一種提取景天科植物細胞液泡的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提取景天科植物細胞液泡的方法，包括原生質(zhì)體提取、液泡粗提和液泡純化，所述液泡純化包括：將粗提的液泡重懸于質(zhì)量體積比濃度為0～5%的密度梯度介質(zhì)溶液中，往該重懸液下層加入質(zhì)量體積比濃度為7～10%的密度梯度介質(zhì)溶液，進行密度梯度離心，獲取純化的液泡。本發(fā)明在進行液泡純化時，先在離心管中利用濃度較小的密度梯度介質(zhì)溶液重懸粗提液泡，再沿著離心管壁往離心管底部慢慢加入濃度較大的密度梯度介質(zhì)溶液，此時離心管中溶液分為兩層，然后再進行密度梯度離心，由此獲得的液泡膜完整性高，液泡數(shù)量多，純度高。
【專利說明】一種提取景天科植物細胞液泡的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物細胞液泡提取【技術領域】，具體涉及ー種提取景天科植物細胞液泡的方法。
【背景技術】
[0002]東南景天是中國本土發(fā)現(xiàn)的少數(shù)幾種鎘超積累植物之一，屬景天科，對鋅鉛也有很強的耐性和積累能力，在我國重金屬污染土壌植物修復領域具有很大的應用前景。對東南景天超積累特性和生理機制的研究，不僅能促進該植物在污染環(huán)境修復領域的直接應用，更有助于探明植物超積累重金屬這ー現(xiàn)象，為推動污染土壌植物修復技術的改良與優(yōu)化提供可靠理論基礎。鑒于此，東南景天作為亞洲地區(qū)的ー種多金屬積累特異植物，其相關研究已引起了不少國外同行 的關注。
[0003]前期研究發(fā)現(xiàn)，鎘超積累植物東南景天根系可主動吸收鎘，通過高效的運輸系統(tǒng)轉(zhuǎn)運到植物地上部并大量積累。作為ー種生物非必需元素，鎘在普通植物細胞內(nèi)過多積累通常會產(chǎn)生嚴重的毒害作用?？梢?，東南景天地上部必然存在著一套針對大量鎘元素的穩(wěn)態(tài)平衡機制。
[0004]通常認為，重金屬在植物地上部的穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡調(diào)控有賴于特定細胞或細胞器(如細胞壁、液泡等)的區(qū)_作用(Sequestration)和某些有機化合物的螯合作用(Chelation)。
[0005]植物細胞中的液泡膜具有特殊的選擇透性，使液泡具有高滲性質(zhì)，引起水分向液泡內(nèi)運動，對調(diào)節(jié)細胞滲透壓、維持膨壓有很大關系，并且能使多種物質(zhì)在液泡內(nèi)貯存和積累。有關東南景天的前期研究結果暗示，東南景天地上部對鎘的超積累機制關鍵可能在于液泡的區(qū)隔作用。通過LA-1CP-MS和同步輻射XRF兩種不同分析技術，對東南景天莖葉中鎘的分布特征進行原位分析，皆表明鎘的主要區(qū)隔場所是皮層、髓和葉肉組織等薄壁組織?？梢姡罅恳号莸谋”诩毎跂|南景天對鎘的區(qū)隔化過程中占主導地位，這與其他超積累植物上發(fā)現(xiàn)的鎘主要存在于表皮細胞中大為不同，但還有待進ー步研究證實，而液泡的提取對進ー步明確液泡在超積累植物中對鎘的區(qū)隔作用及其相關機理尤為重要。
[0006]液泡提取的方法一般包括裂解細胞提取原生質(zhì)體，再裂解原生質(zhì)體提取液泡。由于不同植物細胞的細胞結構有差異，且液泡的膜結構極易受外界環(huán)境影響而破裂，因此提取液泡的方法也不盡相同。對于遏藍菜葉片的液泡的提取已有相關報道(Ma，J.F.，et al., Subcellular localisation of Cd and Zn inthe leaves of a Cd-hyperaccumulating ecotype of Thlaspi caerulescens.Planta, 2005.220(5):731-736)。但該方法在液泡純化過程中，先將粗提液泡重懸于濃度較大的聚蔗糖溶液中，再在該重懸液的上層加ー層濃度較小的聚蔗糖溶液進行密度梯度離心，提取液泡的效率較低，甚至無法得到完整、純度較高的液泡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種提取景天科植物細胞液泡的方法，利用該方法能夠簡便有效地從景天科植物細胞提取到完整且純度較高的液泡。
