微生物的乙醇生產(chǎn)的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本公開(kāi)涉及用于工程化光合自養(yǎng)的生物體以轉(zhuǎn)化二氧化碳和光成為脂肪酸酯和其他分子(包括生物燃料)的方法和組合物。所述分子然后由該生物體分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。
【專(zhuān)利說(shuō)明】微生物的乙醇生產(chǎn)
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年9月3日的200980145256.9號(hào)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)(名稱(chēng)為“微生物的乙醇生產(chǎn)”)的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本公開(kāi)涉及用于工 程化光合自養(yǎng)生物體以轉(zhuǎn)化二氧化碳和光成為脂肪酸酯和其他分子的方法和組合物，所述脂肪酸酯和其他分子然后由該生物體分泌到培養(yǎng)基中。
[0003]序列表的引用
[0004]本申請(qǐng)包含通過(guò)EFS-Web提交的序列并在此通過(guò)引用完整引入。在2009年10月7日產(chǎn)生的ASCII版本名稱(chēng)為“16020_PCT_SL.txt”，列出了 29個(gè)序列，文件大小為95kb。
【背景技術(shù)】
[0005]光合作用是生物實(shí)體利用陽(yáng)光和二氧化碳產(chǎn)生糖以獲取能量的過(guò)程。由于自然進(jìn)化，光合作用是一個(gè)具有眾多且知之甚少的反饋回路、控制機(jī)制和過(guò)程無(wú)效(process inefficiency)的極其復(fù)雜的系統(tǒng)。這個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)對(duì)于單因子輪換(one-factor-at-a-time)和全局優(yōu)化法都呈現(xiàn)出可能無(wú)法逾越的障礙[Nedbal等，Photosynth Res., 93 (1-3):223-34 (2007) ；Salvucci 等，Physiol Plant.，120 (2):179-186(2004) ;Greene 等，Biochem J.,404(3):517-24 (2007)]。
[0006]現(xiàn)有的光合自養(yǎng)生物體(如植物、藻類(lèi)和光合細(xì)菌)很難適用于工業(yè)生物加工,并因此沒(méi)有顯示出針對(duì)這一目的的商業(yè)可行性。與工業(yè)化異養(yǎng)生物體如大腸桿菌(20分鐘)相比，這類(lèi)生物體具有緩慢的倍增時(shí)間(3-72小時(shí))，這反應(yīng)出低下的總生產(chǎn)力。此外，遺傳操作技術(shù)(敲除、經(jīng)整合或游離Gpisomic)質(zhì)粒擴(kuò)增的轉(zhuǎn)基因的過(guò)表達(dá))是低效、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的或不存在的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本文所述的發(fā)明確認(rèn)了賦予光合自養(yǎng)生物體直接產(chǎn)生碳基產(chǎn)物的能力的途徑和機(jī)制。所獲得的產(chǎn)生碳基產(chǎn)物的工程化光合自養(yǎng)生物特別地能夠直接從二氧化碳和光高效地產(chǎn)生碳基產(chǎn)物，無(wú)需目前從生物質(zhì)源(包括玉米、甘蔗、芒草、纖維素等)產(chǎn)生生物燃料和生物化學(xué)產(chǎn)品所必需的費(fèi)時(shí)的和昂貴的處理步驟。因此，本發(fā)明的新型微生物能夠通過(guò)固定二氧化碳合成從各種生物合成途徑獲得的碳基目的產(chǎn)物，還能釋放這類(lèi)產(chǎn)物。
[0008]這類(lèi)產(chǎn)物的范圍包括醇類(lèi)，如乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、脂肪醇、脂肪酸酯、蠟酯；烴和鏈烷烴，如丙烷、辛烷、柴油、JP8 ;聚合物如對(duì)苯二甲酸酯、I，3-丙二醇、I，4- 丁二醇、多元醇、PHA, PHB、丙烯酸鹽、己二酸、ε -己內(nèi)酯、異戊二烯、己內(nèi)酰胺、橡膠；商用化學(xué)品如乳酸鹽、DHA、3-羥基丙酸鹽、Y-戊內(nèi)酯、賴(lài)氨酸、絲氨酸、天門(mén)冬氨酸鹽、天門(mén)冬氨酸、山梨醇、抗壞血酸鹽、抗壞血酸、異戊烯醇、羊毛留醇、ω-3?ΗΑ、番茄紅素、衣康酸鹽、1，3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、檸檬酸、谷氨酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、ΗΡΑ、乳酸、THF、Y-丁內(nèi)酯、吡咯烷酮、羥丁酸鹽、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸；特種化學(xué)品如類(lèi)胡蘿卜素、類(lèi)異戊二烯、衣康酸；藥物或藥物中間體，如7-ADCA/頭孢菌素、紅霉素、聚酮、抑制素(statin)、紫杉醇、多烯紫杉醇、萜烯、肽、類(lèi)固醇、ω-脂肪酸和其它這類(lèi)適合的目的產(chǎn)物。這些產(chǎn)物可用于燃料、生物燃料、工業(yè)和特種化學(xué)品、添加劑、作為用于制造其他產(chǎn)品(如營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)保健品、聚合物、石蠟替代品，個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品和藥物)的中間體。這些化合物也可以用作隨后反應(yīng)(例如，酯交換反應(yīng)、氫化作用、經(jīng)氫化、熱裂解或兩者結(jié)合的催化裂解或者環(huán)氧化反應(yīng))以產(chǎn)生其他產(chǎn)品的原料。
