]人外周血中的循環(huán)腫瘤細胞(CTC)是一類具有代表性的稀有細胞，它是指自發(fā)或因診療操作由腫瘤病灶播散進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞，并在一定條件下可發(fā)展為腫瘤轉移性病灶(Racila E, Euhus D, Weiss AJ, et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.1998,95, 4589-4594 ；Pantel K，Brakenhoff RH，Nat.Rev.Cancer2004，4，448-456 ；Zhe XN，Cher ML, Bonfil RD, Am.J.Cancer Res.2011，1，740-751 ；Butler TP，Gullino PM, CancerRes.1975,35,512-516) o由于超過90%的癌癥死亡是由轉移造成的(Mehlen P，PuisieuxA，Nat.Rev.Cancer2006，6，449-458)，而循環(huán)腫瘤細胞是腫瘤轉移灶的直接來源(DawoodS，Cristofanilli M，Curr.Treat Options Oncol.2007，8，89-95 ;Fidler IJ，Nat.Rev.(68^^1^2003,3,453-458),因此從血液中檢測循環(huán)腫瘤細胞越來越引起人們的重視。目前已有證據顯示檢測外周血中的循環(huán)腫瘤細胞數目可用于實體瘤患者的預后以及預測化療的有效性，包括乳腺癌(Cristofanilli M，BuddT，Ellis MJ，et al.N.Engl.J.Med.2004,351，781-791 ;Smerage JB，Hayes DF，Cancer Invest.2008，26，109-114)、前列腺癌(Moreno JG, Miller MC，Gross S，et al.Urology2005，65，713-718 ;De Bono JS，ScherHI，Montgomery RB，et al.Clin.Cancer Res.2008，14，6302-6309 ；Scher HI，Jia XY，DeBono JS, et al.Lancet Oncol.2009，10，233-239)、結腸癌(Sastre J, Maestro ML, PuenteJ，et al.Ann.0ncol.2008，19，935-938)、腎細胞癌(Bluemke K，Bilkenroth U，MeyeA，etal.Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.2009，18，2190-2194)，黑色素瘤(Palmieri G，Satriano SM，Budroni M，et al.BMC Cancer.2006，6，266 ；Mocellin S，Hoon D，AmbrosiA，et al.Clin.Cancer Res.2006，12，4605-4613)等。進一步運用循環(huán)腫瘤細胞負荷作為潛在預測指標來指導實體瘤患者的病程分期和復發(fā)監(jiān)控已成為癌癥研究中一個活躍而重要的課題(Pachmann K，Dengler R, Lobodaseh K, et al.J.Cancer Res.Clin Oncol, 2008,134,59-65)o
