巴斯德氏菌科的羧酸產(chǎn)生成員的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及最初從牛瘤胃中分離的，命名為DD1的新細(xì)菌菌株，其具有產(chǎn)生有機(jī)酸，尤其是琥珀酸(SA)的能力，并能夠利用甘油作為碳源；還涉及來(lái)自所述菌株的保留該能力的變體菌株；以及涉及通過(guò)使用所述微生物產(chǎn)生有機(jī)酸，尤其是琥珀酸的方法。
【專利說(shuō)明】巴斯德氏菌科的羧酸產(chǎn)生成員
[0001]本發(fā)明涉及最初從牛瘤胃中分離的，命名為DDl的新細(xì)菌菌株，其具有產(chǎn)生有機(jī)酸，尤其是琥珀酸(SA)的能力，并能夠利用甘油作為碳源；還涉及來(lái)自所述菌株的保留該能力的變體菌株；以及涉及通過(guò)使用所述微生物產(chǎn)生有機(jī)酸，尤其是琥珀酸的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]因?yàn)閬?lái)自生物質(zhì)的琥珀酸(SA)代表合成樹(shù)脂的重要成分或者是更具價(jià)值的低分子量化合物，尤其是四氫呋喃(THF)、1，4- 丁二醇(BDO)、Y - 丁內(nèi)酯(GBL)和吡咯烷酮的來(lái)源，來(lái)自所述酸的發(fā)酵產(chǎn)物早已經(jīng)引起了很大關(guān)注(W0-A-2006/066839)。
[0004]Lee等(2002a)描述了從牛瘤胃中分離的SA產(chǎn)生菌。所述細(xì)菌是不運(yùn)動(dòng)的、無(wú)孢子形成的、嗜中溫且嗜二氧化碳的革蘭氏陰性棒狀或球桿菌。基于16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)生分析及生理學(xué)分析表明所述菌株作為新的物種屬于Mannheimia屬，并已經(jīng)命名為曼海姆產(chǎn)玻拍酸菌(Mannheimia succiniciproducens)MBEL55E。在 100%C02 條件下,其在 6.0-7.5的PH范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好并產(chǎn)生2:1:1恒定比的琥珀酸、醋酸和甲酸。當(dāng)曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌MBEL55E在CO2-飽和葡萄糖作為碳源進(jìn)行厭氧培養(yǎng)時(shí)，在溫育的7.5小時(shí)里消耗19.8g/L葡萄糖并產(chǎn)生13.3g/L的SA。
[0005]然而，所述生物的顯著缺點(diǎn)是其不能代謝甘油的能力，所述甘油作為三酰甘油(TAG)的組分可容易地獲得(Dharmadi等，2006)，例如作為生物柴油生產(chǎn)的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)中的副產(chǎn)物。
[0006]已經(jīng)在科學(xué)文獻(xiàn)中描述了來(lái)自甘油的琥珀酸發(fā)酵產(chǎn)物(Lee等，2001;Dharmadi等，2006)，并且利用甘油比利用常見(jiàn)的糖，如葡萄糖，可獲得更高的產(chǎn)率[產(chǎn)生的SA的量/消耗的原材料的量](Lee等，2001)。然而，利用甘油獲得的空間時(shí)間產(chǎn)率比利用葡萄糖獲得的低得多(0.14相比于1.0gSA/[L h])并且沒(méi)有使用任何粗甘油。
[0007]僅在少數(shù)情況下曾經(jīng)描述過(guò)甘油到發(fā)酵產(chǎn)物的厭氧代謝。大腸桿菌(E.coli)能夠在非常特定的條件下如酸性pH、避免發(fā)酵氣體氫氣積累以及適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基組分下發(fā)酵甘油(Dharmadi等2006，Yazdani和Gonzalez2007)。許多微生物能夠在外部電子受體存在下發(fā)酵甘油(呼吸代謝)，很少能夠這樣發(fā)酵(即在缺少電子受體的情況下)。已經(jīng)在腸桿菌科(Enterobacteriaceae)家族的幾個(gè)物種中，如弗氏朽1樣酸細(xì)菌(Citrobacter freundii )和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中詳細(xì)研究了甘油的發(fā)酵代謝。這些生物中的甘油異化與其合成高度還原產(chǎn)物1，3-丙二醇(1，3-PD0)的能力緊密相關(guān)(Dharmadi等2006)。已經(jīng)報(bào)道了使用產(chǎn)玻拍酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)將甘油轉(zhuǎn)化成琥珀酸(Lee等2001)。該研究表明可以通過(guò)使用甘油作為碳源，在極少形成副產(chǎn)物醋酸的情況下產(chǎn)生琥珀酸，因此促進(jìn)琥珀酸的純化。通過(guò)間歇地喂飼甘油和酵母提取物獲得最高產(chǎn)率，這是導(dǎo)致產(chǎn)生大約19g/L琥珀酸的策略。然而注意到，甘油發(fā)酵發(fā)生需要在酵母提取物中存在的未鑒定營(yíng)養(yǎng)組分。
[0008]通過(guò)酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK)和丙酮酸羧化酶(PycA)催化的草酰醋酸鹽的羧化反應(yīng)利用HC03_作為CO2來(lái)源(Peters-Wendisch, PG等)。因此，碳酸氫鹽(hydrogencarbonate)來(lái)源如NaHCO3、KHCO3、NH4HCO3等可應(yīng)用于發(fā)酵和培養(yǎng)基來(lái)提高HCO3-在底物向琥珀酸代謝中的有效性。迄今為止，在現(xiàn)有技術(shù)中未曾發(fā)現(xiàn)琥珀酸從葡萄糖的產(chǎn)生依賴于HC03_的添加。
[0009]厭氧生物的生物量產(chǎn)生受限于從發(fā)酵途徑產(chǎn)生的ATP的量。在厭氧生物中甘油的生物量產(chǎn)率比糖類，所述糖類像己糖如葡萄糖、果糖，戊糖如木糖、阿拉伯糖，和二糖如蔗糖或麥芽糖的生物量產(chǎn)率低(Lee等2001，Dharmadi2007)。
[0010]然而，因?yàn)樘穷?Saccharides)相對(duì)于多元醇甘油具有更低的還原態(tài)，理論上，糖類比甘油以顯著更低的產(chǎn)率轉(zhuǎn)化成琥珀酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)糖類與甘油的組合在產(chǎn)生琥珀酸的厭氧生物中起作用(Lee等2001),但不能達(dá)到琥拍酸高于28g/l的值(titer)。
