具有戊二?；?7-氨基頭孢烷酸?；负蚫-氨基酸氧化酶活性的重組酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶活性的雙功能重組酶，該重組酶的基因序列與SEQ?ID?NO.2限定的基因序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能的蛋白質(zhì)；重組酶編碼基因的表達(dá)載體基因序列與SEQ?ID?NO.1具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的基因序列。在生產(chǎn)7-ADCA的過(guò)程中，使酶催化劑的表達(dá)生產(chǎn)、分離純化以及去乙酰氧基頭孢菌素C的催化水解工藝都得到簡(jiǎn)化。
【專利說(shuō)明】具有戊二酰基-1-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶活性的重組酶及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有戊二?；?7-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶活性的重組酶及其制備方法和該重組酶在一步法制備7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)是目前廣泛使用的頭孢類抗生素藥物的半合成中間體和原料，在臨床醫(yī)藥的生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價(jià)值。7-ADCA主要有生物催化合成和化學(xué)合成兩種方法得到?；瘜W(xué)合成法是從青霉素G經(jīng)過(guò)氧化、擴(kuò)環(huán)重排和水解幾步反應(yīng)得到，雖然原料價(jià)廉易得，但工藝復(fù)雜，使用大量有毒試劑，不僅導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性較低，成本較高，并且產(chǎn)生大量對(duì)環(huán)境嚴(yán)重危害的廢物。使用生物酶催化合成代替化學(xué)合成生產(chǎn)7-ADCA，具有工藝簡(jiǎn)單、高效、安全無(wú)污染及產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，其研究一直受到產(chǎn)業(yè)界與學(xué)術(shù)界的共同重視。
[0003]目前產(chǎn)業(yè)界使用的成本最低且較為成熟的生物酶法工藝是以發(fā)酵產(chǎn)物去乙酰氧基頭孢菌素C為原料，以D-氨基酸氧化酶(DAO)和戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；?GLA)為催化劑的兩步酶法。在DAO催化下去乙酰氧基頭孢菌素C被氧化脫氨，生成相應(yīng)的alfa-酮基-己二酰-7-AD CA和過(guò)氧化氫，然后在過(guò)氧化氫作用下氧化脫羧生成戊二酰-7-ADCA (GL-7-ADCA)，再經(jīng)GLA催化水解脫戊二?；鶄?cè)鏈生成7-ADCA。該法為當(dāng)前生產(chǎn)7-ADCA的較為實(shí)用的酶催化工藝路線，所使用的兩種生物酶DAO和GLA可以通過(guò)培育不同的菌種經(jīng)生物工程發(fā)酵得到，國(guó)外已經(jīng)通過(guò)適當(dāng)?shù)幕蛑亟M和蛋白質(zhì)工程手段得到較高活性單位的DAO和GAL，并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，國(guó)內(nèi)雖然已經(jīng)有相關(guān)的酶的研究和生產(chǎn)，但僅僅應(yīng)用在7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)的制備上，對(duì)于7-ADCA其仍然面臨著活性較低、穩(wěn)定性較差導(dǎo)致的產(chǎn)品收率較低等問(wèn)題，另外，這種兩步酶法工藝需要對(duì)兩種菌株分別培養(yǎng)和表達(dá)，然后進(jìn)行酶的分離和純化，最后分兩步單元操作進(jìn)行酶催化反應(yīng)，過(guò)程中還需按照不同的條件進(jìn)行控制和監(jiān)測(cè)，所以開(kāi)發(fā)更經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的7-ADCA酶催化合成工藝和相關(guān)酶制劑已經(jīng)成為提高我國(guó)頭孢類藥物中間體生產(chǎn)工藝技術(shù)水平，促進(jìn)抗生素工業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)的現(xiàn)實(shí)需要。
[0004]應(yīng)用分子生物學(xué)菌種培育和基因工程技術(shù)，開(kāi)發(fā)一種可以一步水解脫除去乙酰氧基頭孢菌素c (DAOC)的氨基酸側(cè)鏈的酶，是目前改進(jìn)7-ADCA酶法生產(chǎn)工藝的最佳手段和研發(fā)熱點(diǎn)。用DAOC?；竵?lái)直接催化水解D-alfa-氨基己二酸側(cè)鏈?zhǔn)欠椒ㄖ?，但到目前為止，相關(guān)的DAOC?；赴ń?jīng)過(guò)定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化等各種基因工程手段改進(jìn)的重組酶，其催化水解活力都仍然很低，遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)催化的需要。另一種方法是在同一反應(yīng)器中連續(xù)發(fā)生D-氨基酸氧化反應(yīng)和戊二酰水解反應(yīng)，一鍋法生產(chǎn)7-ADCA。目前在制備7-ACA過(guò)程中，有類似生產(chǎn)工藝的報(bào)道。包括分別加入產(chǎn)生DAO和GLA活性的酶或細(xì)胞進(jìn)行一鍋反應(yīng)，但因兩種酶的最適合條件不一致以及反應(yīng)體系中副產(chǎn)物過(guò)氧化氫的干擾，使酶的活性和穩(wěn)定性降低，并導(dǎo)致轉(zhuǎn)化停滯和中間產(chǎn)物的積累。
