噬菌體衍生的抗微生物活性劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供減少包括感染在內(nèi)的微生物菌落生長(zhǎng)的方法和組合物，包括治療性組合物，治療感染的方法，和鑒定其它這類組合物的方法。
【專利說明】噬菌體衍生的抗微生物活性劑
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2006年5月5日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/797，885和2007年3月30日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?60/909, 340的優(yōu)先權(quán)，此二申請(qǐng)的內(nèi)容出于所有目的納入本文作為參考。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明提供減少微生物菌落生長(zhǎng)，包括它們所引起感染的方法和組合物，包括治療感染的治療性組合物和方法，以及其它這類組合物的方法。
[0004]發(fā)明背景
[0005]細(xì)菌普遍存在，事實(shí)上所有適合居住的環(huán)境都發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌。它們是普通的，在生態(tài)學(xué)上多種多樣，它們形成罕見的存活生態(tài)位(niche)。它們存在于整個(gè)環(huán)境中，存在于土壤、灰塵、水中和事實(shí)上所有的表面上。許多細(xì)菌是正常和有益的菌株，從而提供宿主的協(xié)同關(guān)系。其它細(xì)菌則無益，或在有益的同時(shí)造成問題。
[0006]致病菌可引起人類、其它動(dòng)物、還有植物的感染性疾病。一些細(xì)菌只導(dǎo)致特定宿主患病；其它在許多宿主中造成問題，這取決于該細(xì)菌的宿主特異性。細(xì)菌引起的疾病象細(xì)菌本身那樣具有多種多樣性，包括食物中毒、蛀牙、炭疽、廣泛的感染疾病，甚至某種形式的癌癥。這些細(xì)菌通常是臨床微生物學(xué)領(lǐng)域研究的對(duì)象。
[0007]在自然界中，細(xì)菌的特異性病毒，如噬菌體可殺傷細(xì)菌。發(fā)現(xiàn)自然界的許多噬菌體屬于有尾曬菌體(Caudovirales)或"拖尾"曬菌體目。這些病毒一律含有包裹在蛋白質(zhì)衣殼中的一條雙鏈DNA基因組。噬.菌體由三種基本結(jié)構(gòu)組成:頭部，通常為對(duì)稱二十面體，從二十面體頭部一個(gè)頂點(diǎn)發(fā)出的尾結(jié)構(gòu)、和附著在此尾某些部位的4 - 6條尾纖維。應(yīng)注意，有尾噬菌體目包括三個(gè)普通形態(tài):短尾噬菌體科(短尾噬菌體)、肌噬菌體科(肌噬菌體)和長(zhǎng)尾噬菌體科(長(zhǎng)尾噬菌體)。嚴(yán)格說，短尾噬菌體不含有在形態(tài)上分離的尾部；因此此種尾樣結(jié)構(gòu)實(shí)際上裝配成頭部或衣殼裝配體的一部分。肌噬菌體和長(zhǎng)尾噬菌體中，頭、尾和尾纖維具有不同的形態(tài)發(fā)生途徑；實(shí)際上所有這三種結(jié)構(gòu)連接在一起形成完整的感染性病毒體。短尾噬菌體中存在頭途徑和尾纖維途徑。然而按照功能觀點(diǎn)而言，短尾噬菌體尾樣結(jié)構(gòu)與其它二種形態(tài)噬菌體的真正尾起到相同的功能。
[0008]噬菌體通過感染、復(fù)制和裂解宿主細(xì)胞而殺死細(xì)菌，此過程中釋放出多個(gè)子代病毒體。某些噬菌體衍生元件也能殺死細(xì)菌。例如，許多假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株能產(chǎn)生膿菌素(pyocin)，這是能殺死其它假單胞菌菌株的蛋白組分。術(shù)語(yǔ)“細(xì)菌素(bacteriocin)”通常用于描述細(xì)菌產(chǎn)生的能殺死其它細(xì)菌的化合物；已知各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的細(xì)菌素，從小分子到多肽。然而發(fā)現(xiàn)許多膿菌素是“無頭有尾”的，即噬菌體可產(chǎn)生尾而無頭部或DNA。這些尾樣細(xì)菌素能通過吸附于細(xì)菌，從而在細(xì)胞包膜上產(chǎn)生致死性損傷而殺死細(xì)菌，雖然它們?nèi)狈NA而不能復(fù)制或裂解宿主。自從最初在假單胞菌中發(fā)現(xiàn)膿菌素以來，已在各種其它細(xì)菌，包括革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌中鑒定到類似的尾樣細(xì)菌素。