一種類輔脂酶2基因的干擾片段及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種類輔脂酶2（colipase-like2，Clpsl2）的干擾片段及其應用，屬于生物技術(shù)與醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明檢測了Clpsl2mRNA和蛋白在附睪中的表達定位，發(fā)現(xiàn)Clpsl2在附睪頭部上皮細胞中合成，并分泌到管腔，與附睪管腔中的精子頭部的頂體和精子尾部的主段特異結(jié)合。公開了Clpsl2的干擾片段，其核苷酸序列為：5′-ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT-3′，在小鼠附睪中通過該干擾片段敲低Clpsl2表達后小鼠附睪尾部的精子數(shù)量減少、精子運動力減弱，且與雌鼠交配后孕鼠的胚胎數(shù)減少，且多個胚胎發(fā)育不正常，在雄性小鼠避孕藥制備及在小鼠精子成熟相關(guān)藥物制備中應用。
【專利說明】一種類輔脂酶2基因的干擾片段及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)與醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種類輔脂酶2 (colipase-like2,Clpsl2)基因的干擾片段及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]近幾年對人類的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，男性精液質(zhì)量和生殖力在逐步下降。據(jù)統(tǒng)計，在中國育齡夫婦中不孕不育的發(fā)病率為10-15%，其中男性因素占40%左右。臨床發(fā)現(xiàn)很多不孕不育病例與精子數(shù)量、密度、成熟(運動、獲能、頂體反應等)異常相關(guān)。另一方面，長期以來，避孕主要是針對育齡婦女，隨著國際人權(quán)條約的簽署，社會對男性避孕提出了倡導和要求，開發(fā)自主產(chǎn)權(quán)的男性避孕藥有利于中國在避孕藥市場上提高國際競爭力。
[0003]附睪是男性生殖器官中的重要環(huán)節(jié)之一，是精子儲存、運輸、成熟的關(guān)鍵場所。精子運動能力的形成、頂體功能的完善、代謝類型的轉(zhuǎn)變、精卵的識別和融合等一系列程序化成熟功能的獲得都是在附睪微環(huán)境中完成的。附睪中特異表達的蛋白將有助于解決精子成熟異常引起的不育、不孕癥。同時由于附睪功能相對單一，干擾其功能的藥物不至于引起嚴重的副反應；其次，精子進入附睪前，分化已經(jīng)完全，DNA復制及轉(zhuǎn)錄均停止，在這個階段藥物作用不會引起DNA遺傳病，因此附睪也是一個理想的避孕靶器官，而僅在附睪中表達的特異蛋白也成為男性避孕藥開發(fā)的理想靶點。
[0004]本發(fā)明所涉及的Clpsl2為一個功能未知的附睪特異表達的基因，其mRNA主要在附睪頭部組織表達，且具有雄激素依賴性和時間特異性。目前僅有兩篇文章略略提及Clpsl2，其一為oh等(2006) 在對40個附睪特異表達基因的mRNA表達特性進行分析時包含這個基因(Mm.99400);中科院生化所張永蓮院士(2008)通過建庫分析人的附睪特異表達基因也發(fā)現(xiàn)了這個基因(con32)在附睪頭部和體部表達。在前期我們通過原核表達制備了小鼠Clpsl2包涵體蛋白作為抗原免疫家兔制備了多克隆抗血清，也通過融合表達系統(tǒng)制備了 Clpsl2的蛋白初步分析了其輔脂酶活性。但是目前對Clpsl2的表達定位及在附睪體內(nèi)參與的生物學功能都不清楚，因此也限制了其開發(fā)使用。
