一種可用于結(jié)核感染診斷的結(jié)核分枝桿菌重組抗原的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種編碼結(jié)核分枝桿菌重組抗原的重組DNA、包含所述重組DNA的表達載體、所述重組DNA編碼的結(jié)核分枝桿菌重組抗原，以及所述重組DNA和重組抗原的制備方法和用途。本發(fā)明還提供了包含所述重組抗原的試劑、組合物和試劑盒，它們能特異性地檢測結(jié)核分枝桿菌感染。本方法不會發(fā)生交叉反應(yīng)，可以用于檢測結(jié)核分枝桿菌抗原特異性的血清IgG抗體，為其他試劑盒的開發(fā)提供一種方便、高靈敏度、準確性和穩(wěn)定性的免疫檢測方法，該方法使用儀器簡單，技術(shù)操作相對容易掌握。
【專利說明】—種可用于結(jié)核感染診斷的結(jié)核分枝桿菌重組抗原的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供了一種結(jié)核分枝桿菌重組抗原及其制備方法，本發(fā)明還提供了一種結(jié)核分枝桿菌的診斷試劑盒，能特異性地檢測結(jié)核分枝桿菌感染，涉及基因工程技術(shù)和免疫診斷技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病目前依舊是21世紀嚴重危及人類健康的疾病，其中移民、HIV感染和耐藥是21世紀全球結(jié)核病控制所面臨的三大難題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，目前全球已有20億人感染結(jié)核分枝桿菌(MTB)，平均每I秒鐘就有I個新感染者出現(xiàn)，每年新發(fā)結(jié)核病人達800萬~1000萬，300萬人死于結(jié)核病，是死亡率最高的感染性疾病。全世界95%以上的結(jié)核病人在發(fā)展中國家，我國是全球結(jié)核病負擔最嚴重的22個國家之一，新發(fā)病例占全球的16 %，結(jié)核病患者的人數(shù)居世界第二位，有近半數(shù)人口( 5.5億)感染結(jié)核菌，包括活動性結(jié)核病人450萬人，占全球病人總數(shù)的1/4，每年13萬人死于結(jié)核感染。近些年來，雖然我國在結(jié)核防治方面取得了一定的成績，但目前我國傳染性肺結(jié)核的患病率仍居高不下，因此，我國已將結(jié)核病列為重點控制的重大疾病之一。
[0003]提高結(jié)核感染的診斷方法，對于防控結(jié)核病，具有重要意義。目前針對結(jié)核感染的傳統(tǒng)診斷方法，主要包括抗酸染色法、分離培養(yǎng)法、結(jié)核的血清學(xué)診斷、結(jié)核菌素的皮膚接種實驗以及結(jié)核抗原誘導(dǎo)的干擾素釋放實驗等。其中，抗酸染色法主要根據(jù)結(jié)核分枝桿菌的細胞壁中具有大量的脂質(zhì)成份，容易被石炭酸復(fù)紅染液染成紅色，該染色雖然具有一定的特異性，但敏感性較差，據(jù)統(tǒng)計，40~60%的肺結(jié)核患者以及75%的肺外結(jié)核患者，其結(jié)核分枝桿菌的抗酸染色結(jié)果顯示為假陰性，因此很難滿足臨床要求。結(jié)核菌的分離培養(yǎng)法是將痰液、支氣管灌洗液、胸腹腔積液等在特定的培養(yǎng)基(如改良羅式培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，可以較為特異性地鑒別結(jié)核分枝桿菌，但該方法耗時較長，一般需4~8周的時間，往往會造成病情的延誤，此外，該方法無法用于檢測菌陰性肺結(jié)核，因此使用起來也具有很大局限性。結(jié)核菌素皮膚試驗(PH))，其基本原理是通檢測感染者對結(jié)核菌素皮內(nèi)接種所引起的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(IV型超敏反應(yīng))，反應(yīng)越強，表示結(jié)核感染可能性越大，但由于pro中含有許多分枝桿菌(包括致病性分枝桿菌、環(huán)境中非致病性分枝桿菌和卡介苗)共同的抗原，PPD皮試陽性并不能鑒別是因為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染，還是接觸環(huán)境中非結(jié)核分枝桿菌或卡介苗接種后造成的致敏。因此，pro皮試診斷結(jié)核病的特異性差，用該方法進行結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查獲得的結(jié)核菌感染率是不準確的，并不能真正反映人群中結(jié)核菌感染的實際狀況。