[0009]還公開(kāi)了選擇和利用各種生物體直接將太陽(yáng)光和二氧化碳轉(zhuǎn)化成碳基產(chǎn)物的方法。本發(fā)明的一方面提供了一種引入編碼一個(gè)或多個(gè)能夠固定二氧化碳以產(chǎn)生和(在一些實(shí)例中)排出或分泌碳基目的產(chǎn)物(如乙醇、乙烯、烴、乙基酯和甲基酯)的蛋白質(zhì)的工程核酸序列的方法。本文提供的顯著特征是，該微生物可優(yōu)選地以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)各種碳基目的產(chǎn)物，而無(wú)需可再生的碳基中間體或源(如生物質(zhì))作為起始原料。
[0010]為產(chǎn)生至少一種所需的碳基目的產(chǎn)物如烴，利用了各種能夠固定二氧化碳的生物體(例如那些能夠進(jìn)行光合作用的生物體)或可選擇地經(jīng)工程化以固定二氧化碳的生物體。例如，光合自養(yǎng)生物體包括真核植物和藻類(lèi)，以及原核藍(lán)細(xì)菌、綠色硫細(xì)菌、綠色非硫細(xì)菌、紫色硫細(xì)菌和紫色非硫細(xì)菌。
[0011]在一個(gè)方面中，能夠固定二氧化碳的宿主細(xì)胞被工程化以產(chǎn)生具有希望數(shù)目的碳的碳基產(chǎn)物。優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞以商業(yè)規(guī)模產(chǎn)生各種碳基目的產(chǎn)物。
[0012]在其它的實(shí)例中，經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞是用編碼參與涉及產(chǎn)物或中間體產(chǎn)生的生物合成途徑的單個(gè)蛋白質(zhì)的外源核酸序列遺傳修飾的。在其它實(shí)施方式中，經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞是用編碼參與涉及產(chǎn)物或中間體產(chǎn)生的生物合成途徑的兩個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)(例如，生物合成途徑中的第一和第二個(gè)酶)的外源核酸序列遺傳修飾的。
`[0013]在另一方面中，本發(fā)明提供了能夠固定二氧化碳的宿主細(xì)胞，其產(chǎn)生乙烯。該宿主細(xì)胞可以包含編碼乙烯形成酶，efe，的外源核酸。該乙烯形成酶，efe，可以包括雷爾氏菌乙烯形成酶。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方式中，這樣一種碳基目的產(chǎn)物是乙醇。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞產(chǎn)生商業(yè)產(chǎn)量的乙醇。還提供了一種利用生物體以商業(yè)規(guī)模直接將陽(yáng)光、水和二氧化碳轉(zhuǎn)換成乙醇的方法。另外公開(kāi)了一種將產(chǎn)生的乙醇以及與乙醇的產(chǎn)生相關(guān)的吸收的二氧化碳貨幣化的方法。
[0015]在某些方面中，乙醇產(chǎn)生通過(guò)在光照下將碳引導(dǎo)離開(kāi)糖原并朝向丙酮酸等進(jìn)行優(yōu)化。糖原通常是在光中形成的，并在黑暗中消耗以減少能量。在一個(gè)實(shí)施方式中，糖原合成基因被弱化或敲除，和在其它實(shí)施方式中，使糖酵解基因成為組成型的。在其他方面中，消除了某些發(fā)酵途徑，如產(chǎn)生乙酸、乳酸、琥珀酸等的途徑(如果存在)。
[0016]進(jìn)一步在其他方面中，如果實(shí)施光-暗周期，糖原產(chǎn)生在光照過(guò)程中被優(yōu)化(與生物量等相反)，并以干細(xì)胞重量(可以為糖原)的％增加(即，該細(xì)胞經(jīng)工程化以打破阻止細(xì)胞增長(zhǎng)全糖原的任何限制)。然后，在黑暗中，使得從積累的糖原進(jìn)行乙醇合成，已弱化或敲除了其它發(fā)酵途徑。此外，公開(kāi)了采用與糖原合成/代謝率相匹配的光暗周期以使浪費(fèi)的時(shí)間最少(糖原未消耗且細(xì)胞非生產(chǎn)性地保持在黑暗中，或者在黑暗階段中有太多糖原完全消耗)。
[0017]在本發(fā)明的各方面中，描述了用于產(chǎn)生糖的遺傳修飾的光合生物體。在某些實(shí)施方式中，產(chǎn)生了糖類(lèi)，如葡萄糖、果糖或其組合。優(yōu)選地，產(chǎn)生的糖通過(guò)單向運(yùn)輸?shù)鞍谆蜣D(zhuǎn)運(yùn)蛋白擴(kuò)散。在其它實(shí)施方式中，糖通過(guò)在產(chǎn)生3-磷酸甘油醛(3PGAL)的所選擇宿主細(xì)胞中表達(dá)酶來(lái)產(chǎn)生，并利用轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主動(dòng)運(yùn)輸。在再另外的實(shí)施方式中，光合生物體功能性地缺乏纖維素、糖原或蔗糖合成。所獲得的光合產(chǎn)物(如光合生物體產(chǎn)生的糖)可作為產(chǎn)生其它的碳基目的產(chǎn)物的原料或碳源。
[0018]在本發(fā)明的另一方面中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)麥芽糖的光合生物體。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了糖原水解酶的克隆基因，其使工程細(xì)胞將糖原水解為葡萄糖和/或麥芽糖并從細(xì)胞運(yùn)輸麥芽糖和葡萄糖。用于從細(xì)胞運(yùn)輸麥芽糖的酶包括用于麥芽糖運(yùn)輸?shù)娜~綠體麥芽糖排出泵=MEXl ;葡萄糖通透酶，低和高Km、葡萄糖:H+協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、葡萄糖/果糖通透酶、用于葡萄糖運(yùn)輸?shù)目偺?H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；和葡萄糖-6磷酸:Pi反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、用于葡萄糖-6-磷酸運(yùn)輸?shù)谋橇姿?磷酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是本發(fā)明可預(yù)想的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。
