一種番石榴降糖活性組分、制備方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種番石榴降糖活性組分、制備方法及其用途，是將番石榴葉原料粉碎、8-10倍體積50％乙醇回流提取，60℃以下減壓濃縮，所得乙醇提取物分散于水中，石油醚萃取后采用乙酸乙酯充分萃取，在60℃以下減壓濃縮，所得乙酸乙酯萃取物過60-200目聚酰胺層析柱，乙醇水溶液由低到高梯度洗脫，收集用30％-50％濃度乙醇洗脫的組分，60℃以下減壓濃縮后繼續(xù)過60-200目聚酰胺層析，10％乙醇洗脫后，30％乙醇等度洗脫，洗脫液在60℃以下減壓濃縮、70％乙醇溶劑重結(jié)晶即得降糖活性組分。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，有效部分化學(xué)成分組成清楚、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定性好。本發(fā)明產(chǎn)品能夠顯著降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的高血糖，可用于制備降血糖藥物或保健品。
【專利說明】—種番石榴降糖活性組分、制備方法及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種降血糖保健品領(lǐng)域，特別是一種番石榴降糖活性組分、制備方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]2型糖尿病是多種致病因子作用于機(jī)體導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗等引發(fā)的一系列代謝紊亂綜合征。世界衛(wèi)生組織指出，世界范圍內(nèi)的糖尿病形勢(shì)仍然非常嚴(yán)峻，而發(fā)展中國(guó)家的形勢(shì)尤其令人擔(dān)憂。
[0003]石榴葉作為民間用藥用來預(yù)防和治療糖尿病已有悠久的歷史，有大量的關(guān)于番石榴葉在2型糖尿病病人疾病防治過程的文獻(xiàn)報(bào)道，且大量的臨床試驗(yàn)證明其療效確切，因此國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)其降糖效果展開了大量的研究，但到目前為止，番石榴葉中降血糖活性成分和作用機(jī)制尚未得到確切證實(shí)。中國(guó)專利申請(qǐng)公開的“一種具有降血糖功效的藥物組合物或保健品”(201210505096.8)，提供了一種由苦瓜提取物、橄欖提取物、肉桂提取物、番石榴提取物、苦蕎麥提取物、蝦青素、葉黃素、酵母鉻、木糖醇組成的降血糖藥物，但其并未說明其中的番石榴提取物的提取方法和具體成分。番石榴葉資源在我國(guó)非常豐富，如果對(duì)番石榴葉進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，確定其降糖作用物質(zhì)基礎(chǔ)、鑒定其降糖單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)、明析其作用機(jī)理，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出防治2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的降糖藥物或功能食品，不僅可以充分利用番石榴葉資源，而且還可以減少糖尿病人的痛苦、創(chuàng)造出較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種從番石榴葉提取的降糖活性組分，可有效用于制備降糖藥物或功能食品，用于2型糖尿病病人的防治，為高血糖患者提供健康。本發(fā)明還提供一種番石榴降糖活性組分的制備方法以及該番石榴降糖活性組分在制備降糖藥物和保健品方面的用途。
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的實(shí)施方案為:一種番石榴葉降糖活性組分，由包括以下步驟的方法制備而成:
[0006](I)將番石榴葉原料、粉碎，8-10倍體積50%乙醇回流提取2次，提取液60°C以下減壓濃縮得乙醇提取物；
[0007](2)乙醇提取物分散于水中，石油醚萃取后采用乙酸乙酯充分萃取，合并乙酸乙酯萃取液，60°C以下減壓濃縮得乙酸乙酯萃取物；