[0004]結(jié)核感染的血清學(xué)檢測是通過測定結(jié)核抗原特異性的IgG、IgM及IgA抗體發(fā)展起來的免疫學(xué)診斷方法，該方法簡便易行，快速又無需特殊精密儀器，不但可以用于診斷肺結(jié)核，也可用于肺外結(jié)核感染的診斷，對于結(jié)核感染的初篩及鑒定具有重要意義。但是目前，結(jié)核血清學(xué)檢測技術(shù)中存在的主要問題是如何結(jié)核特異性抗原的選擇和使用，目前常用的抗原成份主要包括LAM抗原、A60、38kD、14KD、TBGL抗原、Ag85、早期分泌抗原ESAT6和組織培養(yǎng)離析蛋白CFP - 10等；但是，在結(jié)核血清學(xué)診斷過程中，使用上述單一抗原成份所取得的檢測結(jié)果并不理想，使用多種“雞尾酒”抗原診斷，則有助于提高結(jié)核血清學(xué)診斷的特異性和敏感性；此外，選擇結(jié)核分枝桿菌特異性的抗原成份，以排除環(huán)境中非致病性分枝桿菌和卡介苗交叉抗原的污染，也有利用于進一步提高血清學(xué)診斷的敏感性和特異性。結(jié)核特異性抗原誘導(dǎo)的干擾素釋放實驗(IGRA)，是國際上近年來發(fā)展起來的針對結(jié)核菌特異性的T淋巴細胞的一種檢測手段，主要的原理是通過體外分離PBMC，經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激，通過檢測淋巴細胞釋放IFN - Y 的水平，從而判定機體是否受到結(jié)核分枝桿菌的感染，該方法對于菌陰性結(jié)核、肺外結(jié)核以及隱性結(jié)核的感染，具有重要的診斷意義。目前國際上新發(fā)展起來的結(jié)核桿菌感染的體外篩選技術(shù)，主要使用了這一技術(shù)原理。其中分別包括來自英國的T.SPOT.TB系統(tǒng)和來自于澳大利亞的QuaitiFERON -TB Gold系統(tǒng)，兩種技術(shù)主要使用了兩種結(jié)核相關(guān)抗原，ESAT6抗原和CFP - 10抗原，其檢測敏感性分別為88%和76%，以上述兩種抗原為基礎(chǔ)發(fā)展結(jié)核的體外診斷技術(shù)，雖然具有較好的應(yīng)用前景，但如需進一步提高結(jié)核感染的診斷效率，還依賴于獲得新的、更為特異性的結(jié)核分枝桿菌的抗原成份。
[0005]ESPC抗原，是一種結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生的特異性分泌抗原成份，與ESAT6抗原和CFP - 10抗原相類似，ESPC抗原也是受RDl基因區(qū)調(diào)控的；ESPC抗原具有多個重要的抗原表位，可以被CD4+及CD8+T淋巴細胞所識別，與其他的結(jié)核分枝桿菌抗原相比，ESPC抗原的抗原特異性表現(xiàn)的更強，研究發(fā)現(xiàn)，ESPC抗原與卡介苗BCG抗原無明顯的共同抗原成份。ESPC抗原是一種免疫優(yōu)勢抗原，無論是對于活動性肺結(jié)核，還是隱性肺結(jié)核，在ESPC抗原的刺激下，機體所產(chǎn)生的結(jié)核特異性CD4+T淋巴細胞都可以大量分泌干擾素及白細胞介素2，從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫保護；因此，以ESPC抗原為基礎(chǔ)，可以開展出用于診斷結(jié)核感染的檢測試劑盒。如將ESPC抗原與其他結(jié)核特異性抗原配合使用，可以顯著提高結(jié)核感染的診斷效率，提高其檢測的敏感性和特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白，本發(fā)明的另一目的是提供該結(jié)核分技桿菌重組蛋白在制備檢測試劑盒中的應(yīng)用。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種編碼結(jié)核分技桿菌重組蛋白ESPC的重組DNA,其DNA序列如圖1或SEQ ID N0.1所示，其所編碼的結(jié)核分枝桿菌重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]本發(fā)明提供了一種結(jié)核分枝桿菌的重組蛋白表達載體，其含有圖1或SEQ IDN0.1所示的重組DNA。