[0019]在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)對(duì)各種能夠固定二氧化碳的或者經(jīng)工程化以固定二氧化碳的生物體進(jìn)行工程化來(lái)產(chǎn)生烴。在一個(gè)實(shí)施方式中，該微生物引入了一個(gè)或多個(gè)編碼乙酰CoA =ACP?；D(zhuǎn)移酶活性(fabH)、乙酰CoA羧化酶活性(accBCAD)、丙二酰CoA =ACP?；D(zhuǎn)移酶活性(fabD)、3_酮酰-ACP合成酶活性(fabB)、3_酮酰-ACP還原酶活性(fabG)、3-羥酰-ACP脫水酶活性(fabA)、烯酰-ACP還原酶活性(fabl)、?；?ACP水解酶活性(FASl)、醛脫氫酶活性(adhA、adhB)、醇脫氫酶活性(ADH I)、烷烴1_單加氧酶活性(alkB)的外源核酸序列。
[0020]可以過(guò)表達(dá)以產(chǎn)生脂肪酸衍生物的其它基因?yàn)槔?，pdh, panK、aceEF(編碼丙酮酸和2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的EIp脫氫酶成分和E2p 二氫硫辛酰胺酰基轉(zhuǎn)移酶成分，登錄號(hào):NP_414656, NP_414657, EC:1.2.4.1.2.3.1.61，2.3.1.12)、accABCD/fabH/fabD/fabG/acpP/fabF(編碼 FAS，登錄號(hào):CAD85557，CAD85558, NP_842277, NP_841683,NP_415613, EC:2.3.1.180，2.3.1.39，1.1.1.100，1.6.5.3, 2.3.1.179)、編碼脂酰 CoA 還原酶(登錄號(hào):AAC45217， ECl.2.1.-)的基因、UdhA或類(lèi)似的基因(編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，登錄號(hào):CAA46822, EC:1.6.1.1)和編碼脂酰 CoA 還原酶(登錄號(hào):AAC45217, ECl.2.1.-)的基因。
[0021]與表達(dá)使得產(chǎn)生脂肪酸衍生物的外源核酸序列相反，宿主可以有一個(gè)或多個(gè)功能缺失或弱化的內(nèi)源性基因。例如，可以至少弱化ackA(EC2.7.2.1)、ackB(EC2.7.2.1)、adhE (ECl.1.1.1,1.2.1.10)、fabF(EC2.3.1.179)、fabR(登錄號(hào) NP_418398)、fadE (ECl.3.99.3，1.3.99.-)、GST (EC6.3.2.3)、gpsA (ECl.1.1.94)、IdhA (ECl.1.1.94)、pflB(EC2.3.1.54)、plsB(EC2.3.1.15)、poxB (ECl.2.2.2)、pta(EC2.3.1.8)、谷胱甘肽合成酶(EC6.3.2.3)及其組合。
[0022]這類(lèi)微生物可以經(jīng)工程化以產(chǎn)生具有限定碳鏈長(zhǎng)度、分支和飽和度的烴或脂肪酸。
[0023]在一些實(shí)施方式中，表達(dá)了由外源核酸序列編碼的肽類(lèi)(例如硫酯酶)以提供均質(zhì)的產(chǎn)物，這將降低與發(fā)酵和分離有關(guān)的整體成本。
[0024]在一些實(shí)施方式中，微生物包含一個(gè)或多個(gè)外源工程核酸，其編碼酰基CoA合成酶(EC6.2.1.3)、硫酯酶(EC3.1.2.14)、蠟合成酶(EC2.3.1.75)、醇乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC2.3.1.84)或其組合。在另外的實(shí)施方式中，微生物包含編碼硫酯酶(EC3.1.2.14)、?；鵆oA還原酶(ECl.2.1.50)、醇脫氫酶(EC1.1.1.1)、脂肪醇形成酰基CoA還原酶(EC1.1.1.*)或其組合的工程核酸。
[0025]在一些實(shí)施方式中，本文所述的微生物產(chǎn)生每升發(fā)酵培養(yǎng)基至少I(mǎi)mg的碳基目的產(chǎn)物，例如，烴。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，微生物產(chǎn)生至少100mg/L、500mg/L、I g/L、5g/L、10g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、50g/L、lOOg/L 或 120g/L 的烴。在一些實(shí)施例中，所述烴由微生物產(chǎn)生和釋放，且在另外的實(shí)施例中，微生物在產(chǎn)物分離之前被裂解。
[0026]在某些實(shí)施例中，所述烴包含至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34個(gè)碳長(zhǎng)的碳鏈。在一些實(shí)施例中，至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的制備的烴產(chǎn)物包含2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34個(gè)碳長(zhǎng)的碳鏈。在再另外的實(shí)施例中，至少60 %、70 %、80 %、85 %、90 %或95 %的脂肪酸衍生產(chǎn)物包含1、2、3、4或5個(gè)不飽和點(diǎn)。
[0027]如W02007/136762(通過(guò)引用以其整體和全面引入)所示，可對(duì)某些生物合成途徑工程化以產(chǎn)生脂肪醇和蠟/脂肪酸酯，各底物(乙酰-CoA、丙二酰-CoA、酰基-ACP、脂肪酸和酰基-CoA)各個(gè)產(chǎn)物(乙酰-CoA、丙二酰-CoA、?；?ACP、脂肪酸和?；?CoA)的轉(zhuǎn)化可以通過(guò)使用幾種不同的多肽(其為所示的酶類(lèi)的成員)而實(shí)現(xiàn)。
[0028]本文所述的宿主可以產(chǎn)生醇類(lèi)(短鏈、長(zhǎng)鏈、支鏈的或不飽和的)。這些醇可以直接被用作燃料或其可以被用于產(chǎn)生酯，即如上所述酯的A側(cè)。這種酯單獨(dú)地或與本文所述的其他脂肪酸衍生物結(jié)合是用作燃料。
