利用特異基因鑒定高致病型大麗輪枝菌的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高致病型大麗輪枝菌(Verticillium?dahliae)基因，其中，該基因具有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種鑒定大麗輪枝菌致病型的方法，該方法包括以下步驟：（1）制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本；（2）以步驟（1）中得到的全基因組DNA待測樣本為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在SEQ?ID?No.4所示的核苷酸序列；（3）根據(jù)步驟（2）的檢測結(jié)果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型。本發(fā)明還提供了一種試劑盒。
【專利說明】利用特異基因鑒定高致病型大麗輪枝菌的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)作物病害防治領(lǐng)域，具體地，涉及一種高致病型大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)基因、一種鑒定大麗輪枝菌致病型的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)是一種植物致病真菌,它可以導(dǎo)致植物(尤其是農(nóng)作物如棉花、番茄等)發(fā)生黃萎病。但是，不同致病型的大麗輪枝菌菌株的致病表現(xiàn)差別很大，例如某些高致病型的菌株感染棉花后會(huì)導(dǎo)致棉花產(chǎn)生嚴(yán)重病害而引起棉花產(chǎn)量下降，而某些低致病型的菌株感染棉花后僅導(dǎo)致棉花的輕微病害且對(duì)棉花產(chǎn)量影響較小。此外，大麗輪枝菌還表現(xiàn)出一定的潛伏性，即高致病型菌株在感染當(dāng)年可能不致病，而在次年大范圍地嚴(yán)重致病。
[0003]如果能夠檢測出農(nóng)田中大麗輪枝菌的主要菌株類型，并對(duì)其致病型作出準(zhǔn)確的判
斷，就可以結(jié)合藥物防治和輪作等農(nóng)業(yè)手段抑制病害的發(fā)生，從而增加經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是解決如何準(zhǔn)確判斷大麗輪枝菌菌株的致病型的技術(shù)問題，提供一種高致病型大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)基因、一種鑒定大麗輪枝菌致病型的方法和試劑盒。
[0005]SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列為本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在高致病型的大麗輪枝菌菌株的基因組序列中出現(xiàn)而在低致病型的大麗輪枝菌的基因組序列中不出現(xiàn)的序列。因而，對(duì)于某一致病型待測的大麗輪枝菌菌株，只要鑒定該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中是否存在SEQ ID NO:1所示的序列，即可獲知該大麗輪枝菌菌株是否為高致病型大麗輪枝菌。具體地，如果鑒定出該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列，則判斷該大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型；如果鑒定出該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中存在SEQ ID NO:1所示的序列，則判斷該大麗輪枝菌菌株屬于高致病型。并且，如果以該大麗輪枝菌菌株的全基因組DNA待測樣本為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物中不存在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，就能夠充分證明該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ IDNO:1所示的序列。由此，本發(fā)明的發(fā)明人得到了本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種高致病型大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)基因，其中，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
[0007]另一方面，本發(fā)明還提供了一種鑒定大麗輪枝菌致病型的方法，該方法包括以下步驟:
[0008](I)制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本；
[0009](2)以步驟(1)中得到的全基因組DNA待測樣本為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列；[0010](3)根據(jù)步驟(2)的檢測結(jié)果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型，在所述擴(kuò)增產(chǎn)物中不存在SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的情況下，則指示所述大麗輪枝菌的菌株不屬于高致病型；在所述擴(kuò)增產(chǎn)物中存在具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的情況下，則指示該大麗輪枝菌的菌株屬于高致病型。