[0004]循環(huán)腫瘤細胞在外周血中含量極少，每10ml血液可能僅含幾個到幾十個循環(huán)腫瘤細胞，卻有多達約1億個白細胞和500億個紅細胞(Zhe XN, Cher ML，Bonfil RD，Am.J.Cancer Res.2011，1,740-751)，因此從外周血中快速、高效的分離循環(huán)腫瘤細胞是后續(xù)對循環(huán)腫瘤細胞計數、以及分子、功能分析的前提。目前循環(huán)腫瘤細胞的分離方法主要可分為兩類。一類是基于循環(huán)腫瘤細胞與血液中其他細胞物理性質的差異，如密度(Rosenberg R,Gertler R, Friederichs J, et al.Cytometry2002，49，150-158)、大小(VonaG，Sabile A，Louha M，et al.Am.J.Pathol.2000，156，57-63 ；Zheng S，Lin H，Liu J-Q，et al.J.Chromatogr.A.2007，1162，154-161 ；Tan SJ，Yobas L, Lee GYH，et al.2009，11，4,883-892 ;美國專利申請20060254972 ;美國專利7，846，393)等的不同從而實現循環(huán)腫瘤細胞與其他細胞的分離。然而血液中的血細胞數量巨大，其密度、大小的分布很寬，而循環(huán)腫瘤細胞又具有較大的異質性，因此通過細胞物理性質差異分離循環(huán)腫瘤細胞往往會混入大量的白細胞，獲得的樣品純度很低，難以進行后續(xù)分析。另一類循環(huán)腫瘤細胞捕獲方法主要基于其表面與血細胞不同的獨特抗原，通過針對循環(huán)腫瘤細胞表面獨特抗原的抗體或核算適配體實現循環(huán)腫瘤細胞的捕獲并與血液中其他細胞分離。目前可選擇的抗原包括上皮細胞抗原EpCAM，器官特異性標志物(如PSA、CEA和HER-2)，EMT標志物等(Trzpis M，McLaughlin PM, De Leij LM，Harmsen MC，Am.J.Pathol.2007，171，386-395 ;美國專利申請 20130209493)，這一方法的富集效率可達(1-20) X 104 倍(Paterlin1-BrechotP, BenaliNL，Cancer Lett.2007，253，180-204)，同時也存在可用于捕獲循環(huán)腫瘤細胞的核算適配體(美國專利申請20130035630)。其中最具代表性的技術是已被美國FDA批準應用于檢測轉移性乳腺癌、前列腺癌及結直腸癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細胞的CellSearchTM系統(tǒng)(Cristofanilli M，Budd T,Ellis MJ，et al.N.Engl.J.Med.2004，351，781-791 ；RiethdorfS，Fritsche H，Muller V，et al.Clin.Cancer Res.2007，13，920-928 ；Cohen SJ, PuntCJA，Iannotti N，et al.J.Clin.0ncol.2008，26，3213-3221)，這一系統(tǒng)運用標記有針對EpCAM抗體的磁性顆粒進行血液中循環(huán)腫瘤細胞的捕獲，但其捕獲效率較低，存在血細胞的非特異性吸附，且這一方法捕獲的循環(huán)腫瘤細胞已喪失活性，難以進行信號通路與功能性分析，無法對其進行體外培養(yǎng)。近年來通過將微流控芯片技術與抗體捕獲相結合發(fā)展出了一系列的循環(huán)腫瘤細胞芯片捕獲技術，通過特殊幾何設計的微通道大大增加了細胞與負載有抗體的捕獲表面的碰撞幾率以提聞循環(huán)腫瘤細胞的捕獲效率，如微柱陣列芯片(NagrathS,Sequist LV,Maheswaran S, et al.Nature2007,450,1235-1239 ；Maheswaran S,SequistLV, Nagrath S, et al.N.Engl.J.Med.2008，359，366-377)、具有周期性表面凹凸結構的“魚骨型”芯片(Stott SL，Hsu C-H, Tsukrov DI，et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2010,107,18392-18397)等，同時保持了循環(huán)腫瘤細胞的活性。但是，基于微流控芯片與抗體的捕獲方法的捕獲效率仍有待于進一步提高，捕獲到細胞的純度較低，存在大量白細胞的非特異性吸附，且這些方法由于需要對芯片進行抗體修飾，其操作較為繁瑣，并且負載了抗體的芯片不易長期保存。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的，就是為了提供一種從混合細胞群體中分離稀有細胞的方法，特別是從血液樣品中分離循環(huán)腫瘤細胞的方法。