[0029]類(lèi)似地，本文所述的微生物所產(chǎn)生的烴可用作生物燃料。這些基于碳?xì)浠衔锏娜剂峡梢员辉O(shè)計(jì)為包含分支點(diǎn)、限定的飽和度和特定的碳長(zhǎng)度。當(dāng)單獨(dú)地或與其他脂肪酸衍生物結(jié)合用作生物燃料時(shí)，烴可另外與添加劑或其它傳統(tǒng)燃料(醇類(lèi)、源自甘油三酯的柴油和基于石油的燃料)相結(jié)合。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種工程微生物宿主細(xì)胞，其中所述工程宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)工程核酸，并且其中所述工程宿主細(xì)胞能夠利用最少量的光能直接從二氧化碳和水合成碳基目的產(chǎn)物，和其中所述碳基目的產(chǎn)物選自于乙基酯、甲基酯、蔗糖、醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、脂肪醇、脂肪酸酯、蠟酯、烴、正鏈烷烴、丙烷、辛烷、柴油、JP8、聚合物、對(duì)苯二甲酸鹽、多元醇、1，3_丙二醇、1，4_ 丁二醇、PHA, PHB、丙烯酸鹽、己二酸、ε-己內(nèi)酯、異戊二烯、己內(nèi)酰胺、橡膠、乳酸鹽、DHA、3-羥基丙酸鹽、Y-戊內(nèi)酯、賴(lài)氨酸、絲氨酸、天門(mén)冬氨酸鹽、天門(mén)冬氨酸、山梨醇、抗壞血酸鹽、抗壞血酸、異戊烯醇、羊毛甾醇、co-3DHA、番茄紅素、衣康酸鹽、1，3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、檸檬酸、谷氨酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、ΗΡΑ、乳酸、THF、Y-丁內(nèi)酯、吡咯烷酮、羥丁酸鹽、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸、類(lèi)胡蘿卜素、類(lèi)異戊二烯、衣康酸、檸檬烯、藥物或藥物中間體、紅霉素7-ADCA/頭孢菌素、聚酮、抑制素、紫杉醇、多烯紫杉醇、萜烯、肽、類(lèi)固醇以及ω-脂肪酸。
[0031] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞所包含的工程核酸編碼乙烯形成酶(Efe)活性。在相關(guān)的實(shí)施方式中，該乙烯形成酶選自于菜豆暈疫病菌(Pseudomonas syringaepv.Phaseolicola)D13182、豌豆細(xì)菌性枯萎病菌(P.syringae pv.Pisi)AF101061 和青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)AL646053。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該工程核酸編碼密碼子優(yōu)化的雷爾氏菌(Ralstonia)乙烯形成酶。在相關(guān)的實(shí)施方式中，該密碼子優(yōu)化是對(duì)于大腸桿菌(Eschericia coli)密碼子選擇進(jìn)行的。在再另一相關(guān)的實(shí)施方式中，該工程核酸是 SEQ ID N0.7。
[0032]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的工程細(xì)胞產(chǎn)生高于每升發(fā)酵培養(yǎng)基約lmg、100mg、500mg、lg、5g、10g、20g、25g、30g、35g、40g、50g、100g、120g 或 150g 的量的乙烯。
[0033]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的工程細(xì)胞所包含的工程核酸編碼醇脫氫酶活性。在相關(guān)的實(shí)施方式中，該醇脫氫酶活性選自于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Z.mobiliS)adhI1、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌adhll TS42和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌adhB活性。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方式中，該工程核酸編碼NADPH依賴(lài)性醇脫氫酶活性。在再另一個(gè)實(shí)施方式中，其中該NADPH依賴(lài)性醇脫氫酶活性是穆?tīng)柺暇?Moorella) HUC22-1種adhA。
[0034]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的工程細(xì)胞所包含的工程核酸編碼丙酮酸脫羧酶活性。在相關(guān)的實(shí)施方式中，該丙酮酸脫羧酶活性選自于Z.palmae和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌pdc活性。
[0035]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的工程細(xì)胞在培養(yǎng)中能夠在72小時(shí)內(nèi)以每升培養(yǎng)基至少約249mg的產(chǎn)量產(chǎn)生乙醇。在另一些實(shí)施方式中，整個(gè)72小時(shí)內(nèi)的乙醇產(chǎn)量為至少約296mg/L。而在再另外的實(shí)施方式中，乙醇產(chǎn)量是介于約2.5至約5g/L培養(yǎng)基?小時(shí)之間。在另一些實(shí)施方式中，72小時(shí)后所述培養(yǎng)基中乙醒的水平為低于約14mg/L。在其它實(shí)施方式中，該細(xì)胞在培養(yǎng)中產(chǎn)生每OD至少約36mg/L的乙醇，或者每OD至少約47mg/L的乙醇。
[0036]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的工程細(xì)胞所包含的工程核酸編碼蛋氨酸合成酶活性。
[0037]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的工程細(xì)胞所包含的工程核酸編碼選自于大腸桿菌糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白UhpT(NP_418122.1)、擬南芥(A.thaliana)葡萄糖_6_磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GPTl (AT5G54800.1)和擬南芥葡萄糖_6_磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GPT2 (AT1G61800.1)的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。