[0011] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒含有本發(fā)明提供的引物和PCR試劑。
[0012]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實(shí)施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0014]本發(fā)明提供一種高致病型大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)基因,其中，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列核酸。
[0015]本發(fā)明還提供了一種鑒定大麗輪枝菌致病型的方法，該方法包括以下步驟:
[0016]( I)制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本；
[0017](2)以步驟(1)中得到的全基因組DNA待測樣本為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列；
[0018](3)根據(jù)步驟(2)的檢測結(jié)果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型，在所述擴(kuò)增產(chǎn)物中不存在SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的情況下，則指示所述大麗輪枝菌的菌株不屬于高致病型；在所述擴(kuò)增產(chǎn)物中存在具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的情況下，則指示該大麗輪枝菌的菌株屬于高致病型。
[0019]其中，SEQ ID NO:4所示的核酸是SEQ ID NO:1所示的核酸的一個(gè)片段，它能夠通過上述引物對(duì)以SEQ ID NO:1所示的核酸為模板而PCR擴(kuò)增得到。
[0020]其中，制備待測樣本的步驟可以按照本領(lǐng)域常規(guī)的制備用于檢測核酸的樣本的方法進(jìn)行，本發(fā)明沒有特別的要求，例如可以從棉花植株上采集組織，并且將采集的組織在含有抗性的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并且篩選、辨別和分離大麗輪枝菌的菌落，然后按照(《植物基因工程》(何光源著，科學(xué)出版社，2007年出版))中所述的方法提取大麗輪枝菌的基因組DNA，即可制備得到待測樣本。
[0021]其中，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的方法可以按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，例如可以通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，如果需要還可以通過對(duì)電泳得到的目的條帶進(jìn)行回收測序來進(jìn)一步判斷。
[0022]所述擴(kuò)增中用到的引物可以根據(jù)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列的特征及引物設(shè)計(jì)的規(guī)則來設(shè)計(jì)，優(yōu)選情況下，所述引物包括如SEQ ID NO:
2(F:5’CTGACGACTATAGTCCTCCTGG3’)所示的正向引物和如 SEQ ID NO:3 (R:5’ CTTGATAGCAGCGGTAAGATTC3’ )所示的反向引物。
[0023]另一方面，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒含有引物和PCR試劑，其中，所述引物包括如SEQ ID NO:2(F:5’ CTGACGACTATAGTCCTCCTGG3’)所示的正向引物和如SEQID NO:3 (R:5’ CTTGATAGCAGCGGTAAGATTC3’ )所示的反向引物。
[0024]以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中，各種大麗輪枝菌的菌株屬于經(jīng)過合法渠道獲得的遺傳資源。
[0025]實(shí)施例1
[0026]本實(shí)施例用于說明待測樣本的制備。具體地，是從80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株(編號(hào)為VDGl至VDG80)的基因組DNA的制備。
[0027]切取棉花植株離地表約10_35cm處的莖，切成Imm3左右大小的小塊，接種在在含有抗生素(氨芐青霉素、利福平和鏈霉素，濃度均為lOOyg/ml)的PDA培養(yǎng)基(含有馬鈴薯200g/L,葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L)上，25°C下培養(yǎng)7天，根據(jù)大麗輪枝菌的標(biāo)準(zhǔn)菌落形態(tài)鑒別大麗輪枝菌的菌落。得到鑒別的大麗輪枝菌的菌落即作為大麗輪枝菌菌株樣品。 [0028]按照上述方法，從80個(gè)不同的棉花植株中取得80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株，將上述80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株按照《植物基因工程》(何光源著，科學(xué)出版社，2007年出版)中所述的方法，分別提取基因組DNA樣本，得到待測樣本1-80。
[0029]實(shí)施例2