[0009]本發(fā)明提供了一種結(jié)核分枝桿菌的重組蛋白表達載體pET - 32a - ESPC，其結(jié)構(gòu)如圖2所示，該表達載體的建立是通過將圖1所示的ESPC的重組DNA克隆到pET32a表達載體中制備而成。
[0010]本發(fā)明建立了一種用于制備ESPC抗原的方法，通過將表達載體pET - 32a - ESPC轉(zhuǎn)化受體菌BL - 21(DE3)，通過IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)金屬螯合層析及凝膠過濾層析分離，可制備出ESPC重組抗原。
[0011]本發(fā)明還提供包含有ESPC抗原的組合物或檢測試劑盒，所述組合物或檢測試劑盒可用于結(jié)核感染的檢測。
[0012]本發(fā)明具體技術(shù)方案如下:
[0013](I)ESPC基因的獲取:根據(jù)GeneBank登陸的人結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組序列(G1:448814763)為模板，設(shè)計并合成針對ESPC基因的特異性引物，用于擴增ESPC基因片段；其中，引物Pl (SEQ ID N0.3)和P2 (SEQ ID N0.4)分別帶有Eco I和Hind III的酶切位點，其序列如下:
[0014]引物Pl:GGAATTCCATATGACGGAAAACTTGACCGTCCAG
[0015]Eco I
[0016]引物P2: CCCAAGCTTTCAGGTAAACAACCCGTCGATAGC
[0017]Hind III
[0018]PCR反應(yīng)的總體系為50ul，體系如下:10 X PCR擴增緩沖液IOul，4種dNTP混合物各 200umol/L,引物各 IOOpmol,模板 DNAlug, Taq DNA 聚合酶 2.5u, Mg2+lmmol/L ;反應(yīng)條件為，95 °C預(yù)變性5分鐘后，再按下列參數(shù)進行PCR擴增反應(yīng)，具體條件為:94°C 45sec, 55°C 45sec, 72°C 90sec,共進行30個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后繼續(xù)在72°C延伸lOmin，利用1%的瓊脂糖凝對其進行分析鑒定。
[0019](2)表達載體的構(gòu)建:以上述反應(yīng)條件為基礎(chǔ)，擴增ESPC基因，將擴增產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收(Qiagen公司生產(chǎn))，將ESPC基因用Eco I及Hind III酶進行切割，后插入到原核表達載體pET32a的相應(yīng)位點中，制備出重組表達質(zhì)粒pET - 32a - ESPC,該載體攜帶有ESPC基因與trxA基因的融合序列；
[0020](3)ESPC重組抗原的表達:將重組表達質(zhì)粒pET -32a -ESPC轉(zhuǎn)入受體菌BL21 (DE3)中，在2YT培養(yǎng)基中，在37°C中搖瓶中以IlOrpm的速度連續(xù)震蕩培養(yǎng)至0D600達到1.5，加AlmM IPTG繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心收集細菌，用含有20mM Ifepes的pH7.5TBS緩沖液洗滌后，再用超聲波破碎細菌，5000rpm離心10分鐘，收集菌體蛋白懸液；
[0021 ] (4) ESPC重組抗原的純化:利用Qiagen公司生產(chǎn)的N1- NTA固定化金屬螯合層柱，按照產(chǎn)品說明書要求，采用親和層析法，分離ESPC重組抗原；得到的純化蛋白經(jīng)Millipore的蛋白超濾系統(tǒng)超濾濃縮后，再用GE公司生產(chǎn)的AKTA蛋白層析系統(tǒng)，經(jīng)Sephacryl S - 100柱層析進行蛋白的再次分離純化,收集目標蛋白。
[0022](5)ESPC重組抗原的鑒定:利用Pierce公司生產(chǎn)的BCA(BicinChoninic Acid)試劑盒，通過570nm分光光度儀對其進行測定，鑒定蛋白濃度；利用聚丙烯酰胺凝膠電脈技術(shù)及Western blotting技術(shù),對制備出的ESPC重組蛋白進行純度鑒定及特異性鑒定；