[0038]在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的工程細(xì)胞所包含的工程核酸編碼選自于人(H.sapiens)葡萄糖_6_磷酸酶G6PC (P35575)、大腸桿菌葡萄糖_1_磷酸酶Agp (P19926)、陰溝腸桿菌(E.cloacae)葡萄糖_1_磷酸酶AgpE (Q6EV19)和大腸桿菌酸性磷酸酶YihX (P0A8Y3)的磷酸酶活性。
[0039]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的工程細(xì)胞所包含的工程核酸編碼選自于人葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 GLUT-1、-3 或-7 (Pl1166、Pl1169、Q6PXP3)、釀酒酵母(S.cerevisiae)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HXT-1、-4或-6(P32465、P32467、P39003)和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌葡萄糖單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glf(P21906)的葡萄糖/己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。在相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明的工程細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼葡萄糖/果糖:H+協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、集胞藻(Synechocystis)屬的種(P15729)的GlcP細(xì)菌GlcP、主要葡萄糖(或2-脫氧葡萄糖)吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GlcP Q7BEC、己糖(葡萄糖和果糖)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、惡性痕原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)097467的PfHTl、Glut_l轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或Glut-2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的工程核酸。
[0040]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明所提供的工程細(xì)胞中選自于纖維素合成酶、糖原合成酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖磷酸化酶、α-1,4-葡聚糖裂合酶和1，4-α -葡聚糖分支酶的酶活性弱化。在相關(guān)的方面中，該工程細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼磷酸酶或者己糖激酶活性的工程核酸。
[0041]在再另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含選自于α-，β_，Y-淀粉酶；葡糖淀粉酶；異淀粉酶；支鏈淀粉酶；麥芽糖轉(zhuǎn)葡糖基酶；淀粉_α -1，6-葡萄糖苷酶;磷酸化酶激酶和磷酸化酶的糖原水解活性的工程細(xì)胞。
[0042]在再另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生選自于葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、麥芽糖和麥芽糖磷酸的糖或糖磷酸酯的工程細(xì)胞。在相關(guān)的實(shí)施方式中，該細(xì)胞能夠產(chǎn)生高于其內(nèi)源性水平的糖或糖磷酸酯并將所述糖運(yùn)輸至細(xì)胞外。在再另一相關(guān)的實(shí)施方式中，該細(xì)胞產(chǎn)生的糖選自于包括葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、木糖、戊糖、鼠李糖和阿拉伯糖的糖類(lèi)。在某些方面中，本發(fā)明的工程細(xì)胞在培養(yǎng)中能夠以高于每升發(fā)酵培養(yǎng)基約 lmg、100mg、500mg、lg、5g、10g、20g、25g、30g、35g、40g、50g、100g、120g 或 150g 的量產(chǎn)生糖或糖磷酸酯。
[0043]在再另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的工程細(xì)胞包含編碼選自于乙酰CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶、AtoB, β -羥基丁基CoA脫氫酶、巴豆酸酶、CoA脫氫酶、CoA-?；┟摎涿?CoA-acylating aldehyde dehydrogenase) (ALDH)和醒醇脫氫酶，AdhE 活性的工程核酸。在再另一個(gè)實(shí)施方式中，該細(xì)胞包含編碼選自于2-脫氫-3-脫氧磷酸庚糖酸醛縮酶(2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase), aroF (EC2.5.1.54)、3_ 脫氧查尼酸合成酶，aroB(EC4.2.3.4)、3_脫氫奎尼酸脫水酶，aroD(EC4.2.1.10)、3_脫氫莽草酸脫水酶，quiC (EC4.2.1.η)、β -酮己二酸單酸 CoA 合成酶(β -ketoadipy1-CoA synthase)，pcaF(EC2.3.1.174)、β -酮己二酸 CoA 轉(zhuǎn)移酶，pcaIJ(EC2.8.3.6)、3_ 氧代己二酸烯醇內(nèi)酯水解酶，pcaL(EC3.1.1.24)、4_羧基粘康酸內(nèi)酯脫羧酶(4_carboxymuconolactonedecarboxylase), pcaL (EC4.1.1.44)、Y -羧基-順，順-粘康酸環(huán)異構(gòu)酶，pcaB (EC5.5.1.2)、原兒茶酸-3，4-加雙氧酶，pcaGH(ECl.13.11.3)、原兒茶酸 1，2_ 順-二氫二醇脫氫酶，tpaC(ECl.3.l.n)和對(duì)苯二甲酸1，2-雙加氧酶，tpaAB (ECl.14.12.15)的活性的工程核酸。