[0011]因此，需要其他細(xì)菌菌株，其具有從甘油產(chǎn)生有機(jī)酸，尤其是SA的能力。具體而言，此類菌株應(yīng)該以高生產(chǎn)率從甘油產(chǎn)生所述酸，尤其是如果使用例如來(lái)自生物柴油產(chǎn)品的粗甘油而不需前期純化。
[0012]發(fā)明概述
[0013]本發(fā)明目標(biāo)是提供具有從甘油，尤其是粗甘油產(chǎn)生琥珀酸能力的細(xì)菌菌株。
[0014]本發(fā)明人解決了該目標(biāo)，其令人驚奇地分離了具有期望的代謝特征的新細(xì)菌菌株，命名為DD1。
[0015]附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示DDl序列與MBEL55E序列之間的差異。
[0016]圖2顯示DDl的系統(tǒng)樹(shù)。
[0017]圖3 顯示 DDl 的 16S rDNA 序列(SEQ ID NO:1) ?
[0018]圖4顯示DDl的23S rDNA序列(SEQ ID NO: 2);其與“曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌’1BEL55E的相應(yīng)6個(gè)單獨(dú)序列的比對(duì)；其中DDl序列(下)與MBEL55E序列之間的差異示于單獨(dú)的附件I中；
[0019]圖5顯不DDl的光學(xué)顯微鏡圖像。
[0020]圖6顯示在不同的初始葡萄糖濃度下DDl的NH4OH控制分批培養(yǎng)。
[0021]圖7顯示在不同溫度和pH值下DDl的NH4OH控制分批培養(yǎng)。
[0022]圖8顯示DDl的NH4OH控制分批培養(yǎng)。圖代表酵母提取物⑴、蛋白胨⑵和玉米漿(C)的初始濃度[g/L]。
[0023]圖9顯示在含有和沒(méi)有蛋白胨的情況下在DDl的NH4OH控制分批培養(yǎng)中獲得的副產(chǎn)物。
[0024]圖10顯示在葡萄糖作為碳源的情況下DDl需氧分批培養(yǎng)的結(jié)果。
[0025]圖11顯示如Lee等，2002a和2002b所述，在含有葡萄糖的CO2飽和條件下DDl的厭氧分批培養(yǎng)的結(jié)果。
[0026]發(fā)明詳述
[0027]本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案涉及命名為DDl的細(xì)菌菌株，其可從牛瘤胃中分離，并能夠利用甘油(包括粗甘油)作為碳源；并涉及來(lái)自其的保留該能力的變體菌株。
[0028]優(yōu)選地，所述菌株具有從甘油(包括粗甘油)，尤其是在厭氧條件下產(chǎn)生琥珀酸的能力。
[0029]具體而言，所述新菌株具有SEQ ID NO:1的16S rDNA或顯示至少96、97、98、99或
99.9%序列同源性的序列；和/或SEQ ID NO: 2的23SrDNA或顯示至少95、96、97、98、99或99.9%序列同源性的序列。
[0030]兩條核苷酸序列之間的“同一性”或“同源性”指在比對(duì)序列全長(zhǎng)上的殘基的同一性，例如在來(lái)自生物信息學(xué)軟件包EMBOSS (版本5.0.0, http://emboss, sourceforge.net/what/)的程序needle的幫助下(對(duì)十分相似的序列)計(jì)算的同一性，所述程序具有默認(rèn)參數(shù):
[0031]-空位開(kāi)放(開(kāi)放空位的罰分):10.0
[0032]-空位延伸(延伸空位的罰分):0.5
[0033]-數(shù)據(jù)文件(軟件包中包括的得分矩陣)=EDNAFUl
[0034]菌株DDl的23S rDNA序列與“曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌” MBEL55E的相應(yīng)6個(gè)單獨(dú)序列的比對(duì)示于附件I中。其中，強(qiáng)調(diào)了 DDl序列(下)與MBEL55E序列的6個(gè)23S rDNA序列之間的差異。所述DDl序列(也參閱SEQ ID NO: 2)代表通過(guò)測(cè)序PCR擴(kuò)增的DDl的23S rDNA獲得的序列信息。測(cè)序?qū)嶒?yàn)產(chǎn)生了確切的序列信息，說(shuō)明來(lái)自DDl的23S rDNA信息可用作DDl菌株的辨別特征。所述DDl序列與各MBEL55E序列在至少6個(gè)序列位置上不同。最顯著的差異是在各MBEL55E序列中(接近位置1325)約133bp的插入，其在DDl序列中是缺失的。其他顯著的特定序列差異在位置451、1741、2040、2041、2045和2492處(如比對(duì)中使用的編號(hào))。
[0035]本發(fā)明的菌株也優(yōu)選顯示至少一個(gè)以下額外的代謝特征:
[0036]a)從蔗糖產(chǎn)生琥珀酸；尤其是在厭氧條件下；
[0037]b)從麥芽糖產(chǎn)生琥珀酸；尤其是在厭氧條件下；
[0038]c)從D-果糖產(chǎn)生琥珀酸；尤其是在厭氧條件下；
[0039]d)從D-半乳糖產(chǎn)生琥珀酸；尤其是在厭氧條件下；
[0040]e)從D-甘露糖產(chǎn)生琥珀酸；尤其是在厭氧條件下；
[0041]f)從D-葡萄糖產(chǎn)生琥珀酸；尤其是在厭氧條件下；
[0042]g)從D-木糖產(chǎn)生琥珀酸；尤其是在厭氧條件下；
[0043]h)從L-阿拉伯糖產(chǎn)生琥珀酸；尤其是在厭氧條件下；
[0044]i)不利用木糖醇、肌醇和山梨醇；
[0045]j)在需氧和厭氧條件下均生長(zhǎng)；
[0046]k)在75g/L和更高的初始葡萄糖濃度下生長(zhǎng)；
[0047]I)銨耐受。
[0048]具體而言，所述菌株顯示至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或全部所述額外特征。
[0049]例如，進(jìn)一步分析DDl共代謝糖類和多元醇甘油的能力。發(fā)現(xiàn)DDl能夠共代謝麥芽糖與甘油，導(dǎo)致生物量形成、琥珀酸形成，同時(shí)還有麥芽糖和甘油的利用。
[0050]應(yīng)以其最廣泛意義理解術(shù)語(yǔ)“酸”(在如本文涉及的有機(jī)單羥酸或二羥酸的上下文中，1.P.醋酸、乳酸和琥珀酸)，并也包括其鹽，例如堿金屬鹽，像Na和K鹽，或堿土金屬鹽，像Mg和Ca鹽，或銨鹽；或所述酸的酐。
[0051]術(shù)語(yǔ)“粗甘油”應(yīng)理解為在這樣的過(guò)程中產(chǎn)生的未加工的含甘油的流體，其中甘油是副產(chǎn)物，例如生物柴油或生物乙醇的產(chǎn)物。除非另有說(shuō)明，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“甘油”也包括“粗甘油”。