[0023](6)結(jié)核細胞免疫功能的檢測:以ESPC重組蛋白為目標抗原，通過抗原誘導(dǎo)的T細胞激活及干擾素的產(chǎn)生，對待測結(jié)核血液標本進行分析測定，具體的方法參見實施例1 ;
[0024](7)結(jié)核血清抗體的檢測:以ESPC重組蛋白為目標抗原，通過直接包被ELISA板，可以特異性地檢測結(jié)核分枝桿菌感染者血清IgG抗體，用于進行結(jié)核感染的血清學(xué)檢測，具體的方法參見實施例2 ；
[0025]以上檢測操作方法與現(xiàn)有的技術(shù)操作基本相同，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0026]1、提供的ESPC抗原為結(jié)核特異性抗原，該抗原成份與卡介菌BCG不具備共同抗原成份，因此不會發(fā)生交叉反應(yīng)；
[0027]2、重組ESPC抗原具有多個T細胞免疫的識別表位，可以誘導(dǎo)抗原特異性T淋巴細胞的活化，從而判定結(jié)核的感染，特別是針對結(jié)核的隱性感染；
[0028]3、制備的重組ESPC抗原為一種融合蛋白，含有ESPC優(yōu)勢抗原序列及Trx.Tag、His.Tag兩種純化標簽，便用對表達產(chǎn)物進行純化鑒定；
[0029]4、重組ESPC抗原具有多個體液免疫反應(yīng)的識別位點，可以用于檢測結(jié)核分枝桿菌抗原特異性的血清IgG抗體，本方法的建立可以為其他試劑盒的開發(fā)提供一種方便、高靈敏度、準確性和穩(wěn)定性的免疫檢測方法，該方法使用儀器簡單，技術(shù)操作相對容易掌握。
[0030]SEQ ID N0.1、ESPC基因的核苷酸序列:
【權(quán)利要求】
1.一種編碼結(jié)核分枝桿菌重組抗原ESPC的重組DNA，其特征在于所述重組DNA的序列如 SEQ ID N0.1 所示。
2.一種結(jié)核分枝桿菌重組抗原ESPC，其特征在于所述重組抗原ESPC的氨基酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
3.—種表達載體，其特征在于其含有如權(quán)利要求1所述的重組DNA。
4.一種如權(quán)利要求3所述的表達載體，其特征在于所述表達載體是pET-32a-ESPC，其通過將SEQ ID N0.1所示DNA克隆到pET32a表達載體的Eco I和Hind III酶切位點制備--? 。
5.一種用于制備權(quán)利要求1所述重組DNA的方法，其特征在于，以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組序列為模板，用引物Pl和Ρ2進行PCR擴增，其中引物Pl和Ρ2的序列如下:
引物 Pl:GGAATTCCATATGACGGAAAACTTGACCGTCCAG
引物 P2: CCCAAGCTTTCAGGTAAACAACCCGTCGATAGC ?
6.一種用于制備如權(quán)利要求2所述結(jié)核分枝桿菌重組抗原ESPC的方法，其特征在于通過將如權(quán)利要求3或4所述表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過異丙基硫代_β -D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，經(jīng)金屬螯合層析及凝膠過濾層析分離而制備獲得。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌為BL-21(DE3)。
8.一種組合物，其特征在于包含如權(quán)利要求2所述結(jié)核分枝桿菌重組抗原ESPC。
9.一種試劑盒，其特征在于包含如權(quán)利要求2所述結(jié)核分枝桿菌重組抗原ESPC。
10.如權(quán)利要求1所述重組DNA或者如權(quán)利要求2所述結(jié)核分枝桿菌重組抗原ESPC用于制備檢測結(jié)核分枝桿菌感染的試劑、組合物或試劑盒的用途。
【文檔編號】C12N15/70GK103525829SQ201310422989
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月16日
【發(fā)明者】王宏偉, 高千, 張俠, 蘇忠蘭, 易龍, 丁一冰, 田曼 申請人:南京大學(xué)（蘇州）高新技術(shù)研究院