在再另一個(gè)實(shí)施方式中，該細(xì)胞包含編碼選自于α-D-葡萄糖-6-磷酸酮醇異構(gòu)酶(alpha-D-glucose-6-phosphate ketol-1somerase)，PGIl (EC5.3.1.9)、D-甘露糖 _6_ 憐酸麗醇異構(gòu)酶(D-Mannose-6-phosphate ketol-1somerase), din9 (EC5.3.1.8)、D-甘露糖-6-磷酸1，6_磷酸變位酶，atpmm(EC5.4.2.8)、甘露糖-1-磷酸鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶(mannose-l-phosphate guany Iy I transferase), cyt (EC2.7.7.22)、GDP-甘露糖-3, 5_ 差向異構(gòu)酶，gme (EC5.1.3.18)、半乳糖-1-磷酸鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶，VTC2 (EC2.7.n.n)、L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶，VTC4(EC3.1.3.11)、1^-半乳糖脫氫酶4丨4633670出(:1.1.1.122)和L-半乳糖酸內(nèi)酯氧化酶，ATGLDH(EC1.3.3.12)的活性的工程核酸。
[0044]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的工程細(xì)胞包含編碼選自于C-16:1硫酯酶，fatB、丙二酸單酰CoA:ACP轉(zhuǎn)?；福琭abD、醇還原酶，acrl、脫羰基酶(decarbonylase),cerl的活性以及列于表11中的基因的工程核酸。
[0045]在再另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的工程細(xì)胞包含編碼選自于大腸桿菌tesA、大腸桿菌fadD和A.baylyi wax-dgat的基因的工程核酸。
[0046]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的工程細(xì)胞能夠產(chǎn)生鏈烷烴、鏈烯烴、甲基酯或乙基酷。
[0047]在某些其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的工程細(xì)胞包含編碼MEV途徑酶的工程核酸。在一些實(shí)施方式中，該MEV途徑酶選自于乙酰CoA硫解酶、HMG CoA合成酶、HMG CoA還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶和IPP異構(gòu)酶。
`[0048]在再另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的工程細(xì)胞包含編碼DXP途徑酶的工程核酸。在相關(guān)的實(shí)施方式中，該DXP途徑酶選自于1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶、4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇合成酶、4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇激酶、2C-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)焦磷酸合成酶(2C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase)、1-羥基 _2_ 甲基-2-(E)- 丁烯基-4-焦磷酸合成酶和異戊基/ 二甲基烯丙基焦磷酸合成酶。
[0049]在再另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的工程細(xì)胞包含編碼選自于高檸檬酸合成酶，lys21 (EC2.3.3.14)、高烏頭酸酶，lys4, lys3 (EC4.2.1.36)、同分異構(gòu)檸檬酸(homoisocitrate)脫氧酶，lysl2, lysll, IyslO (ECl.1.1.87)、2_ 氛基己二酸轉(zhuǎn)氛酶，aro8 (EC2.6.1.39)、磷酸甘油酸脫氫酶，serA (EC1.1.1.95)、磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶,serC(EC2.6.1.52)、磷酸絲氨酸磷酸酶，serB(EC3.1.3.3)、絲氨酸O-乙?；D(zhuǎn)移酶，AtSerat2 ； I (EC2.3.1.30)、半胱氨酸合成酶，AtlG55880 (EC2.5.1.47)、乙酰乳酸合成酶，ilvN, 11^出02.2.1.6)、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶，ilvC(ECl.1.1.86)、二羥酸脫水酶，ilvD (EC4.2.1.9)、纈氨酸轉(zhuǎn)氨酶，ilvE (EC2.6.1.42)、ACV 合成酶，Ava_1613 (EC6.3.2.26)、異青霉素-N合成酶，Ava_5009(ECl.21.3.1)，將N-[L_5-氨基_5_羧基戊?；?carboxypentanoyl) ] -L-半胱氨酰_D_繳氨酸和02轉(zhuǎn)化為異青霉素-N、異青霉素-N差向異構(gòu)酶，cefD(EC5.1.1.17)、頭孢菌素生物合成擴(kuò)環(huán)酶/羥化酶，cefEF(ECl.14.20.1，1.14.11.26)和脫乙酰頭孢菌素C乙?；D(zhuǎn)移酶，cefG(EC2.3.1.175)的活性的核酸。
[0050]在再另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的工程細(xì)胞包含編碼醇脫水酶活性(EC4.2.1.η)的核酸。在相關(guān)的實(shí)施方式中，該醇脫水酶活性選自具有EC編號(hào)4.2.1.2、4.2.1.3,4.2.1.4,4.2.1.11,4.2.1.17、4.2.1.55,4.2.1.33,4.2.1.34,4.2.1.35、
4.2.1.54,4.2.1.58,4.2.1.60,4.2.1.68,4.2.1.74 或 4.2.1.79 的醇脫水酶。在再另一個(gè)實(shí)施方式中，所述醇脫水酶是EC4.2.1.54。