[0006]為了實現上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案:一種從血液樣品中分離循環(huán)腫瘤細胞的方法，包括如下步驟:
[0007]A、將經抗凝處理的血液樣品與能夠特異性結合循環(huán)腫瘤細胞表面獨特抗原的抗體-標記單鏈多核苷酸復合物混合并孵育；[0008]B、將孵育后的血液樣品流經微流控芯片，芯片的微通道內至少有一個表面負載有單鏈多核苷酸，該單鏈多核苷酸能夠與抗體-標記單鏈多核苷酸復合物中的標記單鏈多核苷酸特異性結合，并通過這種特異性結合將循環(huán)腫瘤細胞從血液中分離出來并固定在芯片表面以實現循環(huán)腫瘤細胞與血液樣品的分離。
[0009]上述方法中，所述抗體-多核苷酸復合中的單鏈多核苷酸與負載于芯片微通道表面的單鏈多核苷酸能夠特異性結合并形成穩(wěn)定的雙鏈結構，優(yōu)選的，兩條單鏈多核苷酸中至少有連續(xù)的10個核苷酸互補，更優(yōu)選的，至少有連續(xù)的20個核苷酸互補。
[0010]上述方法中，所述抗體-標記單鏈多核苷酸復合物中的標記單鏈多核苷酸通過共價鍵與抗體直接相連，或者抗體與標記單鏈多核苷酸通過共價鍵或其他作用力共同連接在納米粒子上。
[0011]上述方法中，所述針對循環(huán)腫瘤細胞表面獨特抗原的抗體-標記單鏈多核苷酸復合物可以是一種，也可以是針對不同抗原的多種抗體-標記單鏈多核苷酸復合物。
[0012]上述方法中，所述芯片微通道中負載多核苷酸的表面為二氧化硅、硅片或通過沉積了金屬氧化物納米線、納米帶等微結構而產生的粗糙化的表面。
[0013]上述方法中，所述芯片微通道表面上負載多核苷酸的方式可通過靜電作用或共價作用。
[0014]上述方法中，所述微流控芯可以通過并聯的組合形式從而能夠處理更大量的血液樣品，以及通過串聯的組合形式提聞血液中循環(huán)腫瘤細胞的捕獲效率。
[0015]上述方法中，所述微流控芯片具有使所述微流控芯片具有使流經該芯片的血液中的細胞增加與負載有單鏈多核苷酸表面接觸幾率的幾何結構，該幾何結構包括周期性的微柱陣列結構、具有周期性表面凹凸的“魚骨型”結構或表面沉積有納米線、納米帶等微結構基底。
[0016]上述方法中，所述的血液樣品流經微流控芯片的流速為每小時100微升至10毫升。
[0017]與現有技術相比，本發(fā)明具有以下的優(yōu)點和特點:
[0018]1)本發(fā)明不同于以往的將抗體固定在微通道表面進行捕獲，而是將抗體與細胞混合，抗體與稀有細胞表面的特異性抗原結合，同時這些抗體上連有標記單鏈多核苷酸，可以被微通道表面負載的與之能夠特異性結合的單鏈多核苷酸所捕獲。這將原來細胞表面的抗原與微通道表面抗體間的相互結合轉化成細胞表面結合的抗體上的多核苷酸與微通道表面負載的多核苷酸之間的相互結合。后者相互結合的能力高于前者，因此稀有細胞更容易被捕獲。
[0019]2)由于稀有細胞數目極少，而大量無關細胞(如血液中的紅細胞、白細胞)在微通道表面、尤其是在負載了抗體的表面的非特異性吸附導致捕獲到的細胞純度很低，而且由于這些非特異性細胞占據了部分表面導致可用于捕獲的表面減少，捕獲率降低，同時容易粘附樣本中的其他細胞，使純度進一步降低。本發(fā)明中的芯片負載了多核苷酸，帶負電，能夠與細胞表面的負電相排斥，因而能夠降低非特異性吸附，提高捕獲到細胞中稀有細胞的純度。