[0052]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及保藏于DSMZ并具有保藏號(hào)DSM18541的細(xì)菌菌株DD1，和來(lái)自其的變體或突變體菌株。所述變體和突變體保留至少其從甘油、蔗糖、麥芽糖、D-葡萄糖、D-果糖和/或D-木糖產(chǎn)生琥珀酸(SA)的能力。具體而言，它們也具有SEQID N0:1的16S rDNA或顯示至少96、97、98、99或99.9%序列同一性的序列；和/或SEQIDN0:2的23S rDNA或顯示至少95、96、97、98、99或99.9%序列同一性的序列。所述DDl菌株的變體或突變體具有不同于SEQ ID勵(lì):2的235也嫩，但保留如上討論的至少一個(gè)序列差異，其使所述23S rDNA序列區(qū)別與MBEL55E菌株的23S rDNA序列。例如，132bp的插入也在此類變體或突變體中缺失，任選地與附件I比對(duì)中描述的一個(gè)或更多個(gè)其他特定序列差異組合。
[0053]根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的細(xì)菌菌株以至少0.5g/g高達(dá)約1，28g/g的產(chǎn)率系數(shù)YP/S ;例如至少 O, 6g/g、至少 0.7g/g、至少 0.75g/g、至少 0.8g/g、至少 0.85g/g、至少 0.9g/g、至少 0.95g/g、至少 1.0g/g、至少 1.05g/g、至少 1.lg/g、至少 1.15g/g、至少 1.20g/g、至少1.22g/g、至少1.24g/g的產(chǎn)率系數(shù)YP/S將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一種碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸。
[0054]根據(jù)另一實(shí)施方案,本發(fā)明的細(xì)菌菌株以至少1.0g/g、或>1.0g/g、或>1.05g/g、或 >1.lg/g、或 >1.15g/g、或 >1.20g/g、或 >1.22g/g、或 >1.24g/g 高達(dá)約 I, 28g/g 的產(chǎn)率系數(shù)YP/S將至少28g/L的甘油轉(zhuǎn)化成至少28.lg/L的琥珀酸。例如，28g/L的甘油可轉(zhuǎn)化成高達(dá)約40或高達(dá)約35g/L琥珀酸。
[0055]根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的細(xì)菌菌株以至少0.6g gDCW^tT1琥珀酸、或至少0.65、至少0.7g gDCth'至少0.75g gDOTl.1、或至少0.77g gDOTl.1琥珀酸的特定生產(chǎn)產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一種碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸。
[0056]根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的細(xì)菌菌株以對(duì)琥珀酸而言至少2.2g/(Lh)、或至少2.5、至少2.75、至少3、至少3.25、至少3.5或至少3.7g/(L*h)琥珀酸的空間時(shí)間產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一種碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸。
[0057]根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的細(xì)菌菌株以對(duì)琥珀酸而言至少2.2g/(L h)、或至少2.5、至少2.75、至少3、至少3.25、至少3.5或至少3.7g/(L*h)的空間時(shí)間產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少28g/L的至少一種碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸。
[0058]根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的細(xì)菌菌株以至少0，6g g DCW—V1或至少0.65或至少0.7g gDCW—V1琥珀酸，或至少0.77g gDCW—V1琥珀酸的特定生產(chǎn)產(chǎn)率，和對(duì)琥珀酸而言至少2.2g/(L h)、或至少2.5、至少2.75、至少3、至少3.25、至少3.5或至少3.7g/(L*h)的空間時(shí)間產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一種碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸。
[0059]在如上定義的本發(fā)明細(xì)菌菌株的另一實(shí)施方案中，所述碳源是甘油或甘油與選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖的至少一種其他碳源的混合物。
[0060]如本文所述，不同的產(chǎn)率參 數(shù)(“產(chǎn)率(yield)”或YP/S 特定生產(chǎn)產(chǎn)率(specificproductivity yield) ” ；或空間時(shí)間產(chǎn)率(Space-Time-Yield, STY))為本領(lǐng)域所熟知并如Song和Lee, 2006描述來(lái)測(cè)定。
[0061]“產(chǎn)率”和“YP/S”(各自以產(chǎn)生的產(chǎn)物量/消耗的材料的量表述)此處用作同義詞。
[0062]特定生產(chǎn)產(chǎn)率描述產(chǎn)物，像每小時(shí)每升發(fā)酵培養(yǎng)液每克干生物量產(chǎn)生的琥珀酸的量。表述為DCW的細(xì)胞干重的量描述生物化學(xué)反應(yīng)中生物活性微生物的量。給定的數(shù)值為每小時(shí)每克DCW多少克產(chǎn)物(即g gDCW—V1)。
[0063]本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及用于發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸或其鹽或衍生物的方法，所述方法包括步驟:
[0064]a)在含有可同化碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)如一項(xiàng)前述定義中所定義的細(xì)菌菌株,并在存在二氧化碳下，在約10到60，或20到50，或30到45°C的溫度，5.0到9.0，或5.5到8.0，或6.0到7.0的pH中培養(yǎng)所述菌株；和
[0065]b)從所述培養(yǎng)基中獲得所述有機(jī)酸或其鹽或衍生物。
[0066]可間斷地或連續(xù)地進(jìn)行所述方法，并且可通過(guò)常規(guī)手段，例如HPLC或GC分析監(jiān)測(cè)酸產(chǎn)生的過(guò)程。
[0067]優(yōu)選地，優(yōu)選在厭氧條件下通過(guò)所述方法產(chǎn)生琥珀酸(SA)?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)技術(shù)，例如通過(guò)將反應(yīng)培養(yǎng)基的成分脫氣并通過(guò)以例如0.1到I或0.2到0.5vvm的流速引入二氧化碳或氮?dú)饣蚱浠旌衔镆约叭芜x地氫氣維持厭氧條件來(lái)建立厭氧條件。
[0068]可通過(guò)常規(guī)技術(shù)，例如通過(guò)以例如0.1到1，或0.2到0.5vvm的流速引入空氣或氧
氣來(lái)建立需氧條件。
[0069]適當(dāng)時(shí),可應(yīng)用0.1到1.5bar的輕微超壓。
[0070]在所述方法中，所述可同化碳源優(yōu)選選自甘油、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖及其混合物，或含有至少一種所述化合物的組合物，或選自淀粉、纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素纖維素的分解產(chǎn)物。
[0071]可優(yōu)選將可同化碳源的初始濃度調(diào)整到5到100g/l范圍內(nèi)的值，并可在培養(yǎng)過(guò)程中維持在該范圍內(nèi)。
[0072]通過(guò)添加合適的堿例如NH40H、NH4HC03、(NH4)2C03>NaOH,Na2CO3^NaHCO3>KOH,K2CO3>KHCO3、Mg (OH) 2、MgCO3、Mg (HCO3) 2、Ca (OH)2, CaCO3、Ca (HCO3) 2、CaO、CH6N2O2、C2H7N 或其他堿及其混合物控制反應(yīng)培養(yǎng)基的pH。所述堿的生理狀態(tài)可以是水溶液、水懸浮液、氣體或液體。
[0073]用于產(chǎn)生SA的尤其優(yōu)選條件是:
[0074]碳源:甸甸糖、木糖或麥牙糖和/或甘油(包括粗甘油)
[0075]溫度:30到 45 °C
[0076]pH:6.0 到 7.0,通過(guò)如上述堿，優(yōu)選通過(guò) HC03_ 源如 Na2CO3' NaHCO3' Mg(HCO3)2'Ca (HCO3) 2 或 Mg (OH) 2、MgCO3、Ca (OH)2, CaCO3 控制
[0077]供給氣體:C02
[0078]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸或其鹽或衍生物的方法，所述方法包括步驟:
[0079]a)在含有至少一種可同化碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌菌株并在利于所期望有機(jī)酸形成的條件下培養(yǎng)所述菌株；
[0080]b)從所述培養(yǎng)基中獲得所述有機(jī)酸或其鹽或衍生物；[0081]并且所述方法的特征還在于至少28g/L的甘油以至少1.0g/g、或>1.0g/g、或>1.05g/g、或 >1.lg/g、或 >1.15g/g、或 >1.20g/g、或 >1.22g/g、或 >1.24g/g ;高達(dá)約 I, 28g/g的產(chǎn)率系數(shù)YP/S ;例如以至少O, 6g/g、至少0.7g/g、至少0.75g/g、至少0.8g/g、至少0.85g/g、至少 0.9g/g、至少 0.95g/g、至少 1.0g/g、至少 1.05g/g、至少 1.lg/g、至少 1.15g/g、至少1.20g/g、至少1.22g/g、至少1.24g/g的產(chǎn)率系數(shù)YP/S轉(zhuǎn)化成至少28.lg/L琥拍酸。例如，28g/L的甘油可轉(zhuǎn)化成高達(dá)約40或高達(dá)約35g/L的琥珀酸。
[0082]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸或其鹽或衍生物的方法，所述方法包括步驟:
[0083]a)在含有至少一種可同化碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌菌株并在利于所期望有機(jī)酸形成的條件下培養(yǎng)所述菌株；
[0084]b)從所述培養(yǎng)基中獲得所述有機(jī)酸或其鹽或衍生物；
[0085]并且所述方法的特征還在于以至少0.6g gDOT1]^1琥拍酸或至少0.65或至少0.7ggDCW—V1琥珀酸、或至少0.75g gDCW—V1琥珀酸、或至少0.77g gDCW—V1琥珀酸的特定生產(chǎn)產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸。
[0086]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸或其鹽或衍生物的方法，所述方法包括步驟:
[0087]a)在含有至少一種可同化碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌菌株并在利于所期望有機(jī)酸形成的條件下培養(yǎng)所述菌株；
[0088]b)從所述培養(yǎng)基中獲得所述有機(jī)酸或其鹽或衍生物；
`[0089]并且所述方法的特征還在于以對(duì)琥珀酸而言至少2.2g/(L h)、或至少2.5、至少2.75、至少3、至少3.25、至少3.5或至少3.7g/(L*h)琥珀酸的空間時(shí)間產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸。
[0090]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸或其鹽或衍生物的方法，所述方法包括步驟:
[0091]a)在含有至少一種可同化碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌菌株并在利于所期望有機(jī)酸形成的條件下培養(yǎng)所述菌株；