[0008](3)乙酸乙酯萃取物過60-200目聚酰胺層析柱，用濃度為O % -95%的乙醇水溶液由低到高梯度洗脫，收集用30% -50%濃度乙醇洗脫的組分，60°C以下減壓濃縮后繼續(xù)過60-200目聚酰胺層析，10%乙醇洗脫后，30%乙醇等度洗脫，收集洗脫液，600C以下減壓濃縮、70%乙醇溶劑重結(jié)晶即得降糖活性組分。
[0009]步驟(3)中，聚酰胺層析柱層析時(shí)，萃取物和吸附劑重量比為1: 10~1:30。乙醇梯度洗脫時(shí)，乙醇濃度依次為:0 %、10 %、30 %、50 %、70 %、95 %。
[0010]經(jīng)分析測(cè)定并確定該降糖組分含有五種黃酮單體化合物，分別為金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3-0-β -D-吡喃木糖苷、番石榴苷、廣寄生苷。五種單體含量之和50%~95%，番石榴苷和廣寄生苷含量之和25%~75%。
[0011]本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，有效部分化學(xué)成分組成清楚，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定性好，開辟了番石榴葉降糖功能應(yīng)用的新局面，是功能食品領(lǐng)域的一個(gè)創(chuàng)新。經(jīng)整體降糖動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明產(chǎn)品能夠顯著降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的高血糖，可用于制備降血糖藥物或保健品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為番石榴葉粗體物脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量比較(注:*ρ〈0.01，#p<0.05vs 對(duì)照組)；
[0013]圖2為番石榴葉粗體物脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量比較(注:*p〈0.01，#p<0.05vs 對(duì)照組)；
[0014]圖3為柱層析I各組分脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量比較(注:*p〈0.01，#p<0.05vs 對(duì)照組)；
[0015]圖4為Cl-D色譜分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下結(jié)合實(shí)際情況，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0017]實(shí)施例1:
[0018]稱取9月份番石榴葉原料1.2kg，10L50%乙醇回流提取2次，每次I小時(shí)，提取液60°C以下減壓濃縮得乙醇提取物；乙醇提取物分散于水中，石油醚萃取至溶液顏色變淺時(shí)，換成乙酸乙酯萃取6次，至最后一次萃取液顏色很淺后即可，合并濃縮萃取液得乙酸乙酯萃取物35.6g，萃取物過100目聚酰胺柱400g，水洗、10%乙醇各洗脫4倍柱體積，50%乙醇洗脫8倍柱體積，濃縮得10.3g固體，再過200目聚酰胺柱，10%乙醇洗脫3倍柱體積，后30%乙醇等度洗脫10倍柱體積，濃縮，70%乙醇結(jié)晶得降糖活性組分4.97g，液相測(cè)定計(jì)算含有廣寄生苷1.19g，番石榴苷1.03g,槲皮素-3-0- β -D-吡喃木糖苷0.57g，異槲皮苷
0.19g，金絲桃苷0.45g。
[0019]實(shí)施例2:
[0020]稱取10月份番石榴葉原料20kg，200L50%乙醇回流提取2次，每次2小時(shí)，提取液60°C以下減壓濃縮得乙醇提取物；乙醇提取物分散于水中，石油醚萃取至溶液顏色變淺時(shí)，換成乙酸乙酯萃取10次，至最后一次萃取液顏色很淺后即可，合并濃縮萃取液得乙酸乙酯萃取物519.2g，萃取物過80目聚酰胺柱，水洗、10%乙醇充分洗脫，50%乙醇洗脫10倍柱體積，濃縮得177.8g固體，再過100目聚酰胺柱，10%乙醇洗脫6倍柱體積，后30%乙醇等度洗脫，濃縮，70%乙醇結(jié)晶得降糖活性組分103.54g，液相測(cè)定計(jì)算含有廣寄生苷19.72g，番石榴苷23.49g，槲皮素-3-0- β -D-吡喃木糖苷4.56g，異槲皮苷1.38g，金絲桃苷6.95g。
