重組PRRS病毒HV-nsp29及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重組PRRS病毒HV-nsp29，該重組PRRS病毒的基因組cDNA序列為將序列表序列1自5’末端第1474—2055位的序列替換為序列表序列2自5’末端第814—1395位的序列；將序列表序列1自5’末端第7683—9527位的序列替換為序列表序列3自5’末端第158—2002位的序列得到的。與野生型PRRSV高致病毒株HV相比，該重組PRRS病毒在PAM上生長(zhǎng)的速度明顯下降，在豬體內(nèi)的致病力明顯減弱。經(jīng)其免疫后的小豬再次感染不同PRRS病毒后，精神狀態(tài)良好，食欲正常，且體內(nèi)PRRS病毒量顯著低于未經(jīng)免疫的小豬，說(shuō)明該重組PRRS病毒可以開(kāi)發(fā)為弱毒疫苗毒株。
【專(zhuān)利說(shuō)明】重組PRRS病毒HV-nsp29及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組PRRS病毒HV-nsp29及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 在生物體中，每種氨基酸至少對(duì)應(yīng)一個(gè)密碼子，最多的有六種對(duì)應(yīng)的密碼子， 編碼同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子。研究表明，生物體內(nèi)普遍存在同義密碼子 非均衡使用的現(xiàn)象，例如：某一物種或某一基因通常傾向于使用一種或幾種特定的同義 密碼子，這些密碼子被稱為最優(yōu)密碼子（optimal codon)，此現(xiàn)象被稱為密碼子偏好性 (codon bias)。同樣的，密碼子對(duì)的使用也有偏好性，但是密碼子對(duì)的偏好性并不依賴于密 碼子的偏好性。例如，精氨酸（arginine, Arg)可以被六種密碼子編碼，谷氨酸（glutamic acid, Glu)可以被兩種密碼子編碼，所以氨基酸對(duì)Arg-Glu可以被十二種同義密碼子對(duì)編 碼，如果根據(jù)密碼子的偏好性計(jì)算每個(gè)同義密碼子對(duì)在人類(lèi)基因組中的出現(xiàn)次數(shù)，那么理 論上密碼子對(duì)CGC-GAA的出現(xiàn)次數(shù)為2, 397次，但實(shí)際只出現(xiàn)了 268次，所以CGC-GAA在人 類(lèi)基因組中是非偏好性密碼子對(duì)；而密碼子對(duì)AGA-GAA編碼Arg-Glu的理論次數(shù)是2, 644 次，但其實(shí)際出現(xiàn)次數(shù)則是4, 195次，因此AGA-GAA是人類(lèi)基因組中的偏好性密碼子對(duì)。
[0003] 盡管到目前為止人們并不清楚密碼子對(duì)偏好性的形成原因，但是密碼子對(duì)的使用 卻是可以影響翻譯效率的。2008年，Coleman等人把脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus)的核 衣殼（capsid)基因進(jìn)行了突變，在不改變氨基酸序列及RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的前提下，在基因內(nèi) 進(jìn)行同義密碼子置換，使得偏好性的密碼子對(duì)被置換為非偏好性的密碼子對(duì)，化學(xué)合成突 變后的片段，然后利用反向遺傳學(xué)手段將合成的片段連入病毒全長(zhǎng)cDNA克隆，這種致弱病 毒的方法稱為合成病毒致弱工程（synthetic attenuated virus engineering, SAVE)。置 換后病毒capsid基因的翻譯速率顯著下降，并且含有突變序列的重組病毒在體外細(xì)胞上 的復(fù)制能力和在小鼠中的致病力都明顯降低，在攻毒試驗(yàn)中，重組病毒能夠有效的保護(hù)野 生型毒株對(duì)于免疫小鼠的再次感染。這種病毒弱化的方法具有廣泛的應(yīng)用性，2010和2013 年，分別有人用同樣的方法改造了流感病毒，獲得了致弱效果明顯的流感病毒弱毒株。最重 要的是，在這種致弱病毒的工程中，病毒的弱化是由成百上千個(gè)點(diǎn)突變引起的，因此其發(fā)生 返強(qiáng)的可能性極低。