[0020]3)本發(fā)明只需對芯片進行簡單的多核苷酸負載，而無需進行復雜的抗體負載，因此整個操作較為簡便，且由于負載多核苷酸的芯片在真空或氮氣保護下可在室溫或4度長期保存，比負載了抗體的芯片保存更容易，保存時間更長。
[0021]4)美國專利申請US20090017455與中國專利申請200780036725.4采用了抗
體-標記單鏈多核苷酸復合物與基底多核苷酸特異性結合在基底上構建抗體陣列，捕獲溶液中的能與該抗體結合的細胞。其與本發(fā)明的不同之處在于:第一、本發(fā)明將抗體-標記單鏈多核苷酸復合物先與細胞混合，然后再與基底多核苷酸結合，而以上專利申請中先將抗體-標記單鏈多核苷酸復合物與基底多核苷酸結合，然后再去結合溶液中的細胞，與傳統(tǒng)的在表面構建抗體陣列用于捕獲溶液中細胞的方法并無本質區(qū)別，而相比之下本發(fā)明對于溶液中細胞的捕獲效率更高；第二、以上專利申請是將細胞與固定在基底上的抗體-多核苷酸復合物做靜態(tài)孵育，而本發(fā)明是將抗體-標記單鏈多核苷酸復合物與細胞混合后在一定流速下通過微流控芯片，該芯片中具有能增加細胞與微通道表面碰撞幾率的特殊幾何設計，大大提聞了細胞的捕獲效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是血液中循環(huán)腫瘤細胞的捕獲過程示意圖。
【具體實施方式】
[0023]本發(fā)明一種從血液樣品中分離循環(huán)腫瘤細胞的方法，包括如下步驟:
[0024]A、將經抗凝處理的血液樣品與能夠特異性結合循環(huán)腫瘤細胞表面獨特抗原的抗體-標記單鏈多核苷酸復合物混合并孵育；
[0025]B、將孵育后的 血液樣品流經微流控芯片，芯片的微通道內至少有一個表面負載有單鏈多核苷酸，該單鏈多核苷酸能夠與抗體-標記單鏈多核苷酸復合物中的標記單鏈多核苷酸特異性結合，并通過這種特異性結合將循環(huán)腫瘤細胞從血液中分離出來并固定在芯片表面以實現循環(huán)腫瘤細胞與血液樣品的分離。
[0026]圖1是血液中循環(huán)腫瘤細胞的捕獲過程示意圖，其中，1為血液樣品中的循環(huán)腫瘤細胞，2為血液中除循環(huán)腫瘤細胞外的其他細胞，3為捕獲抗體-標記單鏈多核苷酸復合物，4為表面負載的單鏈多核苷酸,5為能夠負載多核苷酸的表面,如表面修飾氨基的玻璃或娃片，6為具有周期性凹凸結構的微流控芯片。經抗凝處理的血液樣品中存在少量的循環(huán)腫瘤細胞1與大量的其他細胞2，血液樣品與抗體-標記單鏈多核苷酸復合物3混合并孵育，孵育后的血液樣品流經具有特殊幾何結構的微流控芯片6，芯片的微通道表面5負載有單鏈多核苷酸4，該多核苷酸能夠與抗體-標記單鏈多核苷酸復合物3中的標記多核苷酸特異性結合，從而將循環(huán)腫瘤細胞1與血液樣品中的其他細胞2分離并固定在芯片表面5。
[0027]本發(fā)明的工作原理是，當腫瘤細胞與負載有針對其表面抗原的抗體表面接觸時，其接觸面積較小，作用力較弱，而當腫瘤細胞先與抗體-多核苷酸復合物結合，再與負載了互補多核苷酸的表面接觸，由于每個抗體上可連接多條標記多核苷酸，且在基底上負載多核苷酸的密度也大于負載抗體，因此腫瘤細胞有更大的幾率被基底上負載的多核苷酸所捕犾。
[0028]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
[0029]實施例1微流控芯片基底負載多核苷酸
[0030]將序列如SEQ ID N0.1所示的多核苷酸溶于純水，配成濃度400 μ Μ的溶液，再與二甲基亞砜(DMSO)按體積比2:1稀釋為終濃度267 μ Μ的溶液。同時，將用于灌注多核苷酸的聚二甲基硅氧烷PDMS(RTV615，購自通用電氣公司)微流控芯片貼在多聚賴氨酸玻璃(購自賽默飛世爾科技Thermo Fisher Scientific公司)上，放在烘箱中80°C處理2小時。處理結束后，采用恒流泵灌注濃度為267 μ Μ的多核苷酸溶液，灌滿后放于干燥箱中干燥，待通道中液體完全干后，揭下微流控芯片，將玻璃置于烘箱中80°C處理4小時，然后用純水快速清洗出去玻璃表面的鹽和溶劑殘余，氮氣吹干 。