[0021]為闡明、驗(yàn)證本發(fā)明降低高血糖的效果，特作了以下降糖實(shí)驗(yàn)。
[0022]1.葡萄糖消耗降糖脂肪細(xì)胞模型的建立
[0023]雄性SD大鼠斷頸處死，無菌開腹，取附睪外層白色脂肪組織，剔除附帶血管，剪碎至約Imm3大小，加I型膠原酶消化lh，收集上層脂肪細(xì)胞，加入適量Hanks緩沖液洗滌細(xì)胞三次即得原代脂肪細(xì)胞。96孔板中建立200 μ L反應(yīng)體系:濃度為2X IO6ceIlsAiL細(xì)胞懸液100 μ L+30 μ L6mg/mL葡萄糖+30 μ L胎牛血清+40 μ L樣品溶液(包括各萃取物或各柱層析洗脫組分)，以飽和濕度、37°C、5% CO2培養(yǎng)反應(yīng)30min，每孔再加入I μ L2mmol/L腎上腺素溶液，再以同樣條件培養(yǎng)3h，冰浴終止反應(yīng)。采用微量葡萄糖氧化酶法顯色，酶標(biāo)儀上讀數(shù)，測(cè)定并計(jì)算各孔葡萄糖濃度，并和對(duì)照組比較計(jì)算各組葡萄糖的消耗濃度，由此評(píng)價(jià)各萃取物或各柱層析組分的攝取葡萄糖能力，具體計(jì)算公式如下:
[0024]glucose-uptake Ievel=Cctrl-Ccmipmmd (mmol/L)
[0025] 其中，Cctrl為對(duì)照組葡萄糖的濃度，Cramp_d為樣品或分離得到的有效成分經(jīng)過3小時(shí)培養(yǎng)后殘留培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度。在此模型中，用0.1% DMSO Hanks緩沖液做空白對(duì)照組，胰島素做陽性對(duì)照。
[0026]2.番石榴葉粗提物活性結(jié)果與分析
[0027]建立細(xì)胞模型，分別檢測(cè)粗提物WE(水提取物)、50AE(50%乙醇提取物)、85AE(85%乙醇提取物)、EAE(乙酸乙酯提取物)、PE (石油醚提取物)五個(gè)組分在濃度為
1.6mg/mL、l.2mg/mL、和0.8mg/mL下,對(duì)脂肪細(xì)胞葡萄糖代謝的影響，結(jié)果見圖1。
[0028]圖1顯示，不同組分對(duì)脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量有一定的影響。隨著胰島素濃度的增加，培養(yǎng)液中葡萄糖含量逐漸減少，表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。在5個(gè)樣品組分中，對(duì)比對(duì)照組，50AE能顯著降低細(xì)胞液中葡萄糖含量，培養(yǎng)液中葡萄糖含量最低，并且呈劑量依賴關(guān)系，且當(dāng)50AE濃度在1.6mg/mL時(shí)，降糖效果與8U/mL的胰島素相當(dāng)。整體降糖效果比較排序:50AE>WE>85AE>EAE>PE，從排序觀察可知，當(dāng)極性為50%乙醇時(shí)，其提取物具有最強(qiáng)的降血糖活性，當(dāng)提取液的極性向增大或縮小變化時(shí)，提取物的降血糖活性隨著極性變化而降低，活性表現(xiàn)為極性依賴關(guān)系。
[0029]3.番石榴葉萃取物活性結(jié)果與分析
[0030]50AE樣品采用極性由低到高溶劑系統(tǒng)溶劑萃取分別得石油醚萃取物(PS)、乙酸乙酯萃取物(EAS)。乙酸乙酯萃取后，放出剩余的水溶液和乳化層，減壓濃縮，分別命名為WS和EL。用石油醚提取EAS浸膏，過濾，用少量多次提取的方法直至濾液澄清無色，將濾液合并，減壓濃縮得P-EAS，剩余的濾渣為R-EAS。利用細(xì)胞模型，分別檢測(cè)萃取物EL、WS、R-EAS,P-EAS四個(gè)組分在濃度為1.2mg/mL、和0.8mg/mL和0.6mg/mL下，對(duì)脂肪細(xì)胞葡萄糖代謝的影響，并加50AE組分對(duì)照。結(jié)果見圖2。