[0005]雖然對附睪特異的Clpsl2的相關(guān)工作沒有開展，但是已經(jīng)有部分實驗室已經(jīng)開始探索附睪中特異表達的基因及蛋白的功能，在國際上享有盛名的就包括中科院生化所張永蓮院士團隊。他們對一系列的附睪特異表達基因的特性及功能進行了初步研究，如研究發(fā)現(xiàn)LCN6表達于附睪起始部位的大部分的主細胞，與精子的頂體及中段結(jié)合，參與了精子運動能力的獲得(史毅，大鼠附睪特異性基因Lcn6的表達特性和功能研究，中國科學院研究生院上海生命科學研究院博士學位論文，2007)。同時也對部分附睪特異功能基因及蛋白申請了專利用于保護其所發(fā)現(xiàn)的附睪特異基因或者蛋白在精子成熟中的功能(CN1689640)或者保護制備調(diào)控雄性生育能力用的藥物中、開發(fā)男性避孕藥及制備診斷和治療雄性不育癥的藥物中的用途(專利申請?zhí)?01010129861)。但目前雖然已對附睪中特異表達的部分基因及蛋白的功能解析，但用于雄性精液原因引起的不孕不育的診斷和治療，或者作為雄性避孕藥物設(shè)計的靶點開發(fā)相應的藥物都還處于設(shè)計階段。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種類輔脂酶2(colipase_like2, Clpsl2)基因的干擾片段。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供上述類輔脂酶2基因的干擾片段的用途。
[0008]本發(fā)明的目的通過下述的技術(shù)方案實現(xiàn):一種類輔脂酶2 (Clpsl2)基因的干擾片段，其核苷酸序列為:RNA1-Nol:5' -ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT-3'。
[0009]所述的類輔脂酶2 (Clpsl2)基因的干擾片段，能夠引起小鼠精子數(shù)量減少、精子的運動性能減弱和精子活性的降低，在雄性小鼠避孕藥制備及在小鼠精子成熟相關(guān)藥物制備中應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為Clpsl2mRNA在附睪組織中的原位雜交表達定位分析圖；Clpsl2蛋白在附睪頭部特異的表達，在附睪體、附睪尾及睪丸中無表達；途中深黑色表示Clpsl2的陽性表達信號。
[0011]圖2為Clpsl2蛋白在附睪組織區(qū)段性蛋白印跡檢測分析圖；Clpsl2蛋白在附睪頭部特異的表達，在附睪體、附睪尾及睪丸中無表達。
[0012]圖3為Clpsl2蛋白在附睪組織切片中的免疫組化分析圖；上圖為Clpsl2在整個附睪中的表達分布，且對應的A-D分別表示，A附睪頭近側(cè)端；B，附睪頭遠側(cè)端；C附睪體，D附睪尾，E為附睪頭部近側(cè)端(A)局部放大圖，F(xiàn)為陰性血清對照，箭頭標示Clpsl2陽性表達部位。
[0013]圖4為Clpsl2蛋白在附睪管腔區(qū)段濃度梯度分布的間接免疫熒光分析圖；上圖是附睪示意圖，A-H標示所拍攝的附睪組織的部位，A'、E'、G'和H'表示對應部位的陰性血清對照，Clpsl2用Cy3紅色熒光標記，圖中管腔中高亮信號為Clpsl2表達信號；而細胞核用DAPI染色，圖中管壁細胞可見DAPI信號。
[0014]圖5為Clpsl2蛋白與附睪管腔精子結(jié)合的間接免疫熒光分析圖；Clpsl2用Cy3紅色熒光標記，而細胞核用DAPI染色，可見Clpsl2在附睪頭和附睪體的精子的頭部頂體和尾部主段結(jié)合，附睪尾的精子與Clpsl2較附睪頭/體部位弱且少。
[0015]圖6為慢病毒介導的RNAi敲低小鼠附睪中Clpsl2表達的蛋白印跡檢測圖；Clpsl2的表達用抗Clpsl2的抗血清進行檢測，GAPDH為內(nèi)參對照。
[0016]圖7為慢病毒介導的RNAi敲低小鼠附睪中Clpsl2表達后的與雌鼠合籠后的胚胎檢測圖；敲低Clpsl2表達后，7天后與雌鼠交配，合籠后14天觀察胚胎變化，RNA1-N0.1靶標包裝的慢病毒敲低Clpsl2表達后,胚胎數(shù)量減少,有多個不正常的胚胎；RNA1-N0.2革巴標包裝的慢病毒敲低Clpsl2表達后胚胎數(shù)量沒有明顯差別，但胚胎發(fā)育遲緩。
【具體實施方式】[0017]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0018]本發(fā)明所選擇的KM小鼠購買于廣東省實驗動物中心，許可證號SCXK (粵)2008-0002。
[0019]上述本發(fā)明采用的慢病毒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司包裝。
[0020]實施例1:原位雜交檢測Clpsl2mRNA在附睪組織中的表達定位
[0021]用ApaI將含有Clpsl2基因的pGEM-T-Clpsl2載體(關(guān)藝青，禹艷紅，黃丹，潘善培.小鼠附睪特異性輔脂酶的原核表達及其抗體的制備[J].暨南大學學報(自然科學與醫(yī)學版)，2010，31 (2): 105-110.)質(zhì)粒線性化，酚氯仿純化后用Roche的地高辛探針標記試劑盒，通過SP6RNA聚合酶標記反義探針，以T7RNA聚合酶標記正義探針作為對照，乙醇沉淀，DEPC水溶解。