[0008]一種提取景天科植物細胞液泡的方法，包括原生質(zhì)體提取、液泡粗提和液泡純化，所述液泡純化包括:
[0009]將粗提的液泡重懸于質(zhì)量體積比濃度為0~5%的密度梯度介質(zhì)溶液中，得到重懸液；往該重懸液下層加入質(zhì)量體積比濃度為7~10%的密度梯度介質(zhì)溶液，進行密度梯度離心，獲取純化的液泡。
[0010]密度梯度離心一般在容積較小的離心管中進行。 申請人:利用質(zhì)量體積比濃度較小的密度梯度介質(zhì)溶液重懸粗提液泡，再沿著離心管壁往離心管底部慢慢加入濃度較大的密度梯度介質(zhì)溶液，此時離心管中溶液分為兩層，然后再進行密度梯度離心，在兩層溶液中會出現(xiàn)ー個粉紅色層，該粉紅色層內(nèi)即為純化的液泡。
[0011]與高濃度的密度梯度介質(zhì)溶液(下層，粘度大)相比，重懸在低濃度的密度梯度介質(zhì)溶液(上層，粘度小)中的液泡更易往兩層密度梯度介質(zhì)溶液的分界面聚集；并且，在高濃度的密度梯度介質(zhì)溶液中，較難去除原生質(zhì)體破裂時粘附在液泡表面的原生質(zhì)體膜，難以獲得純度較高的液泡。
[0012]由于密度梯度離心在離心管中進行，當沿著離心管壁往底部慢慢加入下層密度梯度介質(zhì)溶液時，該溶液與重懸液之間的接觸面是由小變大的，使得兩者之間的分界面較為清晰；假如先在離心管中加下層密度梯度介質(zhì)溶液，再在上層加重懸液，兩者之間的接觸面從ー開始就較大，加液完成后兩者之間的分界面稍嫌模糊，不利于液泡的純化。
[0013]如未作特殊說明，本發(fā)明中，質(zhì)量體積比濃度以g/100mL為單位，0~5%相當于
0~5g/100mL (0 ~50g/L)，7 ~10% 即相當于 7 ~10g/100mL (70 ~100g/L)。
[0014]本發(fā)明中，所述景天科植物細胞優(yōu)選為薄壁組織細胞，更優(yōu)選為葉肉組織細胞。薄壁組織角質(zhì)化程度較低，預處理較為便捷。所述景天科植物優(yōu)選為東南景天。便于為東南景天中鎘的超積累機制提供技術手段。
[0015]具體地，本發(fā)明提取景天科植物細胞液泡的方法包括:
[0016](I)原生質(zhì)體提取:取東南景天葉片，將其切成寬度為I~2mm的細條狀后浸入細胞裂解液中，經(jīng)裂解、過濾、離心清洗后獲得原生質(zhì)體；
[0017]優(yōu)選取用幼嫩葉片進行切片，切片前先撕去葉片的上表皮或/和下表皮，再以與葉脈垂直的方向進行切片，以提高原生質(zhì)體的提取效率。
[0018]所述細胞裂解液優(yōu)選為由以下成分組成的水溶液:1-1.5% (w/v)纖維素酶，0.2-0.4% (w/v)離析酶，0.35~0.45M甘露醇，18~22mM氯化鉀，18~22mM —水嗎啉こ磺酸，8~12mM CaCl2氯化鈣,4~6mM P -巰基こ醇；更優(yōu)選為由以下成分組成的水溶液:1-1.5% (w/v)纖維素酶，0.2-0.4% (w/v)離析酶，0.4M甘露醇，20mM氯化鉀，20mM—水嗎啉こ磺酸，IOmM CaCl2氯化鈣，5mMP -巰基こ醇。
[0019]離析酶用于將葉肉組織離析為單細胞，纖維素酶用于降解細胞壁，(6-巰基こ醇用于防止氧對原生質(zhì)體的損傷，其他物質(zhì)作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，維持原生質(zhì)體內(nèi)滲透壓平衡，防止原生質(zhì)體破裂。
[0020]裂解后經(jīng)過濾除去葉肉組織，獲得粗提的原生質(zhì)體并對其進行離心清洗。離心清洗的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為80~100g，時間優(yōu)選為8~12min，溫度優(yōu)選為4~10°C ;離心清洗可視情況重復I~2次，低速低溫的離心條件有利于使原生質(zhì)體膜保持完整。[0021]離心清洗步驟應在原生質(zhì)體保護液中進行，該原生質(zhì)體保護液可采用以下成分配制:150~155mM氯化鈉，120~125mM氯化鈣，4~6mM氯化鉀，I~2mM —水嗎啉こ磺酸。