[0051]在再其它的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的工程細(xì)胞能夠產(chǎn)生藥物或其中間體。在某些相關(guān)的實(shí)施方式中，所述藥物或其中間體以高于每升發(fā)酵培養(yǎng)基約lmg、100mg、500mg、lg、5g、10g、20g、25g、30g、35g、40g、50g、100g、120g 或 150g 的量產(chǎn)生。
[0052]在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的工程細(xì)胞能夠產(chǎn)生碳基目的產(chǎn)物，其包含選自于醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、脂肪醇、脂肪酸酯、蠟酯、乙基酯、甲基酯、烴、正鏈烷烴、丙烷、辛烷、柴油、JP8、聚合物、對(duì)苯二甲酸鹽、多元醇、1，3_丙二醇、1，4_ 丁二醇、PHA,PHB、丙烯酸鹽、己二酸、ε -己內(nèi)酯、異戊二烯、己內(nèi)酰胺、橡膠、乳酸鹽、DHA,3-羥基丙酸鹽、Y-戊內(nèi)酯、賴(lài)氨酸、絲氨酸、天門(mén)冬氨酸鹽、天門(mén)冬氨酸、山梨醇、抗壞血酸鹽、抗壞血酸、異戊烯醇、羊毛甾醇、《-3DHA、番茄紅素、衣康酸鹽、1，3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、檸檬酸、谷氨酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、ΗΡΑ、乳酸、THF、Y-丁內(nèi)酯、吡咯烷酮、羥丁酸鹽、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸、類(lèi)胡蘿卜素、類(lèi)異戊二烯、衣康酸、檸檬烯、藥物或藥物中間體、紅霉素7-ADCA /頭孢菌素、聚酮、抑制素、紫杉醇、多烯紫杉醇、萜烯、肽、類(lèi)固醇以及ω -脂肪酸的化合物。在某些實(shí)施方式中，該細(xì)胞產(chǎn)生的類(lèi)異戊二烯選自于異戊基焦磷酸酯(isopentylpyrophosphate) (IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAP)、單職、倍半職、二職、三萜、四萜和多萜。
[0053]在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的工程細(xì)胞包含的細(xì)胞選自于真核植物、藻類(lèi)、藍(lán)細(xì)菌、綠色硫細(xì)菌、綠色非硫細(xì)菌、紫色硫細(xì)菌、紫色非硫細(xì)菌、嗜極微生物(extremophile)、酵母、真菌、其工程生物體和合成生物體。在某些相關(guān)實(shí)施方式中，該細(xì)胞是光依賴(lài)性的或固定碳。在其他相關(guān)的實(shí)施方式中，該細(xì)胞有自養(yǎng)活性或光合自養(yǎng)活性。在其它實(shí)施方式中，該細(xì)胞在有光時(shí)為光合自養(yǎng)的，和在沒(méi)有光時(shí)為異養(yǎng)的或混合營(yíng)養(yǎng)的。在其他相關(guān)的實(shí)施方式中，該工程細(xì)胞是選自于擬南芥屬(Arabidopsis)、甜菜屬(Beta)、大豆屬(Glycine)、麻風(fēng)樹(shù)屬(Jatropha)、芒屬(Miscanthus)、黍?qū)?Panicum)、藹草屬(Phalaris)、楊屬(Populus)、甘鹿屬(Saccharum)、柳屬(Salix)、油錯(cuò)樹(shù)屬(Simmondsia)和玉蜀黍?qū)?Zea)的植物細(xì)胞。在再另外的相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明的工程細(xì)胞是藻類(lèi)和/或藍(lán)細(xì)菌生物體，選自于剌菊石屬(Acanthoceras)、Acanthococcus、Acaryochloris、曲殼藻屬(Achnanthes)、翼娃藻屬(Achnanthidium)、星形藻屬(Actinastrum)、Actinochloris、福環(huán)藻屬(Actinocyclus)、福射鼓藻屬(Actinotaenium)、雙金藻屬(Amphichrysis)、前溝藻屬(Amphidinium)、Amphikrikos、雙肋藻屬(Amphipleura)、苗形藻屬(Amphiprora)、分須藻屬(Amphithrix)、雙眉藻屬(Amphora)、魚(yú)腥藻屬(Anabaena)、項(xiàng)圈藻屬(Anabaenopsis)、暗額藻屬(Aneumastus)、針連藻屬(Ankistrodesmus)、錨藻屬(Ankyra)、異菱藻屬(Anomoeoneis)、虛幻球藻屬(Apatococcus)、束絲藻屬(Aphanizomenon)、隱球藻屬(Aphanocapsa)、隱毛藻屬(Aphanochaete)、隱桿藻屬(Aphanothece)、梨囊藻屬(Apiocystis)、頂絲藻屬(Apistonema)、四棘鼓藻屬(Arthrodesmus)、節(jié)方定藻屬(Artherospira)、Ascochloris、星桿藻屬(Asterionella)、星球藻屬(Asterococcus)、奧氏藻屬(Audouinella)、浮生直鏈藻屬(Aulacoseira)、桿狀藻屬(Bacillaria)、巴爾比亞藻屬(Balbiania)、似竹鼓藻屬(Bambusina)、紅毛菜屬(Bangia)、Basichlamys、串珠藻屬(Batrachospermum)、駢胞藻屬(Binuclearia)、角藻屬(Bitrichia)、盤(pán)苔屬(Blidingia)、Botrdiopsis、氣球藻屬(Botrydium)、葡萄藻屬(Botryococcus)、球葡萄藻屬(Botryosphaerella)、成胞藻屬(Brachiomonas)、短螺旋體屬(Brachysira)、海雹菜屬(Brachytrichia)、Brebissonia、毛鞘藻屬(Bulbochaete)、柱桿藻屬(Bumilleria)、擬桿藻屬(Bumilleriopsis)、美壁藻屬(Caloneis)、眉藻屬(Calothrix)、馬鞍藻 