[0005]在成功克隆出DAO和GLA兩種酶對(duì)應(yīng)的基因并對(duì)其基因序列充分了解之后，構(gòu)建融合兩種基因序列的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒即可表達(dá)出具有雙酶活性的重組酶，即所謂的融合基因和融合蛋白，它是將兩個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)首尾相連，置于同一套調(diào)控序列控制之下構(gòu)成的嵌合基因，經(jīng)合適的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后，即可獲得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型多功能酶。這種由基因工程手段得到的新酶可以對(duì)兩步甚至多步催化工藝進(jìn)行改進(jìn)，使之變得更為簡(jiǎn)單、高效。而且，只進(jìn)行單次發(fā)酵就可以得到實(shí)現(xiàn)兩種催化作用的DAO和GLA的融合蛋白酶，使用這種雙功能酶也可以使7-ADCA的兩步酶法工藝成功改造為一鍋單步反應(yīng)，使生物酶制備工藝和生物酶催化反應(yīng)工藝實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一步的升級(jí)換代。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供一種具有戊二?；?7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性，且活性和穩(wěn)定性高的重組酶。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一種具有戊二?；?7-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶活性的重組酶，所述的重組酶的編碼基因，其基因序列與SEQ ID N0.2限定的基因序列具有90%以上同源性(包含相同基因序列)，且編碼相同功能的蛋白質(zhì)；
[0008]所述的具有戊二酰基-7- 氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶活性的重組酶編碼基因的表達(dá)載體，該表達(dá)載體的基因序列與SEQ ID N0.1具有90%以上同源性(包含相同基因序列)，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的基因序列。
[0009]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是:提供一種融合D-氨基酸氧化酶(DAO)基因和戊二?；ヒ阴Ｑ躅^孢菌素酰化酶基因的重組基因的重組酶的制備方法。
[0010]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:具有戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；?gla)和D-氨基酸氧化酶(dao)活力的重組酶的制備方法，其步驟為:利用基因工程的手段，將戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；富?acy)和D-氨基酸氧化酶基因(daao)分別置于各自強(qiáng)啟動(dòng)子的調(diào)控之下，構(gòu)建雙基因共表達(dá)質(zhì)粒，該雙基因共表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌并經(jīng)培養(yǎng)，得到同時(shí)表達(dá)具備戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；?gla)和D-氨基酸氧化酶(dao)活力的融合蛋白酶。
[0011]所述的戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；富蛐蛄信cSEQ ID N0.4具有90%以上同源性(包含相同基因序列)，且編碼戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；富钚缘幕蛐蛄?。
[0012]所述的D-氨基酸氧化酶基因序列與SEQ ID N0.3具有90%以上同源性(包含相同基因序列)，且編碼D-氨基酸氧化酶活性的基因序列。
[0013]所述的戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶共表達(dá)質(zhì)粒，其共表達(dá)啟動(dòng)子為T5。
[0014]所述的戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶共表達(dá)質(zhì)粒的宿主菌，其宿主菌優(yōu)選自大腸桿菌E.coli BL21、大腸桿菌M15、大腸桿菌DH5a及大腸桿菌W3110中的一種。
[0015]本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是:提供一種由上述重組酶催化去乙酰氧基頭孢菌素C (DAOC)直接生產(chǎn)7-氨基基去乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)中的應(yīng)用。