[0031]實施例2 “魚骨型” CTC捕獲芯片的制作
[0032]將具有周期性表面凹凸結構的“魚骨型”PDMS芯片(制作方法見Wang，S.T.；Liu,K.；Liu, J.A.et al,.Angew.Chem.1nt.Ed.2011，50，3084-3088)貼在負載有多核苷酸的多聚賴氨酸玻璃上，確?！棒~骨型”芯片的微通道與基底多核苷酸區(qū)域重合，將芯片放于烘箱中80°C處理2小時，處理完畢后待芯片恢復至室溫后用夾具固定。“魚骨型”芯片有一個入口和一個出口，通道呈連續(xù)的S型，寬度1mm，整體長度為200mm，芯片的橫截面呈周期性的凹凸結構，由兩層SU8光刻膠制備而成，下層光刻膠厚度為70 μ m,上層光刻膠厚度為35 μ m，上層的魚骨圖形呈周期性排列，“魚骨”寬度為35μπι，水平夾角為45度，周期性間隔為100 μ m, 一組共20條“魚骨”。
[0033]實施例3 “魚骨型”芯片捕獲血液中的稀有腫瘤細胞
[0034]首先在“魚骨型”芯片中通過恒流泵灌注3%牛血清白蛋白(BSA)，室溫靜置1小時對芯片進行封閉。將結腸癌腫瘤細胞HCT116懸浮與細胞培養(yǎng)基中，用細胞膜紅色熒光探針Dil (購自碧云天)染成紅色，然后取1000個HCT116細胞與1毫升經抗凝處理的健康人的全血混合，同時加入1微升lmg/ml的上皮細胞粘附分子(EpCAM)-標記單鏈多核苷酸復合物(序列如SEQ ID N0.2所示，其中序列的5端，即左端標記氨基，將單鏈多核苷酸標記在抗體上使用美國solulink公司的試劑盒Antibody-01 igonucleotide All-1n-0neConjugation Kit),充分混合半小時后采用注射器和恒流泵以lmL / h的流速通過“魚骨型”PDMS芯片。灌注結束后，通過恒流泵用細胞培養(yǎng)基進行清洗除去多余血液，同時避光收集流經芯片的血液。最后，使用活細胞工作站對“魚骨型”芯片中腫瘤細胞進行計數以計算捕獲率，更準確的，可對流經芯片的血液進行紅細胞裂解(紅細胞裂解液購自碧云天)，然后對其中未被芯片捕獲的腫瘤細胞進行計數，從而可以更準確的計算捕獲率。通過長度為200_微通道的芯片的捕獲率為61 %，如果連續(xù)流經兩個相同的“魚骨型”芯片，即捕獲通道長度達到400mm時，捕獲率可達89 %。
[0035]實施例4納米“魚骨型” CTC捕獲芯片的制作與血液中腫瘤細胞的捕獲
[0036]利用電紡絲技術可以在“魚骨型”芯片的基底表面沉淀納米結構，使之粗糙化，從而增加CTC與基底碰撞時被捕獲的效率。電紡絲(Electrospinning)技術是將強電場作用于聚合物溶液，使之形成絲狀噴射流，可以在收集表面形成直徑為納米級別的纖維。在本實施例中，使用正硅酸乙酯(TE0S)與聚乙烯吡咯烷酮(PVP)聚合物溶液，通過施加15KV的高壓電場，使聚合物溶液呈絲狀噴射，在硅片表面“紡”出PVP-Si02納米線，經過400°C退火后，在光滑的硅片表面形成具有一定粗糙度的Si02納米纖維結構(Zhang，N.；Deng, Y.；Tai,Q.;etal.，Adv.Mater.2012，24，2756-2760)。在納米纖維表面負載多核苷酸、制作“魚骨型”捕獲芯片以及從血液中捕獲腫瘤細胞的實驗同實施例1、2、3，納米“魚骨型” CTC捕獲芯片的捕獲效率可達65% (200mm長的通道)，如果連續(xù)流經兩個相同的“魚骨型”芯片，即捕獲通道長度達到400mm時，捕獲率達到92%。
[0037] 實施例5針對血液中腫瘤細胞表面多個特異性標志物的捕獲