[0022](2)液泡粗提:采用原生質(zhì)體裂解液裂解原生質(zhì)體，離心后獲得粗提的液泡，所述離心的轉(zhuǎn)速為300~600g,時間為5~8min。
[0023]原生質(zhì)體裂解時間優(yōu)選為30~60min,更優(yōu)選為30min。
[0024]所述原生質(zhì)體裂解液優(yōu)選為由以下成分組成的水溶液:0.45~0.46M甘露醇，
0.45~0.46mM乙二醇雙(2-氨基乙基醚四こ酸)，0.90~0.91mM3_[ (3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸和18.18~18.19mM—水嗎啉こ磺酸，113.60~113.70mM氯化鈣，
4.50~4.60mM氯化鉀；pH為8.0 ;更優(yōu)選為:0.455M甘露醇，0.455mM乙二醇雙(2-氨基こ基醚四こ酸)，0.909mM3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1_丙磺酸和18.182mM—水嗎啉こ磺酸，113.64mM氯化鈣，4.505mM氯化鉀；pH為8.0。
[0025]3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸用作表面活性劑以使原生質(zhì)體破裂，乙二醇雙(2-氨基乙基醚四こ酸)用作與鈣離子螯合，保持液泡內(nèi)鈣離子濃度在合適水平，其他物質(zhì)用于維持液泡的滲透壓平衡，防止液泡破裂。
[0026]作為優(yōu)選，所述離心的轉(zhuǎn)速為500~600g，時間為5~6min。對粗提液泡進行離心時也應在低溫(4~10°C)條件下進行。為獲得純度較高的液泡，在進行液泡純化前可用液泡保護液對粗提液泡進行I~2清洗，所述液泡保護液優(yōu)選為由以下成分組成的水溶液:18~22mM —水嗎啉こ磺酸，0.6~1.0M甘露醇，113.60~113.70mM氯化鈣，4.50~
4.60mM氯化鉀；pH8.0 ;更優(yōu)選為由以下成分組成的水溶液:20mM—水嗎啉こ磺酸，0.8M甘露醇，113.64mM氯化鈣，4.55mM氯化鉀；pH8.0。
[0027](3)液泡純化:將粗提的液泡重懸于質(zhì)量體積比濃度為0~5%的密度梯度介質(zhì)溶液中，往該重懸液下層加入質(zhì)量體積比濃度為7~10%的密度梯度介質(zhì)溶液，進行密度梯度離心，獲取純化的液泡。
[0028]在上述濃度范圍內(nèi)，上層密度梯度介質(zhì)溶液與下層密度梯度介質(zhì)溶液中密度梯度介質(zhì)的質(zhì)量體積比濃度差相差越大，對液泡的純化效果越好，優(yōu)選上層密度梯度介質(zhì)溶液不含密度梯度介質(zhì)，而下層密度梯度介質(zhì)溶液含10%的密度梯度介質(zhì)。
[0029]上層密度梯 度介質(zhì)溶液與下層密度梯度介質(zhì)溶液的體積比沒有要求，只要兩層分界面清晰可見即可。
[0030]本發(fā)明中，所述密度梯度介質(zhì)溶液為溶解有密度梯度介質(zhì)的液泡保護液，所述液泡保護液的成分同上所述。
[0031]所述密度梯度介質(zhì)可選用聚蔗糖、氯化銫或蔗糖。
[0032]優(yōu)選地，所述密度梯度離心的轉(zhuǎn)速為800~1500g，時間為5~45min ;更優(yōu)選地，所述密度梯度離心的轉(zhuǎn)速為1000~1500g，時間為10~30min。一般IOmin左右即可，離心效果欠佳時，可適當延長離心時間。
[0033]若無特殊說明，本發(fā)明中各溶液均采用超純水配制。
[0034]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:
[0035]本發(fā)明在進行液泡純化時，先在離心管中利用濃度較小的密度梯度介質(zhì)溶液重懸粗提液泡，再沿著離心管壁往離心管底部慢慢加入濃度較大的密度梯度介質(zhì)溶液，此時離心管中溶液分為兩層，然后再進行密度梯度離心，由此獲得的液泡膜完整性好，液泡數(shù)量多，純度高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1為東南景天葉片經(jīng)細胞裂解液處理后的狀態(tài)圖；
[0037]圖2為提取的原生質(zhì)體形態(tài)圖；