[0022]取8周齡性成熟小鼠附睪，放入質(zhì)量百分比4%多聚甲醛中，4°C固定2h，PBS洗3次，每次5min。然后加入質(zhì)量百分比30%蔗糖溶液，4°C放置至組織塊沉入底部。取出組織，加OCT包埋劑包埋，冰凍切片，切片厚度8 μ m，粘附于多聚L-賴氨酸處理過的載破片上。組織片經(jīng)蛋白酶K及乙酸酐-三乙醇胺預處理后，預雜交2h后加入在沸水中煮2min，變性的探針雜交過夜，次日多次洗滌后，用體積百分比2%綿羊血清封閉30min，然后加入抗Dig抗體(美國Roche公司)處理2h后，NBT/BCIP溶液顯色16h后在光學顯微鏡下拍照觀察，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Clpsl2mRNA主要在附睪頭部上皮細胞表達，在附睪體和附睪尾無Clpsl2mRNA表達，在附睪的整個管腔也無Clpsl2mRNA表達。表明Clpsl2mRNA主要在附睪頭部上皮細胞合成。[0023]實施例2:蛋白印跡檢測Clpsl2在附睪組織各區(qū)段中的表達
[0024]取8周齡性成熟小鼠，斷頸法迅速處死，立即分離附睪，剔除多余脂肪及結(jié)締組織后在預冷的PBS中洗滌，然后將附睪按頭、體、尾三部分分離。所取的各樣品按照質(zhì)量體積比1:10的比例加入終濃度為ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem,美國Merck Millipore公司)的Western及IP細胞裂解液(美津生物)，冰浴研磨。4°C 12，OOOrpm離心15min后取上清，用BAC蛋白定量試劑盒對各組織的總蛋白含量進行定量，然后進行按照濃縮膠濃度4%，分離膠濃度16%配制凝膠進行Tricine SDS-PAGE電泳。在無SDS的轉(zhuǎn)膜緩沖液中300mA恒流中轉(zhuǎn)膜35min后蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，質(zhì)量份數(shù)為5%脫脂奶粉溶液室溫封閉60min后加入用抗體稀釋液(Calbiochem，美國MerckMillipore公司)配置的體積百分比1:1000的兔源抗meClpsl多克隆抗血清(關(guān)藝青，禹艷紅，黃丹，潘善培.小鼠附睪特異性輔脂酶的原核表達及其抗體的制備[J].暨南大學學報(自然科學與醫(yī)學版)，2010，31 (2):105-110.)或者體積百分比1:2000鼠源GAPDH單克隆抗體(sigma)，4°C孵育過夜。次日，于室溫復溫60min。TBST洗膜3次，每次10_15min。用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG (體積比1:2000,檢測1116(:]81, sigma)或者辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgM (體積比1:1000, sigma)孵育60min。TBST洗膜3次，每次10-15min。用ECL化學發(fā)光檢測試劑盒(美國Thermo公司)檢測發(fā)現(xiàn),僅在附睪頭部組織能夠檢測到Clpsl2的表達，而在附睪體部和尾部通過蛋白印跡基本上檢測不到Clpsl2表達(圖 2)。
[0025]實施例3:免疫組化檢測Clpsl2蛋白在附睪中的表達定位
[0026]取附睪組織的冰凍切片，體積分數(shù)為3%過氧化氫孵育lOmin。于37°C濕盒內(nèi)體積分數(shù)為10%山羊血清封閉2-3h后用質(zhì)量份數(shù)為2%BSA配制的抗meClpsl多克隆抗血清(體積比1:500)4°C濕盒內(nèi)孵育過夜。次日用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(體積比1:300)37°C濕盒內(nèi)孵育lh。DAB顯色，蘇木素復染梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，用倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)在整個附睪頭部的管壁細胞中都能檢測到Clpsl2蛋白的表達，并且在頭部近側(cè)端(圖3A，F(xiàn))表達量明顯高于遠側(cè)端(圖3B)，附睪的近體部有少量Clps21蛋白的存在(圖3C)，但附睪尾部基本不見Clpsl2蛋白的表達(圖3D)。在附睪頭部、體部的管腔中，可以發(fā)現(xiàn)部分精子簇也有Clpsl2蛋白的存在。