[0038]實施例3中使用了針對血液中腫瘤細胞表面特異性的上皮細胞粘附分子EpCAM的抗體進行捕獲，由于結腸癌細胞HCT116表面除了表達EpCAM以外，還同時表達EGFR與CD44，因此同時針對多個表面特異性抗原進行的捕獲可進一步提高捕獲效率，尤其是可以捕獲不表達或低表達EpCAM的HCT116細胞?！揪唧w實施方式】同實施例3，唯一不同的是將加入1微升濃度為lmg / ml的EpCAM-標記單鏈多核苷酸(序列如SEQ ID N0.2所示)復合物改為加入濃度為lmg/ml的EpCAM-標記單鏈多核苷酸(序列同上)復合物、濃度為lmg /ml的EGFR-標記單鏈多核苷酸(序列同上)復合物與濃度為lmg / ml的⑶44-標記單鏈多核苷酸(序列同上)復合物各1微升，其捕獲效率可提升至67%，如果連續(xù)流經兩個相同的“魚骨型”芯片，即捕獲通道長度達到400mm時，捕獲率為98%。
【權利要求】
1.一種從血液中分離循環(huán)腫瘤細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟:A、將經抗凝處理的血液樣品與能夠特異性結合循環(huán)腫瘤細胞表面獨特抗原的抗體-標記單鏈多核苷酸復合物混合并孵育；B、將孵育后的血液樣品流經微流控芯片，芯片的微通道內至少有一個表面負載有單鏈多核苷酸，該單鏈多核苷酸能夠與抗體-標記單鏈多核苷酸復合物中的標記單鏈多核苷酸特異性結合，并通過這種特異性結合將循環(huán)腫瘤細胞從血液中分離出來并固定在芯片表面以實現循環(huán)腫瘤細胞與血液樣品的分離。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的血液樣品是指經過抗凝處理的全血樣本，其體積為1毫升至10毫升，抗凝劑包括乙二胺四乙酸、檸檬酸或肝素。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗體-標記單鏈多核苷酸復合物中的標記單鏈多核苷酸與負載于芯片微通道表面的單鏈多核苷酸能夠特異性結合并形成穩(wěn)定的雙鏈結構，兩種單鏈多核苷酸中至少有連續(xù)的10個核苷酸互補，或者至少有連續(xù)的20個核苷酸互補。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗體-標記單鏈多核苷酸復合物中的標記單鏈多核苷酸通過共價鍵與抗體直接相連，或者抗體與標記單鏈多核苷酸通過共價鍵或其他作用力共同連接在納米粒子上。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述能夠特異性結合循環(huán)腫瘤細胞表面獨特抗原的抗體-標記單鏈多核苷酸復合物可以是一種，也可以是針對不同抗原的多種不同的抗體-標記單鏈多核苷酸復合物。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述芯片微通道內負載多核苷酸的表面為二氧化硅、硅或通過沉積 金屬氧化物納米線、納米帶而產生的粗糙化的表面。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述芯片微通道表面通過靜電作用或共價作用負載多核苷酸。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流控芯通過并聯組合使用或通過串聯組合使用。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流控芯片具有使流經該芯片的細胞增加與負載有單鏈多核苷酸表面接觸幾率的幾何結構，該幾何結構包括周期性的微柱陣列結構、具有周期性表面凹凸的“魚骨型”結構或表面沉積有納米線、納米帶的基底。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的血液樣品流經微流控芯片的流速為每小時100微升至10毫升。
【文檔編號】C12N5/09GK103642755SQ201310546026
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月6日 優(yōu)先權日:2013年11月6日
【發(fā)明者】施奇惠, 鄧宇亮, 張瑜, 孫帥 申請人:上海交通大學