屬(Campylodiscus)、盒管藻屬(Capsosiphon)、四鞭藻屬(Carteria)、Catena、Cavinula、丁頁(yè)剌藻屬(Centritractus)、Centronella、角藻屬(Ceratium)、角毛藻屬(Chaetoceros)、Chaetochloris、硬毛藻屬(Chaetomorpha)、Chaetonella、毛絲藻屬(Chaetonema)、盾毛藻屬(Chaetopeltis)、膠毛藻屬(Chaetophora)、毛球藻屬(Chaetosphaeridlium)、管胞藻屬(Chamaesiphon)、輪藻屬(Chara)、Characiochloris、擬小粧藻屬(Characiopsis)、小粧藻屬(Characium)、輪藻目(Charales)、緣胞藻屬(Chilomonas)、厚胞藻屬(Chlainomonas)、Chlamydoblepharis、Chlamydocapsa、衣藻屬(Chlamydomonas)、ChlamydomonopsiS、衣粘藻屬(Chlamydomyxa、Chlamydonephris、Chlorangiella、擬綠囊藻屬(Chlorangiopsis)、小球藻屬(Chlorella)、綠葡萄藻屬(Chlorobotrys)、綠幅藻屬(Chlorobrachis)、綠點(diǎn)藻屬(Chlorochytrium)、綠球藻屬(Chlorococcum)、綠膠藻屬(Chlorogloea)、擬綠膠藻屬(Chlorogloeopsis)、綠梭藻屬(Chlorogonium)、綠帶藻屬(Chlorolobion)、擬衣藻屬(Chloromonas)、Chlorophysema、綠藻門(mén)(Chlorophyta)、綠膠囊藻屬(Chlorosaccus)、Chlorosarcina、Choricystis、色植藻屬(Chromophyton)、單鞭金藻屬(Chromulina)、擬色球藻屬(Chroococcidiopsis)、色球藻屬(Chroococcus)、色指藻屬(Chroodactylon)、藍(lán)隱藻屬
【權(quán)利要求】
1.一種生物生產(chǎn)乙醇的方法，包括:在光和無(wú)機(jī)碳的存在下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)工程化的光合微生物，其中所述光合微生物包含重組丙酮酸脫羧酶基因和重組醇脫氫酶基因，且其中所述重組丙酮酸脫羧酶基因和所述重組醇脫氫酶基因是差異表達(dá)的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中不同的啟動(dòng)子用于實(shí)現(xiàn)各重組基因的差異表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述重組基因之一由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制而所述重組基因之一由組成型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述重組醇脫氫酶基因的表達(dá)由組成型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述不同的啟動(dòng)子各自是組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述重組丙酮酸脫羧酶基因的表達(dá)由化學(xué)物質(zhì)影響的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是nirA。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述醇脫氫酶的活性通過(guò)控制醇脫氫酶所需的的輔助因子的水平來(lái)改變。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述光合微生物是嗜熱的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述重組醇脫氫酶基因編碼NADPH-依賴(lài)的醇脫氫酶。`
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述重組醇脫氫酶基因編碼穆?tīng)柺暇鶫UC22-1種 adhA。
12.—種工程化的光合微生物，其包含重組丙酮酸脫羧酶基因和重組醇脫氫酶基因，其中所述重組丙酮酸脫羧酶基因和所述重組醇脫氫酶基因是差異表達(dá)的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的工程化的光合微生物，其中不同的啟動(dòng)子用于實(shí)現(xiàn)各重組基因的差異表達(dá)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的工程化的光合微生物，其中所述光合微生物缺乏具有功能的乳酸脫氫酶基因或乳酸脫氫酶的酶活性。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的工程化的光合微生物，其中所述光合微生物就嗜熱微生物或聚球藻菌株。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的工程化的光合微生物，其中所述重組基因之一由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制而所述重組基因之一由組成型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的工程化的光合微生物，其中所述重組醇脫氫酶基因的表達(dá)由組成型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的工程化的光合微生物，其中所述不同的啟動(dòng)子各自是組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的工程化的光合微生物，其中所述重組丙酮酸脫羧酶基因的表達(dá)由化學(xué)物質(zhì)影響的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的工程化的光合微生物，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是nirA。
【文檔編號(hào)】C12P7/06GK103725717SQ201310404380
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2009年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2008年10月17日
【發(fā)明者】B·格林, N·雷帕斯, D·羅伯特森 申請(qǐng)人:焦耳無(wú)限科技公司