[0016]為解決第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:重組酶在7-氨基基去乙酰氧基頭孢烷酸制備中的應(yīng)用:將具有戊二?；?7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶的粗酶液，加入磷酸緩沖溶液中，再加入去乙酰氧基頭孢菌素C，在32±5°C溫度條件下攪拌反應(yīng)，用堿液維持反應(yīng)在pH=7.5±0.5，HPLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，待體系pH值不再變化，停止反應(yīng)，提純得7-氨基基去乙酰氧基頭孢烷酸。
[0017]本發(fā)明的有益效果:與傳統(tǒng)的兩種酶分別表達(dá)單獨(dú)生產(chǎn)和兩步酶法催化合成7-ADCA工藝相比，可以在生產(chǎn)7-ADCA的過(guò)程中，使酶催化劑的表達(dá)生產(chǎn)、分離純化以及去乙酰氧基頭孢菌素C的催化水解工藝都得到簡(jiǎn)化。
[0018]用基因工程手段改造下游工藝，為7-ADCA的酶催化生產(chǎn)工藝的升級(jí)換代提供了新思路，可加快由DAOC直接生產(chǎn)7-ADCA的工業(yè)化步伐。
【具體實(shí)施方式】:
[0019]實(shí)施例1
[0020]含有重組酶編碼基因(gla-dao，簡(jiǎn)稱GLD)的重組質(zhì)粒pET_GLD的構(gòu)建。
[0021]本實(shí)施例中涉及的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和表達(dá)制備等方法均為常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，可參考相關(guān)教研書籍。
[0022]I)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII對(duì)包含SEQ ID N0.4序列的質(zhì)粒pET-GLA進(jìn)行完全酶切，并回收酶切后產(chǎn)生的該?；富蚱巍?br> [0023]2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII消化質(zhì)粒pET28b (Novagen)。消化反應(yīng)結(jié)束后，分別用酚和酚/氯仿(1: 1)抽提酶液，以除去反應(yīng)液中的雜蛋白，再加入兩倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，過(guò)濾收集沉淀并重溶于蒸餾水中。
[0024]3)混合由步驟I中得到的gla基因片段和步驟2中得到的鏈狀pET28b載體DNA，加入T4DNA連接酶，于16°C反應(yīng)12小時(shí)。
[0025]4)將步驟3中連接后的混合液經(jīng)酚和酚/氯仿(1:1)分別抽提后，加入1/3體積PH7.5醋酸銨溶液和2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀其中的DNA，收集沉淀重溶于5 μ L蒸餾水中，取I μ L轉(zhuǎn)化入Ε.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，在含50mg/L壯觀霉素LB培養(yǎng)基上獲得轉(zhuǎn)化子。挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切鑒定，確定該轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA中含有外源gla基因片段，質(zhì)粒命名為pBLG。
[0026]5)用限制性內(nèi)切酶NheI和NotI對(duì)質(zhì)粒pBLG進(jìn)行完全酶切，回收酶切后產(chǎn)生的酰化酶基因片段。
[0027]6)用限制性內(nèi)切酶SpeI和NotI消化包含SEQ ID N0.4序列的重組質(zhì)粒pET_DA0。消化反應(yīng)結(jié)束后，分別用酚和酚/氯仿(1:1)抽提酶液，以除去反應(yīng)液中的雜蛋白，再加入兩倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，過(guò)濾收集沉淀并重溶于蒸餾水中。
[0028]7)混合分別由步驟5)和步驟6)得到的gla?；富蚱魏烷_(kāi)鏈的pET_DA0載體質(zhì)粒DNA，加入T4DNA連接酶于16°C反應(yīng)12小時(shí)。
[0029]8)將步驟7)中連接后的混合液經(jīng)酚和酚/氯仿(1:1)分別抽提后，加入1/3體積的P7.5醋酸銨溶液和2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀其中的DNA，收集沉淀重溶于5 μ L蒸餾水中，取I μ L轉(zhuǎn)化入Ε.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，在含50mg/L壯觀霉素LB培養(yǎng)基上獲得轉(zhuǎn)化子。挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切鑒定，確定該轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA中含有外源gla基因片段，所獲質(zhì)粒命名為pET-GLD。
[0030]實(shí)施例2[0031]融合酶的表達(dá):