[0004] 豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syn -drome, 簡(jiǎn)稱PRRS)，俗稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcinereproductive and respiratory syndrome viruse，PRRSV)引起的一種高發(fā)病率、高死亡率、低治愈率的豬病。 目前，世界上廣泛使用商品化的PRRS疫苗包括弱毒疫苗和滅活疫苗。滅活的PRRSV疫苗沒(méi) 有效果或者是只能對(duì)同源毒株的感染提供有限的保護(hù)；弱毒疫苗持續(xù)散播病毒，尤其有回 復(fù)突變以致毒力返強(qiáng)的可能性，弱毒疫苗的返強(qiáng)性一直是人們擔(dān)心的一個(gè)安全問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種可以作為弱毒疫苗毒株的重組PRRS病毒。
[0006] 本發(fā)明要求保護(hù)的重組PRRS病毒HV-nsp29,其基因組對(duì)應(yīng)的cDNA序列為將序列 表序列1自5'末端第1474- 2055位的序列替換為序列表序列2自5'末端第814 -1395 位的序列；將序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列替換為序列表序列3自5'末 端第158- 2002位的序列所獲得的序列。
[0007] 序列表序列1自5'末端第1474- 2055位的序列為序列表序列2自5'末端第 814-1395位的序列；序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列為序列表序列3自 5'末端第158- 2002位的序列的DNA片段，也是本發(fā)明需要保護(hù)的；
[0008] 同時(shí)，含有該片段的重組質(zhì)粒、重組菌或重組細(xì)胞，也是本發(fā)明需要保護(hù)的。具 體地說(shuō)，所述重組質(zhì)粒為將質(zhì)粒pcDNA3. I-HV中對(duì)應(yīng)于序列表序列1自5'末端第1474- 2055位的DNA片段替換為序列表序列2自5'末端第814-1395位的DNA片段，將質(zhì)粒 pcDNA3. I-HV中對(duì)應(yīng)于序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列替換為序列表序列 3自5'末端第158- 2002位的序列得到的質(zhì)粒。質(zhì)粒pcDNA3. I-HV是將序列表中的序列1 所示的HV毒株的基因組全長(zhǎng)序列克隆到了真核表達(dá)載體pcDNA3. 1中得到的。
[0009] 上述重組質(zhì)粒在制備重組PRRS病毒HV-nsp29或PRRS疫苗中的應(yīng)用，以及重組 PRRS病毒HV-nsp29在制備PRRS疫苗中的應(yīng)用，也是本發(fā)明需要保護(hù)的內(nèi)容。
[0010] 實(shí)驗(yàn)證明，將野生型PRRSV高致病毒株HV基因組的全長(zhǎng)CDNA克隆中對(duì)應(yīng)于序列 表序列1自5'末端第1474- 2055位的序列改造為序列表序列2自5'末端第814 -1395 位，將野生型PRRSV高致病毒株HV基因組的全長(zhǎng)cDNA克隆中對(duì)應(yīng)于序列表序列1自5'末 端第7683- 9527位的序列改造為序列表序列3自5'末端第158- 2002位后獲得的重組病 毒HV-nsp29,與野生型PRRSV高致病毒株HV相比，在PAM (豬肺泡巨噬細(xì)胞)上生長(zhǎng)的速度 均明顯下降。重組PRRS病毒HV-nsp29在豬體內(nèi)的致病力明顯減弱，且經(jīng)HV-nsp29免疫后 的小豬再次感染不同PRRS病毒后，小豬的精神狀態(tài)良好，食欲正常，健康，且體內(nèi)PRRS病毒 量顯著低于未經(jīng)免疫的小豬，說(shuō)明本發(fā)明所提供的重組PRRS病毒可以開(kāi)發(fā)為弱毒疫苗毒 株。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為重組PRRS病毒感染豬PAM細(xì)胞后不同時(shí)間的病毒滴度結(jié)果。
[0012] 圖2為重組PRRS病毒感染豬PAM細(xì)胞后84小時(shí)誘導(dǎo)的細(xì)胞病變結(jié)果。
[0013] 圖3為接種HV-wt或HV-nsp29后小豬的直腸溫度變化。
[0014] 圖4為接種HV-wt或HV-nsp29后小豬的存活率變化。
[0015] 圖5為接種HV-wt或HV-nsp29后小豬血清中PRRS病毒滴度變化。
[0016] 圖6為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)接種HV-wt或HV-nsp29兩周后小豬各組織的中PRRS 病毒滴度變化。
[0017] 圖7為接種HV-Wt或HV-nsp29兩周后小豬部分組織切片的蘇木精一伊紅染色結(jié) 果。
[0018] 圖8為免疫HV-nsp29和未免疫的小豬在接種不同PRRS病毒后的存活率變化。
[0019] 圖9為免疫HV-nsp29和未免疫的小豬在接種不同PRRS病毒后的直腸溫度變化。