[0038]圖3為原生質(zhì)體中液泡被染色的形態(tài)圖；
[0039]圖4為粗提液泡的形態(tài)圖；
[0040]圖5為實施例1液泡純化結果圖；
[0041]圖6為實施例2液泡純化結果圖；
[0042]圖7為實施例3液泡純化結果圖；
[0043]圖8為實施例4液泡純化結果圖；
[0044]圖9為實施例5 液泡純化結果圖；
[0045]圖10為實施例6利用文獻記載的原生質(zhì)體裂解液裂解原生質(zhì)體的結果圖；
[0046]圖11為實施例6利用文獻記載的原生質(zhì)體裂解液的6/5倍稀釋液裂解原生質(zhì)體的結果圖；
[0047]圖12為實施例7利用含2/3倍CHAPS的濃度的原生質(zhì)體裂解液裂解原生質(zhì)體的結果圖；
[0048]圖13為實施例1利用含4/3倍CHAPS的濃度的原生質(zhì)體裂解液液裂解原生質(zhì)體的結果圖。
【具體實施方式】
[0049]實施例1
[0050]I溶液配制
[0051](I)細胞裂解液:15g纖維素酶，4g離析酶，72.88g甘露醇，1.49g氯化鉀，4.264g一水嗎啉こ磺酸，1.1lg氯化鈣，0.39065g@-巰基こ醇，溶于超純水中并定容至IL ；
[0052](2)原生質(zhì)體保護液:0.1543g氯化鈉，13.875g氯化鈣，0.373g氯化鉀，0.426g 一水嗎啉こ磺酸，溶于超純水中并定容至IL ；
[0053](3)原生質(zhì)體裂解液:0.083g甘露醇，0.173g乙二醇雙2_氨基乙基醚(EGTA)，
0.559g3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS )，3.876g—水嗎啉こ磺酸，12.614g氯化鈣，0.339g氯化鉀，溶于950mL超純水中，用2M的Tris溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，再定容至IL ；；
[0054](4)液泡保護液:4.264g 一水嗎啉こ磺酸，145.76g甘露醇，12.614g氯化鈣，
0.339g氯化鉀，溶于950mL超純水中，用2M的Tris溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，再定容至IL ;；
[0055](5)10%聚蔗糖溶液:10(^聚蔗糖-400，4.264g—水嗎啉こ磺酸，145.76g甘露醇，12.614g氯化鈣，0.339g氯化鉀，溶于950mL超純水中，用2M的Tris溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，再定容至IL ；；
[0056](6)中性紅溶液:0.1g中性紅，200 ii L 1%的こ酸，50 ii L的氯仿，超純水定容至
IOOmL，4 °C避光保存。
[0057]2液泡提取[0058](I)樣品準備
[0059]取幼嫩的東南景天葉片4g，用鑷子撕去其上表皮或者下表皮，用薄刀片以與葉脈垂直的方向?qū)⑵淝谐蓪挾葹镮~2mm的細條狀，備用。
[0060](2)原生質(zhì)體提取
[0061]①取30mL細胞裂解液于50mL離心管中，50°C預熱lOmin，轉(zhuǎn)移至250mL可抽真空長頸瓶中冷卻；
[0062]②將切好的細條狀葉片浸入冷卻至室溫(25°C)的細胞裂解液中，抽濾IOmin后放置于恒溫震蕩箱(28-30°C)左右，45-65r/min震蕩2_2.5h ；
[0063]③待細條狀葉片基本呈白色透明漂浮在液面上時(圖1)，用150目過濾膜將原生質(zhì)體過濾到50mL離心管中，并用5mL原生質(zhì)體緩沖液清洗長頸瓶和濾膜兩次；
[0064]④將裝有原生質(zhì)體的離心管置于離心機(型號:beCkman j2_hs)中離心，轉(zhuǎn)速80g，溫度10°C,時間IOmin,棄上清；
[0065]⑤取30mL原生質(zhì)體保護液重懸浮沉淀后再次離心，轉(zhuǎn)速80g，溫度10°C，時間lOmin，棄上清；所得沉淀即為濃度較高的原生質(zhì)體(圖2)。
[0066](3)液泡粗提
[0067]①取15mL原生質(zhì)體裂解液重懸浮步驟(2)得到的原生質(zhì)體，加入75 U L中性紅溶液，輕微顛倒混勻3min, 對液泡進行染色(圖3)；