[0092]b)從所述培養(yǎng)基中獲得所述有機(jī)酸或其鹽或衍生物；
[0093]并且所述方法的特征還在于以對(duì)琥珀酸而言至少2.2g/(L h)、或至少2.5、至少
2.75、至少3、至少3.25、至少3.5或至少3.7g/(L*h)的空間時(shí)間產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少28g/L碳源轉(zhuǎn)化成琥拍酸。
[0094]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸或其鹽或衍生物的方法，所述方法包括步驟:
[0095]a)在含有至少一種可同化碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌菌株并在利于所期望有機(jī)酸形成的條件下培養(yǎng)所述菌株；
[0096]b)從所述培養(yǎng)基中獲得所述有機(jī)酸或其鹽或衍生物；
[0097]并且所述方法的特征還在于以至少0，6g gDCW—1!^1琥珀酸或至少0.65或至少0.7g gDCW—V1琥珀酸，或至少0.77g gDCW—V1琥珀酸的特定生產(chǎn)產(chǎn)率，和對(duì)琥珀酸而言至少2.2g/(L h)、或至少2.5、至少2.75、至少3、至少3.25、至少3.5或至少3.7g/(L*h)的空間時(shí)間產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸。
[0098]在產(chǎn)生琥珀酸的上述確定的方法的另一實(shí)施方案中，所述碳源是甘油或甘油的混合物和選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖的至少一種其他碳源。
[0099]其他優(yōu)選條件將來(lái)自所附實(shí)施例和附圖。
[0100]可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法例如結(jié)晶、過(guò)濾、電透析、層析，以常規(guī)方式來(lái)分離所產(chǎn)生的琥珀酸和/或琥珀酸鹽。例如，可通過(guò)使用用于中和及過(guò)濾沉淀的氫氧化鈣、氧化鈣、碳酸鈣或碳酸氫鈣在發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵罐中通過(guò)沉淀將它們分離為琥珀酸鈣產(chǎn)物。
[0101]通過(guò)用硫酸對(duì)琥珀酸進(jìn)行酸化從沉淀的鈣或琥珀酸鹽中回收期望的琥珀酸產(chǎn)物，隨后通過(guò)過(guò)濾除去硫酸鈣(石膏)或沉淀物?？赏ㄟ^(guò)離子交換層析對(duì)所得的溶液進(jìn)行進(jìn)一步的純化，以去除不想要的殘留離子。
[0102]本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及用于產(chǎn)生琥珀酸和/或琥珀酸鹽，尤其是銨鹽的方法，所述方法包括發(fā)酵產(chǎn)生如上定義的琥珀酸并用合適的堿，尤其是無(wú)機(jī)堿，像銨，或其水溶液控制pH。
[0103]本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及產(chǎn)生四氫呋喃(THF)和/或1，4- 丁二醇(BDO)和/或Y-丁內(nèi)酯(GBL)的方法 ，其包括
[0104]a)發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸和/或琥珀酸鹽，例如如上定義的銨鹽，和
[0105]bl)將所獲的游離酸直接催化氫化成THF和/或BDO和/或GBL，或
[0106]b2)所獲游離琥珀酸和/或琥珀酸銨鹽化學(xué)酯化成其對(duì)應(yīng)的二低級(jí)烷基酯，并隨后將所述酯催化氫化成THF和/或BDO和/或GBL。
[0107]低級(jí)烷基優(yōu)選代表直鏈或分支C1-C6-,優(yōu)選C1-C4-烷基殘基，尤其是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基以及正戊基和n-neXyl及其分支類似物。
[0108]本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及用于產(chǎn)生吡咯烷酮的方法，其包括
[0109]a)發(fā)酵產(chǎn)生如上定義的琥珀酸鹽，和
[0110]b)以本身已知的方式，例如在W0-A-2006/066839 (其文件在此引入作為參考)中描述的方式將琥珀酸銨鹽化學(xué)轉(zhuǎn)化成吡咯烷酮。
[0111]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用作可同化碳源的所述甘油是粗甘油。
[0112]SA直接氫化的更多細(xì)節(jié)
[0113]用于進(jìn)行直接催化氫化的合適的實(shí)驗(yàn)條件是眾所周知的，并例如描述于US4，550，185中，此處引用作為參考。
[0114]使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法、裝置和助劑如溶劑以本身已知的方式將SA氫化。具體而言，在適合酸氫化的多相催化劑存在下進(jìn)行連續(xù)或分批液相氫化。本領(lǐng)域技術(shù)人員在可接受的努力下可確定最佳方法參數(shù)。例如，反應(yīng)溫度在約100到約300°C的范圍內(nèi)，優(yōu)選在約130到285°C范圍內(nèi)，并且壓力從約20到350bar，例如從100到250bar?？捎糜跉浠磻?yīng)的催化劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。例如，可使用多種鈀/錸/碳催化劑?？捎糜跉浠磻?yīng)的溶劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。例如，可使用水溶劑介質(zhì)。[0115]氫化后SA酯化的更多細(xì)節(jié)
[0116]直接催化氫化后用于進(jìn)行化學(xué)酯化的合適的實(shí)驗(yàn)條件是眾所周知的，并例如描述于在此引入作為參考的歐洲專利申請(qǐng)06007118.0中。
[0117]a)酯化方法:
[0118]使用本身已知的裝置以多種設(shè)計(jì)進(jìn)行酯化方法，其可包括反應(yīng)性蒸餾(reactivedistillation)。