[0031]圖2顯示，各萃取組分對(duì)脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量的影響。由于50AE組分為粗提物，成分比萃取物多且復(fù)雜，且其活性顯著表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系，所以設(shè)計(jì)50AE對(duì)照時(shí)，其濃度比萃取物高一個(gè)等級(jí)。在4個(gè)萃取組分中，對(duì)比對(duì)照組，R-EAS能顯著降低細(xì)胞液中葡萄糖含量，培養(yǎng)液中葡萄糖含量最低，并且呈劑量依賴關(guān)系，且當(dāng)R-EAS濃度在1.2mg/mL時(shí)，降糖效果比8U/mL的胰島素和1.6mg/mL的50AE更強(qiáng)。整體降糖效果比較排序:R-EAS>EL>WS>P-EAS。分析各組分萃取液，萃取組分所用的萃取液極性排序是:R-EAS>EL>WS>P-EAS(EL是乳化層，因此極性介于水和乙酸乙酯之間)。從降糖效果和極性排序觀察可知，萃取物的降血糖活性與其極性變化相關(guān)，同樣表現(xiàn)為極性依賴關(guān)系。
[0032]4.柱層析I各組分活性結(jié)果與分析
[0033]R-EAS進(jìn)行聚酰胺柱層析，獲得11個(gè)組分，分別命名為Cl-A—C1_K。利用細(xì)胞模型對(duì)11個(gè)組分在濃度為0.6mg/mL的條件下,進(jìn)行降血糖活性檢測(cè)。并加1.2mg/mL的R-EAS組分作對(duì)照。結(jié)果見圖3。
[0034]圖3顯示各柱層析組分對(duì)脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量的影響。R-EAS組分為萃取物，成分比柱層析后的組分復(fù)雜，非活性物質(zhì)種類豐富且含量高，此外，由于其活性表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系，所以設(shè)計(jì)R-EAS對(duì)照時(shí)，其濃度比萃取物高一倍。在11個(gè)柱層析組分中，對(duì)比對(duì)照組，Cl-C、Cl-D、Cl-E表現(xiàn)出非常強(qiáng)的降血糖活性，能顯著降低細(xì)胞液中葡萄糖含量，培養(yǎng)液中葡萄糖含量以三者最低。從培養(yǎng)液中葡萄糖含量整體觀察分析，11個(gè)組分對(duì)其影響呈拋物線狀，其中以C1-C、C1-D、C1-E為拋物線的谷底，兩邊遞增。在柱層析過程中，洗脫液是按照溶液極性變化進(jìn)行梯度洗脫。因此可初步判斷，經(jīng)過柱層析純化后，活性成分的降血糖活性同樣表現(xiàn)為極性依賴關(guān)系。
[0035]另外在最強(qiáng)降糖組分Cl-C、Cl-D、Cl-E中，以Cl-D的收率高，而C1_C、Cl-E得率較少，液相色譜檢測(cè)分析，三個(gè)最強(qiáng)降糖組分所含化學(xué)成分幾乎完全一致，故合并成一個(gè)組分進(jìn)行后續(xù)分離分析。
[0036]5.“C1-D”的反相液相色譜分析
[0037]將“C1-D”溶于甲醇中，過0.22 μ m微孔濾膜，取5 μ L注入液相色譜，17 %乙腈lmL/min等梯度洗脫，257nm檢測(cè)分析,色譜如下圖4顯示。
[0038]由圖4顯示，降糖最佳組分“C1-D”中共含有5種單體化合物，并采用了制備液相色譜分析分得了全部5種單體化合物，峰1-峰5分別為金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3-0- β -D-吡喃木糖苷、番石榴苷、廣寄生苷。同時(shí)，面積歸一化法顯示,5種單體含量總含量達(dá)90%，番石榴苷含量為28%、廣寄生苷含量33%，番石榴苷和廣寄生苷含量之和達(dá)63%。
[0039]6.制備液相分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定
[0040]采用制備液相分離純化Cl-D中含有的單體化學(xué)成分。色譜條件:流動(dòng)相為32%甲醇-水系統(tǒng)，制備色譜柱為島津Shim-pack ODS型C18柱(250mmX 20mm, 5 μ m),檢測(cè)波長(zhǎng)257，柱溫為室溫，流速為12mL/min。對(duì)分離得到的單體采用核磁共振方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
[0041]6.1峰I—金絲桃苷
[0042]峰I為黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)顯紅色，示其可能為一黃酮類化合物。分析測(cè)定其波譜數(shù)據(jù)如下:
[0043]1H NMR (CD3OD, 6in ppm, J in Hz):6.21 (1H, d, J=L 8，H_6)，6.40 (1H，d, J=L 8，H-8)，7.83 (1H, d, J=2.4，H_2 ' )，6.87 (1H, d, J=8.4，H_5 ' )，7.58 (1H, dd, J=2.4，8.4，H-6' )，5.15(1H，d，J=7.8，H-l" )，3.85 (1H，d，J=2.4，H_4").[0044]13C NMR (CD3OD, 6in ppm): 158.9 (C_2)，135.9 (C_3)，179.6 (C_4)，105.7 (C_4a)，163.0 (C-5)，99.9 (C_6)，166.0 (C_7)，94.8 (C_8) , 158.5 (C_8a) , 122.9 (C_l ')，117.9(C-2 ' ), 145.9(C-3 ' )，149.9(C_4 ' ),116.1 (C-5 ' )，123.0(C_6 ')，105.5(C-1" ).73.2(C-2")，75.l(C-3" )，70.0(C_4" )，77.2(C_5" )，62.0 (C_6").[0045]以上波譜數(shù)據(jù)證明峰I為槲皮素3-0-β -D-半乳糖苷，即金絲桃苷，結(jié)構(gòu)式如下所
/Jn ο
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種番石榴葉降糖活性組分，其特征在于，由包括以下步驟的方法制備而成: (1)將番石榴葉原料、粉碎、8-10倍體積50%乙醇回流提取2次，提取液60°C以下減壓濃縮得乙醇提取物； (2)乙醇提取物分散于水中，石油醚萃取后采用乙酸乙酯充分萃取，合并乙酸乙酯萃取液，60°C以下減壓濃縮得乙酸乙酯萃取物； (3)乙酸乙酯萃取物過60-200目聚酰胺層析柱，用濃度為0%-95%的乙醇水溶液由低到高梯度洗脫，收集用30% -50%濃度乙醇洗脫的組分，60°C以下減壓濃縮后繼續(xù)過60-200目聚酰胺層析，10%乙醇洗脫后，30 %乙醇等度洗脫，收集洗脫液，600C以下減壓濃縮、70%乙醇溶劑重結(jié)晶即得降糖活性組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的番石榴葉降糖活性組分，其特征在于，含有金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3-0-β-D-吡喃木糖苷、番石榴苷、廣寄生苷，上述五種單體含量之和50%~95%，番石榴苷和廣寄生苷含量之和25%~75%。
3.—種如權(quán)利要求1所述的番石榴葉降糖活性組分的制備方法，其特征在于， 由包括以下步驟的方法制備而成: (1)將番石榴葉原料、粉 碎、8-10倍體積50%乙醇回流提取2次，提取液60°C以下減壓濃縮得乙醇提取物； (2)乙醇提取物分散于水中，石油醚萃取后采用乙酸乙酯充分萃取，合并乙酸乙酯萃取液，60°C以下減壓濃縮得乙酸乙酯萃取物； (3)乙酸乙酯萃取物過60-200目聚酰胺層析柱，用濃度為0%-95%的乙醇水溶液由低到高梯度洗脫，收集用30% -50%濃度乙醇洗脫的組分，60°C以下減壓濃縮后繼續(xù)過60-200目聚酰胺層析，10%乙醇洗脫后，30%乙醇等度洗脫，收集洗脫液，60°C以下減壓濃縮、70%乙醇溶劑重結(jié)晶即得降糖活性組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的番石榴葉降糖活性組分的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，聚酰胺層析柱層析時(shí)，萃取物和吸附劑重量比為1:10-1:30。乙醇梯度洗脫時(shí)，乙醇濃度依次為:0%,10%,30%,50%,70%,95% ο
5.如權(quán)利要求1所述的番石榴葉降糖活性組分在制備降糖保健品方面的用途。
6.如權(quán)利要求1所述的番石榴葉降糖活性組分在制備降糖藥品方面的用途。
【文檔編號(hào)】A23L1/30GK103565928SQ201310528407
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月1日
【發(fā)明者】曹庸, 歐陽文, 邵祥輝, 蔡喆俊, 朱曉艾, 陳雪香 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)