[0030]本實(shí)施例用于說明上述80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株的致病型的檢測結(jié)果。
[0031]參照文獻(xiàn)(張興華，棉花抗枯、黃萎病研究進(jìn)展及其抗性鑒定方法，江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，20(3):43-49)中的人工苗床病圃法，對(duì)實(shí)施例1中所述的80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株進(jìn)行棉花苗期致病型鑒定。以所述的80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株在接種健康棉花植株后的病情指數(shù)來表征致病型的高低。
[0032]具體地，將大麗輪枝菌在查比克培養(yǎng)基(2g/L的NaNO3, lg/L的K2HPO4,0.5g/L的KCl, 0.5g/L的MgSO4,0.0 lg/L的FeSO4, 30g/L的蔗糖，20g/L的瓊脂)上培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子，用無菌水洗下孢子得到孢子懸液，并將孢子懸液中的孢子濃度調(diào)整至2 X IO6個(gè)/ml。然后，在同一品種的棉花15日齡幼苗的下胚軸處，使用Iml規(guī)格的無菌注射器接種上述孢子懸液，每株接種量為ΙΟΟμ 1，接種后每周統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，計(jì)算第四周的病情指數(shù)。
[0033]本實(shí)施例檢測得到了上述80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株的致病型，通過上述鑒別標(biāo)準(zhǔn)，鑒定出其中61個(gè)大麗輪枝菌菌株的病情指數(shù)均高于35，屬于高致病型，而另外19個(gè)大麗輪枝菌菌株的病情指數(shù)均低于20，不屬于高致病型。
[0034]上述61個(gè)屬于高致病型的大麗輪枝菌菌株分別為:VDG3、VDG63、VDG61、VDG18、VDG35、VDG32、VDG73、VDG31、VDG33、VDG26、VDG55、VDG23、VDG57、VDG36、VDGl1、VDG67、VDG47、VDG5、VDG29、VDG59、VDG49、VDG44、VDG21、VDG48、VDG8、VDG50、VDG25、VDG43、VDG37、VDG46、VDG16、VDG4、VDG68、VDG6、VDG52、VDG34、VDG7、VDG45、VDG12、VDG76、VDG27、VDG10、VDG41、VDG64、VDG17、VDG54、VDG39、VDG75、VDG20、VDG13、VDG22、VDG38、VDG19、VDG28、VDG14、VDG9、VDG53、VDG15、VDG42、VDG40和VDGl。上述19個(gè)不屬于高致病型的大麗輪枝菌菌株分別為:VDG70、VDG69、VDG71、VDG24、VDG79、VDG65、VDG56、VDG77、VDG74、VDG30、VDG80、VDG60、VDG2、VDG58、VDG66、VDG62、VDG72、VDG80 和 VDG51。
[0035]實(shí)施例3
[0036]按照Illumina公司的測序儀Genome Analyzer的說明書(Solexa技術(shù))中規(guī)定的方法，測定大麗輪枝菌菌株(編號(hào)為VDGl以及VDG2)的全基因組序列。
[0037]本實(shí)施例得到了上述2個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株的全基因組序列，通過序列比對(duì)，鑒定出VDGl的全基因組序列中不含有SEQ ID NO:1所示的序列；而VDG2的全基因組序列中含有SEQ ID NO:1所示的序列。[0038]通過上述相同的方法，鑒定出上述80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株中的61個(gè)(分別為 VDG3、VDG63、VDG61、VDG18、VDG35、VDG32、VDG73、VDG31、VDG33、VDG26、VDG55、VDG23、VDG57、VDG36、VDGl 1、VDG67、VDG47、VDG5、VDG29、VDG59、VDG49、VDG44、VDG21、VDG48、VDG8、VDG50、VDG25、VDG43、VDG37、VDG46、VDG16、VDG4、VDG68、VDG6、VDG52、VDG34、VDG7、VDG45、VDG12、VDG76、VDG27、VDG10、VDG41、VDG64、VDG17、VDG54、VDG39、VDG75、VDG20、VDG13、VDG22、VDG38、VDG19、VDG28、VDG14、VDG9、VDG53、VDG15、VDG42、VDG40 和 VDG1)的基因組的序列中均含有SEQ ID NO:1所示的序列；并且，另外的19個(gè)大麗輪枝菌菌株(分別為VDG70、VDG69、VDG71、VDG24、VDG79、VDG65、VDG56、VDG77、VDG74、VDG30、VDG80、VDG60、VDG2、VDG58、VDG66、VDG62、VDG72、VDG80和VDG51)的全基因組序列中不含有SEQ ID NO:1所示的序列。
[0039] 根據(jù)實(shí)施例2和實(shí)施例3的結(jié)果可以確定，如果鑒定出大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中存在SEQ ID NO:1所示的序列，則該大麗輪枝菌菌株屬于高致病型；如果鑒定出大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列，則該大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型。