[0068]②染色完成后靜置離心管，使原生質(zhì)體裂解30min，期間用5mL移液器反復吹打液面5~8次；
[0069]③將離心管置于離心機(型號:Thermo-S00264)離心，選擇慢啟動慢減速的3檔或4檔，轉(zhuǎn)速600g，時間5min，溫度I (TC，棄上清；
[0070]④取15mL液泡保護液重懸浮沉淀再次離心,選擇慢啟動慢減速的3檔或4檔,轉(zhuǎn)速600g，時間5min，溫度10°C，棄上清；所得沉淀即為粗提的液泡(圖4)。
[0071]由圖3可見原生質(zhì)體內(nèi)的液泡被中性紅染成紅色，紅色液泡外圍包裹葉綠體；由圖4可見，經(jīng)離心后大部分原生質(zhì)體已裂解，可見邊緣透明的紅色液泡，有一部分破裂的原生質(zhì)體膜仍粘附在液泡表面。
[0072](4)液泡純化
[0073]①取IOmL液泡保護液重懸浮粗提的液泡,沿著離心管壁往底部慢慢加入10%聚鹿糖溶液2mL，這時離心管內(nèi)形成了 2個分層；
[0074]②將離心管置于離心機(型號:Thermo_S00264)中，進行密度梯度離心，轉(zhuǎn)速1500g，時間lOmin，溫度10°C ;在重懸液與10%聚蔗糖溶液中間形成一粉紅色層，取粉紅色層液體鏡檢(圖5)。
[0075]由圖5可見，視野中僅見邊緣透明的紅色液泡，未見原生質(zhì)體和其他雜質(zhì)。
[0076]實施例2
[0077]利用與實施例1相同的方法和試劑進行液泡提取，但純化液泡時在離心管底部加7%聚蔗糖溶液，進行密度梯度離心，取重懸液與7%聚蔗糖溶液中間的過渡層(未形成明顯粉紅色層)液體鏡檢，鏡檢結果見圖6。
[0078]由圖6可見，只有少量邊緣透明的紅色液泡，多數(shù)為原生質(zhì)體或表面粘附有破裂原生質(zhì)體膜的液泡，液泡純化程度不高。[0079]實施例3
[0080]利用與實施例1相同的方法和試劑進行液泡提取，但純化液泡時在離心管底部加4%聚蔗糖溶液，進行密度梯度離心，取重懸液與4%聚蔗糖溶液中間的過渡層(該層極不明顯)液體鏡檢，鏡檢結果見圖7。
[0081]圖7中只見生質(zhì)體或表面粘附有破裂原生質(zhì)體膜的液泡，未見邊緣透明的紅色液泡。
[0082]實施例4
[0083]利用與實施例1相同的方法和試劑進行液泡提取，但純化液泡時，采用又 獻(Ma，J.F.，et al., Subcellular localisation of Cd and Zn in the丄eaves of a Cd-hyperaccumulating ecotype of Thlaspi caerulescens.Planta, 2005.220(5):731-736)中記載的，用2mL10%聚蔗糖溶液重懸浮粗提的液泡，再在重懸液上層加IOmL液泡保護液，然后進行密度梯度離心。對出現(xiàn)在重懸液和液泡保護液之間的粉紅色層(該層不明顯)液體鏡 檢，鏡檢結果見圖8。
[0084]圖8中可見少數(shù)原生質(zhì)體，大部分為表面粘附有破裂原生質(zhì)體膜的液泡，未見邊緣透明的紅色液泡。
[0085]實施例5
[0086]利用與實施例1相同的方法和試劑進行液泡提取，但純化液泡時，先在離心管中加2mL10%聚蔗糖溶液，再取IOmL用液泡保護液重懸浮的粗提液泡，加到10%聚蔗糖溶液上層，然后進行密度梯度離心。對出現(xiàn)在重懸液和液泡保護液之間的粉紅色層液體鏡檢，鏡檢結果見圖9。
[0087]圖9中可見少數(shù)原生質(zhì)體，大部分為表面粘附有破裂原生質(zhì)體膜的液泡，未見邊緣透明的紅色液泡。
[0088]實施例6
[0089]利用與實施例1相同的方法和試劑進行液泡提取，但粗提液泡吋，采用又 獻(Ma，J.F.，et al., Subcellular localisation of Cd and Zn in the丄eaves of a Cd-hyperaccumulating ecotype of Thlaspi caerulescens.Planta, 2005.220(5):731-736)中記載的原生質(zhì)體裂解液(配方為:0.5M甘露醇，ImMこ二醇雙2-氨基乙基醚，0.5mM3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]_1_丙磺酸，20mM 一水嗎啉こ磺酸，pH8.0)、該原生質(zhì)體裂解液的6/5倍稀釋液對原生質(zhì)體進行裂解，對獲得的粗提液泡進行鏡檢，鏡檢結果見圖10、圖11。