[0027]實施例4:間接免疫熒光檢測Clpsl2蛋白在附睪管腔中的分布
[0028]將組織切片從_80°C冰箱取出；室溫放置30-60min后，PBS洗3次，每次5min ;用2%BSA-PBS液室溫封閉60min ;去除封閉液，滴加封閉液稀釋的一抗(抗meClpsl的抗血清1:200)，于41:過夜;PBS洗3次，每次5min ;加入Cy3標記的羊抗兔IgG (1:100，武漢博士德)，室溫孵育60min ;PBS洗3次，每次5min ;DAPI染核5min ;PBS洗3次，每次5min ;加入防突光淬滅劑，封片；于激光共聚焦掃描顯微鏡LSM700 (德國Zeiss公司)下鏡檢發(fā)現(xiàn)Clpsl2蛋白在管腔中的表達量隨著精子在管腔中的轉(zhuǎn)運逐漸降低，頭部最高，尾部基本檢測不到(圖 4)。
[0029]實施例5:間接免疫熒光檢測Clpsl2蛋白與精子的結(jié)合
[0030]取8周齡性成熟小鼠附睪，用預冷的PBS洗滌，將附睪分成頭部、體部和尾部后放入盛有精子培養(yǎng)液(123mmol/L NaCl, 4mmol/L KCl, 2mmol/L CaCl2,0.4mmol/L MgSO4,25mmol/L NaHCO3,0.3mmol/L Na2HPO4, 5mmol/L葡萄糖，12.5mmol/L乳酸納，0.5mmol/L丙麗酸鈉，4mg/ml BSA ；pH7.4)，輕擠精子，于37°C、體積分數(shù)為5%C02培養(yǎng)箱中靜置lOmin。小心吸出上層的精子，1，OOOrpm離心5min。棄去精子培養(yǎng)液,PBS洗3次,每次5min。加入預冷的質(zhì)量分數(shù)為2%多聚甲醛固定液4°C中固定30min后制備精子涂片。然后采用組織切片間接免疫熒光相類似的方法及抗體稀釋度進行間接免疫熒光檢測。在激光共聚焦掃描顯微鏡LSM700 (德國Zeiss公司)下對與Clpsl2結(jié)合的單精子進行拍照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)附睪頭部和體部的精子都能夠與Clpsl2結(jié)合，結(jié)合部位主要在精子頭部頂體部位和尾部主段(圖5)。精子頭部頂體參與到精卵結(jié)合的頂體反應，尾部與精子運動相關(guān)。Clpsl2與精子的結(jié)合特性表明Clpsl2參與到了精子成熟調(diào)控。
[0031]實施例6:靶向干擾Clpsl2的慢病毒載體構(gòu)建及病毒包裝
[0032]針對小鼠Clpsl2的核苷酸序列，設(shè)計了兩個RNAi靶位點(RNA1-Nol:ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT 和 RNAi_No2:GGGAGCCTGAACATCATGTGT)，合成互補的 siRNA 正義鏈和反義鏈，將退火后的寡核苷酸與pGLV-Hl-GFP+Pim)載體(上海吉瑪制藥有限公司)連接構(gòu)建慢病毒RNAi表達載體，然后與包裝質(zhì)粒PG - P1-VSVG, PG-P2-REV和PG-P3-RRE共同轉(zhuǎn)染HEK293FT細胞后制備并濃縮靶向干擾Clpsl2表達的慢病毒，病毒滴度均為5X 108TU/ml。
[0033]小鼠Clpsl2的核苷酸序列如下:
[0034]ATGGCATTCACTCAGGCCTTGGTCACCGTCCTGGCTTTGCTTGCTGGGACCCTGCCACACAGACACAGTGAAAACTCACCTCCCAAAAAGGCCAACGGAGACAAGTGTGTCCACCACACTCAGTGCTCCAGTGACTGTTGCCTCATAGACCTGGAGAGAAGCGGAGCCTTCTGCACCCCCAAGTCCCGCATAGGCATGGGGTGCTTGCCACAGACCAAGGGGAGCCTGAACATCATGTGTCCCTGTCGATCTGGCTTGAATTGTCATTCTAAGGACCCCACATGTCCCCGCCGATGTCAAATGATATAG
[0035]實施例7:小鼠附睪內(nèi)RNAi敲低Clpsl2表達的小鼠模型建立
[0036]實驗分為3組，分別為實驗組(RNA1-Nol、實驗組RNA1-No2和對照組RNA1-GFP。每組3只雄鼠,雙側(cè)注射相應病毒。病毒注射量為ΙΟμΙ。