[0119]例如，可使用以連續(xù)方式運(yùn)轉(zhuǎn)的酯化車間(esterification plant),其包含具有通過(guò)安裝支架或填墊材料完成適當(dāng)數(shù)量的理論級(jí)的精餾柱。一旦在柱中因上樣(feeding-1n)鏈烷醇形成穩(wěn)定狀態(tài)溫度模式，就將包含SA銨鹽的水裝料從儲(chǔ)存容器上樣到柱的頂部，所述鏈燒醇在粘著到所述柱的忙槽(sump)的蒸發(fā)器環(huán)路(evaporator loop)中蒸發(fā)。反應(yīng)形成下降的含銨鹽液體與冷凝物，和上升的含鏈烷醇的蒸氣相的對(duì)流。為了催化酯化反應(yīng)，可向銨鹽初始裝料中加入均相催化劑。或者，可在柱內(nèi)部提供多相催化劑。所形成的羧酸酯在反應(yīng)條件下是液體，并經(jīng)柱的底部流向蒸餾柱的貯槽，并從所述貯槽中連續(xù)流出。從反應(yīng)柱中去除氣態(tài)組分，例如包含鏈烷醇-水和/或銨的共沸混合物，并因此在所述柱的頂部從反應(yīng)平衡中去除。
[0120]可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員在可接受的努力下完成對(duì)上述特定實(shí)施方案的進(jìn)一步修改。
[0121]根據(jù)所用裝置的配置，例如所用柱內(nèi)容物的類型、反應(yīng)物的類型和量、適當(dāng)時(shí)所用催化劑的類型和量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定用于本發(fā)明酯化方法的合適的方法參數(shù)范圍。例如，并非限制性的，可在以下參數(shù)范圍中設(shè)置各參數(shù):
[0122]柱溫度:0- 300 1:，具體而言 40 - 2501:，或 70 - 2001:
[0123]壓力:0.I到6bar，具體而言標(biāo)準(zhǔn)壓力
[0124]停留時(shí)間:幾秒(例如I到60秒)多至幾天(例如I到5天)，具體而言幾分鐘(例如I到60分鐘)至幾小時(shí)(例如I到15小時(shí))，更優(yōu)選幾分鐘(例如5到20分鐘)至2小時(shí)。
[0125]b)氫化方法
[0126]使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法、裝置和助劑，如催化劑以本身已知的方式將根據(jù)本發(fā)明制備的SA酯氫化。
[0127]具體而言，在適合酯氫化的多相催化劑的存在下進(jìn)行連續(xù)或分批氣相氫化。本領(lǐng)域技術(shù)人員在可接受努力下可為特定酯確定最佳方法參數(shù)。例如，反應(yīng)溫度在約100到約300°C的范圍內(nèi)，優(yōu)選在約200到280°C范圍內(nèi)，并且壓力從約5到lOObar，例如從10到50bar。反應(yīng)物與氫氣的摩爾比值設(shè)置在約1:100到約1:2000，例如1:800到1:1500的范圍內(nèi)。
[0128]可用于本發(fā)明氫化反應(yīng)的催化劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。例如，可使用多種銅催化劑。例如，現(xiàn)有技術(shù)描述了還原亞鉻酸銅催化劑的用途，所述催化劑可獲自DavyProcess Technology Ltd.,英國(guó)，名稱為85/1。然而，尤其適合于本發(fā)明的催化劑是支持性氧化銅催化劑，所述氧化銅應(yīng)用于氧化鋁或硅支持材料。也在以下論文中描述了利用銅催化劑將琥珀酸酯氫化成BD0(1，4-丁二醇)/GBL(y-丁內(nèi)酯)/THF的實(shí)例:Schlander, Jan., 2000 年 2 月,University of Karlsruhe, " Gasphasenhydrierung
von Maleinsauredimethyles ter zul, 4-Butandiol, gamma-Butyrolacton undTetrahydrofuran an Kupfer-Katalysatoren"。
[0129]發(fā)酵步驟的更多細(xì)節(jié):
[0130]可在攪拌發(fā)酵罐、鼓泡塔和環(huán)式反應(yīng)器中進(jìn)行本發(fā)明所用的發(fā)酵。包括攪拌類型和幾何設(shè)計(jì)的可能的方法類型的綜述可見(jiàn)于"Chmiel:Bioprozesstechnik:Einfiihrungin die Bioverfahrenstechnik, Bandl "。在所述方法中，可獲得的典型變體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或例如在"Chmiel, Hammes and Bailey:Biochemical Engineering"中解釋的以下變體，如分批式發(fā)酵、分批補(bǔ)料式發(fā)酵、重復(fù)分批補(bǔ)料式發(fā)酵或具有或不具有循環(huán)生物量的連續(xù)發(fā)酵。根據(jù)生產(chǎn)菌株，可以/必須完成空氣、氧氣、二氧化碳、氫氣、氮?dú)饣蜻m當(dāng)氣體混合物的噴射，以達(dá)到好的產(chǎn)率。
[0131]在本發(fā)明方法的發(fā)酵液中進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化之前，可對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理；例如，可以去除發(fā)酵液的生物質(zhì)(biomass)。去除生物質(zhì)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，例如過(guò)濾、沉淀和浮選。結(jié)果，例如可通過(guò)離心機(jī)、分離器、傾析器、過(guò)濾器或在浮選裝置中去除生物質(zhì)。為了最大回收有價(jià)值的產(chǎn)物，經(jīng)常建議例如以透析過(guò)濾的形式洗滌生物質(zhì)。方法的選擇依賴于發(fā)酵罐培養(yǎng)液中的生物質(zhì)含量和生物質(zhì)的性質(zhì)，還有生物質(zhì)與有價(jià)值產(chǎn)物的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，可將發(fā)酵液滅菌或巴士消毒。
[0132]在其他實(shí)施方案中，將發(fā)酵液濃縮。根據(jù)需要，可分批或連續(xù)進(jìn)行該濃縮。應(yīng)該選擇壓力和溫度范圍，使得首先沒(méi)有產(chǎn)物損傷發(fā)生，其次最少使用裝置和能量是必須的。靈巧的選擇用于多級(jí)蒸發(fā)的壓力和溫度水平使得能夠節(jié)約能量。