[0090]由圖10可見，利用文獻記載的原生質(zhì)體裂解液裂解原生質(zhì)體獲得的粗提液泡，液泡膜有皺縮，說明還該原生質(zhì)體裂解液濃度過大。
[0091]由圖11可見，利用文獻記載的原生質(zhì)體裂解液的6/5倍稀釋液裂解原生質(zhì)體獲得的粗提液泡，其數(shù)量較少，說明裂解程度不夠。
[0092]實施例1中原生質(zhì)體裂解液相當于文獻記載配方的11/10倍稀釋液，裂解程度適宜，且液泡不會產(chǎn)生皺縮。
[0093]實施例7
[0094]利用與實施例1相同的方法和試劑進行液泡提取，但粗提液泡時，采用的原生質(zhì)體裂解液中CHAPS的濃度分別是實施例1原生質(zhì)體裂解液的2/3倍和4/3倍，對獲得的粗提液泡進行鏡檢，鏡檢結果見圖12、圖13。
[0095]由圖12可見，利用含2/3倍CHAPS的濃度的原生質(zhì)體裂解液對原生質(zhì)體的裂解效果不佳，多數(shù)原生質(zhì)體未裂解。
[0096]由圖13可見，利用含4/3倍CHAPS的濃度的原生質(zhì)體裂解液對原生質(zhì)體的裂解作用太強，原生質(zhì)體基本破裂，液泡也破碎了很多。
【權利要求】
1.一種提取景天科植物細胞液泡的方法，包括原生質(zhì)體提取、液泡粗提和液泡純化，其特征在于，所述液泡純化包括: 將粗提的液泡重懸于質(zhì)量體積比濃度為O~5%的密度梯度介質(zhì)溶液中，得到重懸液；往該重懸液下層加入質(zhì)量體積比濃度為7~10%的密度梯度介質(zhì)溶液，進行密度梯度離心，獲取純化的液泡。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在干，將粗提的液泡重懸于質(zhì)量體積比濃度為0%的密度梯度介質(zhì)溶液中，往該重懸液下層加入質(zhì)量體積比濃度為10%的密度梯度介質(zhì)溶液，進行密度梯度離心。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述密度梯度介質(zhì)溶液為溶解有密度梯度介質(zhì)的液泡保護液，所述液泡保護液為由以下成分組成的水溶液:18~22mM—水嗎啉こ磺酸，0.6 ~1.0M 甘露醇，113.60 ~113.70mM 氯化鈣，4.50 ~4.60mM 氯化鉀；pH8.0。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在干，所述密度梯度介質(zhì)為聚蔗糖，氯化銫或蔗糖。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述密度梯度離心的轉(zhuǎn)速為800~1500g，時間為5~45min。
6.如權利要求1~5任一所述的方法，其特征在于，采用原生質(zhì)體裂解液裂解原生質(zhì)體,離心后獲得粗提的液泡,所述離心的轉(zhuǎn)速為300~600g,時間為5~8min。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述原生質(zhì)體裂解液為由以下成分組成的水溶液:0.45~0.46M甘露醇 ，0.45~0.46mM乙二醇雙(2-氨基乙基醚四こ酸)，0.90~0.91mM3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸和18.18~18.19mM—水嗎啉こ磺酸，113.60 ~113.70mM 氯化鈣，4.50 ~4.60mM 氯化鉀;pH 為 8.0。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，原生質(zhì)體裂解時間為30~60min。
【文檔編號】C12N5/04GK103589678SQ201310532489
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權日:2013年10月31日
【發(fā)明者】盧玲麗, 廖星程, 田生科, 謝若瀚, 韋燕燕 申請人:浙江大學