[0040]實(shí)施例4
[0041]以實(shí)施例1中分別制得的檢測樣本DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物包括如SEQ ID NO:2 (F:5’ CTGACGACTATAGTCCTCCTGG3’ )所示的正向引物和如 SEQ ID NO:3 (R:5’ CTTGATAGCAGCGGTAAGATTC3’ )所示的反向引物。
[0042]具體的擴(kuò)增條件包括:94°C，10分鐘；(94°C，30秒，54°C，45秒，72°C，I分鐘)35個(gè)循環(huán)；72°C，10分鐘，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0043]檢測結(jié)果說明:上述80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株中的61個(gè)(分別為VDG3、VDG63、VDG61、VDG18、VDG35、VDG32、VDG73、VDG31、VDG33、VDG26、VDG55、VDG23、VDG57、VDG36、VDGl 1、VDG67、VDG47、VDG5、VDG29、VDG59、VDG49、VDG44、VDG21、VDG48、VDG8、VDG50、VDG25、VDG43、VDG37、VDG46、VDG16、VDG4、VDG68、VDG6、VDG52、VDG34、VDG7、VDG45、VDG12、VDG76、VDG27、VDG10、VDG41、VDG64、VDG17、VDG54、VDG39、VDG75、VDG20、VDG13、VDG22、VDG38、VDG19、VDG28、VDG14、VDG9、VDG53、VDG15、VDG42、VDG40 和 VDGl)的基因組的序列中均存在SEQ ID NO:4所示的序列；證明這些大麗輪枝菌菌株均存在具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸，據(jù)此判斷這些大麗輪枝菌菌株屬于高致病型。并且，另外的19個(gè)大麗輪枝菌菌株(分別為 VDG70、VDG69、VDG71、VDG24、VDG79、VDG65、VDG56、VDG77、VDG74、VDG30、VDG80、VDG60、VDG2、VDG58、VDG66、VDG62、VDG72、VDG80 和 VDG51)的基因組的序列中不存在所述SEQ ID NO:4所示的序列；證明這些大麗輪枝菌菌株均不存在具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸，據(jù)此判斷這些大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型。
[0044]根據(jù)實(shí)施例2和實(shí)施例4的結(jié)果可以確定，如果鑒定出大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，則該大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型；如果鑒定出大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中存在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，則該大麗輪枝菌菌株屬于高致病型。
【權(quán)利要求】
1.一種高致病型大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)基因,其特征在于,該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
2.一種鑒定大麗輪枝菌致病型的方法，該方法包括以下步驟: (O制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本； (2)以步驟(1)中得到的全基因組DNA待測樣本為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列； (3)根據(jù)步驟(2)的檢測結(jié)果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型，在所述擴(kuò)增產(chǎn)物中不存在SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的情況下，則指示所述大麗輪枝菌的菌株不屬于高致病型；在所述擴(kuò)增產(chǎn)物中存在具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的情況下，則指示該大麗輪枝菌的菌株屬于高致病型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述步驟(2)PCR擴(kuò)增所用的引物包括如SEQIDNO:2所示的正向引物和如SEQ ID NO:3所示的反向引物。
4.一種試劑盒，所·述試劑盒含有根據(jù)權(quán)利要求3中的引物和PCR試劑。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103525831SQ201310524788
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月30日
【發(fā)明者】戴小楓, 陳捷胤, 馬雪峰, 徐 明, 李蕾, 孔志強(qiáng), 包郁明, 肖紅利, 桂月晶 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所