[0032]將重組質(zhì)粒pET-GLD轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞E.coli BL21，得到融合酶的表達(dá)菌株E.coliBL2I/pET-GLD。
[0033]將重組菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜，再以5%的接種量轉(zhuǎn)接到50mL LB培養(yǎng)基的搖瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，加入0.5mM IPTG，于28°C進(jìn)行誘導(dǎo)，20小時(shí)后，離心收集菌體，在pH=7.5的磷酸緩沖溶液中超聲破碎，離心除去菌體碎片，收集上清酶液。
[0034]實(shí)施例3
[0035]重組酶直接催化去乙酰氧基頭孢菌素C生產(chǎn)7-ADCA
[0036]將實(shí)施例2中誘導(dǎo)表達(dá)的并初步提取的粗酶液，加入50mL磷酸緩沖溶液(0.1M，pH=8.0)中，再加入去乙酰氧基頭孢菌素C至總濃度6g/L，在30°C水浴條件下500轉(zhuǎn)/min攪拌反應(yīng)，用堿液維持反應(yīng)在pH=7.5，HPLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，待體系pH值不再變化，停止反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率大于97%，7-ADCA收率67%。
【權(quán)利要求】
1.一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶，其特征在于:所述的重組酶的編碼基因，其基因序列與SEQ ID N0.2限定的基因序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶活性的重組酶，其特征在于:所述的重組酶編碼基因的表達(dá)載體基因序列與SEQ IDN0.1具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的基因序列。
3.權(quán)利要求1所述的一種具有戊二?；?7-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶活性的重組酶的制備方法，其步驟為:將戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；富蚝虳-氨基酸氧化酶基因分別置于各自啟動(dòng)子的調(diào)控之下，構(gòu)建雙基因共表達(dá)質(zhì)粒，該雙基因共表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，再經(jīng)培養(yǎng)，得到同時(shí)表達(dá)具備戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶活力的重組酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種具有戊二?；?7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶的制備方法，其特征在于:所述的戊二酰-7-氨基頭孢烷酸?；富蛐蛄信cSEQ ID N0.4具有90%以上同源性，且編碼戊二酰_7_氨基頭孢烷酸?；富钚缘幕蛐蛄?。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種具有戊二?；?7-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶活性的重組酶的制備方法，其特征在于:所述的D-氨基酸氧化酶基因序列與SEQ IDN0.3具有90%以上同源性，且編碼D-氨基酸氧化酶活性的基因序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4、4或5所述的一種具有戊二?；?7-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶活性的重組酶的制備方法，其特征在于:所述的戊二?；?7-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶共表達(dá)質(zhì)粒，其共表達(dá)啟動(dòng)子為T5。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶活性的重組酶的制備方法，其特征在于:所述的大腸桿菌為大腸桿菌E.coli BL21、大腸桿菌M15、大腸桿菌DH5a及大腸桿菌W3110中的一種。
8.權(quán)利要求1所述的一種具有戊二?；?7-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶活性的重組酶在7-氨基基去乙酰氧基頭孢烷酸制備中的應(yīng)用:將具有戊二?；?7-氨基頭孢烷酸?；负虳-氨基酸氧化酶活性的重組酶的粗酶液，加入磷酸緩沖溶液中，再加入去乙酰氧基頭孢菌素C，在32±5°C溫度條件下攪拌反應(yīng)，用堿液維持反應(yīng)在pH=7.5±0.5，HPLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，待體系pH值不再變化，停止反應(yīng)，提純得7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸。
【文檔編號(hào)】C12P35/02GK103525796SQ201310495948
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】胡惜朝, 葛忠平 申請(qǐng)人:江蘇輝騰生物醫(yī)藥科技有限公司