[0020] 圖10為免疫HV-nsp29和未免疫的小豬在接種不同PRRS病毒后血清中PRRS病毒 滴度變化。
[0021] 圖11為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)免疫HV-nsp29和未免疫的小豬在接種不同PRRS 病毒兩周后小豬各組織的中PRRS病毒滴度變化。
[0022] 圖12為免疫HV-nsp29和未免疫的小豬血清中和抗體滴度變化。
[0023] 圖13為流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同PRRS毒株對(duì)免疫HV-nsp29和未免疫的小豬淋巴細(xì) 胞進(jìn)行再刺激后的INF γ和DC8+的水平。
[0024] 圖14為在PAM細(xì)胞上對(duì)HV-nsp29連續(xù)傳代過(guò)程中觀察細(xì)胞病變的部分結(jié)果。其 中，pi、PlO和p20分別代表第1、10和20代。
[0025] 圖15為第1代、第10代和第20代的HV-nsp29中的nsp2和nsp9基因的CPB值。 其中，pl、pl0和p20分別代表第1、10和20代。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0027] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028] 下述實(shí)施例中所用的野生型PRRSV高致病毒株HV :Genbank號(hào)為JX317648,公眾 可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0029] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如無(wú)特殊說(shuō)明，均為三次重復(fù)的平均值，并用t檢測(cè)進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P〈〇. 05時(shí)差異顯著。
[0030] 下述實(shí)施例中基因的CPB值等于基因內(nèi)每個(gè)密碼子對(duì)的CPS值的算術(shù)平均值，公 式為：。

【權(quán)利要求】
1. 一種重組PRRS病毒，其特征在于：該重組PRRS病毒的基因組對(duì)應(yīng)的cDNA序列為將 序列表序列1自5'末端第1474- 2055位的序列替換為序列表序列2自5'末端第814- 1395位的序列；且將序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列替換為序列表序列3 自5'末端第158- 2002位的序列所獲得的序列。
2. 權(quán)利要求1所述病毒在制備PRRS疫苗中的應(yīng)用。 3. DNA片段，其序列是將序列表序列1自5'末端第1474-2055位的序列替換為序列 表序列2自5'末端第814-1395位的序列；且將序列表序列1自5'末端第7683- 9527位 的序列替換為序列表序列3自5'末端第158- 2002位的序列得到的。
4. 權(quán)利要求3所述DNA片段在制備權(quán)利要求1所述重組PRRS病毒中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求3所述DNA片段在制備PRRS疫苗中的應(yīng)用。
6. 含有權(quán)利要求3所述DNA片段的重組質(zhì)粒、重組菌或重組細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組質(zhì)粒，其特征在于：所述重組質(zhì)粒為將質(zhì)粒pcDNA3. 1-HV 中對(duì)應(yīng)于序列表序列1自5'末端第1474- 2055位的DNA片段替換為序列表序列2自5'末 端第814-1395位的序列；將質(zhì)粒pcDNA3. 1-HV中對(duì)應(yīng)于序列表序列1自5'末端第7683- 9527位的序列替換為序列表序列3自5'末端第158- 2002位的序列。
8. 權(quán)利要求6或7所述重組質(zhì)粒在制備權(quán)利要求1所述重組PRRS病毒中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求6或7所述重組質(zhì)粒在制備PRRS疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/79GK104419687SQ201310394862
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】封文海, 高麗, 楊丙田, 王良海, 郭雪坤, 余志彬, 劉翼浩, 陳鑫鑫, 鄭世軍, 唐軍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)