[0133]對(duì)于裝置，可以天然的或強(qiáng)制循環(huán)方式利用攪拌罐、降膜式蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器、強(qiáng)閃循環(huán)蒸發(fā)器和其他蒸發(fā)器類型。
[0134]結(jié)果，術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵液”理解為表示基于發(fā)酵方法并且如本文所述未曾起作用或已經(jīng)起作用的水溶液?！0135]將通過(guò)以下實(shí)施例來(lái)更詳細(xì)地描述本發(fā)明。以下實(shí)施例用于說(shuō)明性目的，而不旨在限制本發(fā)明的范圍。
[0136]實(shí)施例1:分離DDl
[0137]為了分離使用四步方法，該方法包括為取樣、濃縮培養(yǎng)、分離純培養(yǎng)物和檢測(cè)純培養(yǎng)物的琥珀酸(SA)產(chǎn)生的步驟。
[0138]1.實(shí)驗(yàn)方法
[0139]1.1 取樣
[0140]從牛瘤胃、來(lái)自城市污水處理廠的消化污泥和釀酒殘?jiān)腥印Ｍㄟ^(guò)相對(duì)高濃度的有機(jī)物和無(wú)氧富含CO2的大氣來(lái)對(duì)這些產(chǎn)地進(jìn)行表征。以下給出關(guān)于所述樣品、其起源及處理的更詳盡信息。
[0141]a)瘤胃內(nèi)含物取自 Institut fur Tierernahrung , University of
Hohenheim的插管的Holstein奶牛。原位pH值及溫度分別為6.7和37°C。將材料經(jīng)無(wú)菌濾布過(guò)濾，通CO2并立即在冰上冷卻以當(dāng)天運(yùn)輸并處理。
[0142]b)消化污泥取自Mannheim-Sandhofen的城市污水處理廠的消化塔中。原位pH值及溫度分別為7.1和36.3°C。將樣品置于冰上冷卻并當(dāng)天處理。污泥中氣相的主要成份為甲烷和二氧化碳。
[0143]c)果渣樣品于2005年11月收集于德國(guó)西南部的田地。來(lái)自紅葡萄(SpStburgunder )的果洛取自大stash的中部。該區(qū)域應(yīng)為無(wú)氧狀態(tài)。來(lái)自白葡萄
(Miiller-Thurgau)的果洛取自其中已在進(jìn)行乙醇發(fā)酵的忙存容器中。
[0144]1.2富集培養(yǎng)
[0145]在含D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖作為唯一碳源的不同培養(yǎng)基上進(jìn)行富集培養(yǎng)。培養(yǎng)基組分如下所述:
[0146]表1:用于富集培養(yǎng)的培養(yǎng)基組分。
[0147]
【權(quán)利要求】
1.細(xì)菌菌株，以及來(lái)自其的保留以下能力的變體和突變菌株，所述菌株為巴斯德氏菌科的成員，最初從瘤胃中分離，能夠利用甘油作為碳源。
2.權(quán)利要求1的菌株，其具有從甘油產(chǎn)生琥珀酸的能力。
3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其具有SEQID勵(lì):1的163也嫩，或顯示至少96、97、98、99或99.9%序列同源性的序列。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其具有SEQID N0:2的23S rDNA，或顯示至少95、96、97、98、99或99.9%序列同源性的序列。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其顯示至少一個(gè)以下額外的代謝特征: a)從蔗糖產(chǎn)生琥珀酸； b)從麥芽糖產(chǎn)生琥珀酸； c)從D-果糖產(chǎn)生琥珀酸； d)從D-半乳糖產(chǎn)生琥珀酸； e)從D-甘露糖產(chǎn)生琥珀酸； f)從D-葡萄糖產(chǎn)生琥珀酸； g)從D-木糖產(chǎn)生琥珀酸； h)從L-阿拉伯糖產(chǎn)生琥珀酸；` i)不利用木糖醇、肌醇和山梨醇； j)在需氧和厭氧條件下均生長(zhǎng)； k)在75g/L和更高的初始葡萄糖濃度下生長(zhǎng)； I)在70g/L和更高的初始甘油濃度下生長(zhǎng)； m)銨耐受。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其以至少0.5g/g的產(chǎn)率系數(shù)YP/S將蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油轉(zhuǎn)化成琥珀酸。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的菌株，其具有至少一個(gè)以下特征: a)以至少1.0g/g的產(chǎn)率系數(shù)YP/S將至少28g/L的甘油轉(zhuǎn)化成至少28.lg/L的琥珀酸； b)以至少0.6ggDCW—1!!—1琥珀酸的特定生產(chǎn)產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一種碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸； c)以對(duì)琥珀酸而言至少2.2g/(L h)琥珀酸的空間時(shí)間產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一種碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸； d)以對(duì)琥珀酸而言至少2.2g/(Lh)的空間時(shí)間產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少28g/L的至少一種碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸； e)以至少0.6ggDCW^tT1琥珀酸的特定生產(chǎn)產(chǎn)率和對(duì)琥珀酸而言至少2.2g/(L h)的空間時(shí)間產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一種碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸。
8.以保藏號(hào)DSM18541保藏于DSMZ的細(xì)菌菌株DDl，其具有產(chǎn)生琥珀酸的能力，并且來(lái)自其的變體或突變體至少保留所述產(chǎn)生琥珀酸的能力。