[0037]選用5周齡的雄性小鼠，按照每公斤體重注射63mg的量腹腔注射質(zhì)量體積比為
1.4%的戊巴比妥鈉進行麻醉。待小鼠麻醉后(l_3min)，將其腹部的毛剪掉，并用酒精棉消毒。用眼科剪于腹部偏下剪開表層皮膚，找出睪丸，暴露出附睪頭部，用改造的鑷子固定住附睪頭部，將改造后的注射器的針頭插入到頭部，緩慢將病毒液注射到附睪頭部。分別縫合肌肉層和皮膚層，并用安而碘消毒。病毒注射7天后通過蛋白印跡檢測慢病毒介導的RNA干擾片敲低Clpsl2的表達效果(圖6)。結(jié)果表明兩個實驗組都能夠降低Clpsl2的蛋白表達，但以RNA1-Nol對Clpsl2的干擾效果最明顯。
[0038]實施例8:敲低Clpsl2表達后對小鼠精子成熟的影響
[0039]病毒注射7天后將雄鼠與雌鼠合籠，觀察雌鼠陰栓。合籠成功后分離雄鼠附睪，取附睪頭部和部分體部組織進行蛋白印跡檢測，附睪尾部分離精子觀察精子的形態(tài)變化、檢測精子運動性能和統(tǒng)計精子數(shù)量；合籠后14d，檢測孕雌鼠胚胎數(shù)。分離附睪尾部的精子于Iml精子培養(yǎng)液中，370C，體積分數(shù)為5%C02孵育lOmin，分別取10 μ I實驗組RNA1-Nol、實驗組RNA1-No2和對照組RNA1-GFP的精子，將其稀釋100倍，進行精子計數(shù)。實驗組RNA1-Nol精子數(shù)為0.87 X IO7個/ ml ;實驗組RNAi_No2精子數(shù)為1.0X IO7個/ml ;對照組RNA1-GFP的精子數(shù)1.6X IO7個/ml。表明經(jīng)Clpsl的干擾片段RNA1-Nol敲低Clpsl2后小鼠精子數(shù)量減少。
[0040]分別取實驗組RNA1-No1、實驗組RNAi_No2和對照組RNA1-GFP的精子液10 μ I涂于載玻片上(37°C預熱)，在光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組RNA1-GFP組相比，實驗組RNA1-Nol組和RNA1-No2組的精子前向性運動明顯減弱，多數(shù)精子處在尾部擺動狀態(tài)，且實驗中RNA1-Nol組的精子尾部擺動稍微弱一些，且大部分精子頭部處于靜息狀態(tài)。表明經(jīng)Clpsl的干擾片段RNA1-Nol敲低Clpsl2表達后精子的運動性能減弱。
[0041]雌鼠交配成功后，待受精卵發(fā)育為中期胚胎時，將雌鼠脫白處死，觀察胚胎有無異形并進行計數(shù)。敲低Clps2表達后，實驗組RNA1-Nol和實驗組RNAi_No2組均出現(xiàn)不正常胚胎，而對照組RNA1-GFP胚胎均正常(圖7)。且實驗組RNA1-Nol出現(xiàn)不正常胚胎的數(shù)量及畸形度明顯高于實驗組RNA1-No2.。表明經(jīng)Clpsl的干擾片段RNA1-Nol敲低Clpsl2表達后精子的活性有了明顯的降低。
[0042]從以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)Clpsl2在精子成熟中發(fā)揮重要的作用。Clpsl2特異結(jié)合精子頂體部位和尾部主段，參與了頂體結(jié)構(gòu)功能完善和精子運動性能的獲得。Clpsl2表達不正常可能會出現(xiàn)弱精癥，同時也影響精子活動影響，會導致雄性的不育癥。因此一方面可以針對Clpsl2參與精子成熟調(diào)控的特點，可用于制備診斷和治療雄性不育癥的藥物，同時也可制備用于調(diào)控雄性生育能力用的藥物；同時經(jīng)Clpsl的干擾片段RNA1-Nol靶向敲低Clpsl2表達后孕鼠胚胎發(fā)育不正常，數(shù)量減少，運動性能減弱，針對這個發(fā)現(xiàn)可用于開發(fā)雄性小鼠的節(jié)育藥。
[0043]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種類輔脂酶2基因的干擾片段，其特征在于核苷酸序列為:5' -ACTCAGTGCTCCAGTGACTGT-3'。
2.權(quán)利要求1所述的類輔脂酶2基因的干擾片段在雄性小鼠避孕藥制備及在小鼠精子成熟的藥物制備中 應用。
【文檔編號】C12N15/113GK103451186SQ201310382879
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】禹艷紅, 陳雷, 曹佐武, 蔡冬青, 廉滋珍, 秦俊文, 齊緒峰, 武征 申請人:暨南大學