9.用于發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸或其鹽或衍生物的方法，所述方法包括以下步驟: a)在含有可同化碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)如前述權(quán)利要求中的一項(xiàng)中定義的細(xì)菌菌株，并在利于所期望有機(jī)酸形成的條件下培養(yǎng)所述菌株； b)從所述培養(yǎng)基中獲得所述有機(jī)酸或其鹽或衍生物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中在存在二氧化碳下，在約10到60°C的溫度范圍和5.0到9.0的pH范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中所述有機(jī)酸是琥珀酸。
12.權(quán)利要求9到11中一項(xiàng)的方法，其中所述可同化碳源選自甘油、蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖；淀粉、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素纖維素的分解產(chǎn)物；及其混合物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述碳源是甘油，或甘油與選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖的至少一種其他碳源的混合物。
14.權(quán)利要求9到13中一項(xiàng)的方法，其中將所述可同化碳源的濃度調(diào)整到5到80g/l范圍內(nèi)的值。
15.用于發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸或其鹽或衍生物的方法，所述方法包括步驟: a)在含有至少一種可同化碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌菌株，并在利于所期望有機(jī)酸形成的條件下培養(yǎng)所述菌株； b)從所述培養(yǎng)基中獲得所述有機(jī)酸或其鹽或衍生物； 其額外的特征在于至少一種以下特征: c)以至少1.0g/g的產(chǎn)率系數(shù)YP/S將至少28g/L的甘油轉(zhuǎn)化成至少28.lg/L的琥珀酸； d)以至少0.6ggDCW—1!!—1琥珀酸的特定生產(chǎn)產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一種碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸； e)以對(duì)琥珀酸而言至少2.2g/(L h)琥珀酸的空間時(shí)間產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一種碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸； f)以對(duì)琥珀酸而言至少2.2g/(Lh)的空間時(shí)間產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少28g/L的至少一種碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸； g)以至少0.6ggDCW^tT1琥珀酸的特定生產(chǎn)產(chǎn)率和對(duì)琥珀酸而言至少2.2g/(L h)的空間時(shí)間產(chǎn)率將選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一種碳源轉(zhuǎn)化成琥珀酸。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述細(xì)菌菌株是在權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)定義的菌株。
17.權(quán)利要求9到16中任一項(xiàng)的方法，其間斷或連續(xù)進(jìn)行。
18.用于產(chǎn)生琥珀酸和/或琥珀酸銨鹽的方法，所述方法包括發(fā)酵產(chǎn)生權(quán)利要求9到17中任一項(xiàng)的琥珀酸，并且用氨或其水溶液，或NH4HC03、(NH4)2CO3^ NaOH, Na2CO3^ NaHC03、KOH、K2CO3> KHCO3 > Mg (OH)2, MgCO3> MgH(CO3)2' Ca (OH)2, CaCO3> Ca (HCO3)2' CaO, CH6N2O2, C2H7N及其混合物控制所述pH。
19.用于產(chǎn)生四氫呋喃(THF)和/或1，4-丁二醇(BDO)和/或Y _ 丁內(nèi)酯(GBL)的方法，其包括: a)發(fā)酵產(chǎn)生如權(quán)利要求18中定義的琥珀酸和/或琥珀酸鹽，和bl)或者將所獲的游離酸直接催化氫化成THF和/或BDO和/或GBL，或b2)將所獲的游離琥珀酸和/或琥珀酸鹽化學(xué)酯化成其對(duì)應(yīng)的二低級(jí)烷基酯，并隨后將所述酯催化氫化成THF和/或BDO和/或GBL。
20.用于產(chǎn)生吡咯烷酮的方法，其包括 a)發(fā)酵產(chǎn)生如權(quán)利要求18定義的琥珀酸銨鹽，和 b)以本身已知的方式將琥珀酸銨鹽化學(xué)轉(zhuǎn)化成吡咯烷酮。
21.權(quán)利要求13到20中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)三?；视王サ孽デ懈瞰@得所述用作可同化碳源的甘油。
22.權(quán)利要求21的方法，其中甘油是從生物柴油制備中獲得的廢品。
23.權(quán)利要求1到8 中任一項(xiàng)中定義的細(xì)菌菌株用于發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)精細(xì)化學(xué)品的用途。
24.權(quán)利要求22的用途，其中所述有機(jī)精細(xì)化學(xué)品是琥珀酸或其鹽或衍生物。
【文檔編號(hào)】C12P7/46GK103589662SQ201310483385
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2008年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2007年8月17日
【發(fā)明者】E·朔爾騰, D·德格勒, S·黑夫納, H·施羅德 申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司