參見例如:Nakayama 等,(2000)Mol.Microbiol.38:213-31 ;Traub 等，(1996) Zentralbl.Bakteriol.284:124-35; Ito 等，(1986) J.Virol.59:103-111; Rocourt (1986) Zentralbl.Bakterio1.Mikrobio1.Hyg.261:12-28 ; Shinomiya(1984) J.Virol.49:310-14; Ishii 等，(1965) J.Mol.Biol.13:428-431; Daw 和 Falkiner (1996)Micron.27:467-479; Strauch 等，(2001) Appl.Environ.Microbiol.67:5635-5642;和 Abdelhamid 等，(2002) Appl.Environ.Microbiol.68:5704-5710。此外，也已報(bào)道了噬菌體衍生的其它殺菌元件。例如，有尾噬菌體編碼的內(nèi)溶素(endolysin)是宿主細(xì)胞裂解功能的一部分。這些酶能從內(nèi)部降解宿主細(xì)胞壁，導(dǎo)致其裂解并釋放子代病毒體。已證明在細(xì)菌培養(yǎng)液或懸液中外源性加入噬菌體內(nèi)溶素能裂解和殺死許多革蘭陽(yáng)性菌。參見例如，F(xiàn)ischetti等，(2005)美國(guó)專利申請(qǐng)20050208038描述了采用噬菌體內(nèi)溶素殺死細(xì)菌，還可參見Takac和Blasi (2005)Antimicrob.Agents and Chemother.49:2934-2940。
[0009]一些細(xì)菌通常是無害的，但當(dāng)存在某種機(jī)會(huì)時(shí)可變成致病菌，或在引入異常部位或狀態(tài)后會(huì)變成問題菌。缺乏有效免疫系統(tǒng)的人最脆弱，某些細(xì)菌能利用易感的體弱宿主提供暫時(shí)性環(huán)境以增殖和在人群中傳播。
[0010]統(tǒng)計(jì)學(xué)上,傳染病是主要的醫(yī)學(xué)問題。參見例如Watstein和Jovanovic (2003)Statistical Handbook on Infectious Diseases (傳染病統(tǒng)計(jì)學(xué)手冊(cè))Greenwood, ISBN: 1573563757。在美國(guó)，每年有約4 一 7萬人因血流醫(yī)院(醫(yī)院產(chǎn)生的)感染而死亡。
[0011]過去的半個(gè)世紀(jì)，抗生素使臨床醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了變革。自從最初發(fā)現(xiàn)抗生現(xiàn)象以來，這類具有非凡的治療實(shí)體的作用機(jī)制和開發(fā)取得了極大進(jìn)展。
[0012]參見例如，Therrien和 Levesque(2000)FEMS MicrobiolRev.24:251-62;Durgess(1999)Chest 115(3 增刊):19S-23S;Medeiros(1997)Clin.1nfect.Dis.24(增訂版 I): S19-45; Jones (1996) Am.J.Med.100 (6A): 3S-12S; Ford 和Hait (1993)Cytotechnology 12:171-212;以及 Liu(1992)Compr Ther.18:35-42。2002 年全世界銷售了約320億美元的抗生素。
.[0013]廣泛出現(xiàn)的抗生素耐藥細(xì)菌加重了目前的抗微生物治療對(duì)細(xì)菌適應(yīng)的脆弱性。參見例如，Walsh (1992) Antibiotics: Actions, Origins, Resistance (抗生素:作用、來源、耐藥性)Amer.Soc.Microbiol.，ISBN: 1555812546;Cunha(1992)AntibioticEssentials (抗生素基礎(chǔ))，醫(yī)師出版社(Physicians Press), ISBN: 1890114413; Amyes (2003)Magic Bullets,Lost Horizons: The Rise and Fall of Antibiotics “(魔術(shù)彈失去了水平:抗生素的出現(xiàn)和衰落)TF出版社(Taylor&Francis)，ISBN: 0415272033;Axelsen (2001)Essentials of Antimicrobial Pharmacology: A Guide toFundamentals for Practice (抗微生物藥理學(xué)基礎(chǔ):實(shí)施基礎(chǔ)指南)休瑪娜出版社(Humana Press), ISBN:0896038424;以及 Mainous 和 Pomeroy 編(2001)Management ofAntimicrobials in Infectious Diseases:1mpact of Antibiotic Resistance (感染疾病的抗生素治療:抗生素耐藥的影響)休瑪娜出版社，ISBN:0896038211。然而，許多經(jīng)典抗生素要靶細(xì)菌快速?gòu)?fù)制和生長(zhǎng)才有效。
[0014]因此，能降低靶細(xì)菌生長(zhǎng)或存活或限制細(xì)菌病原性的改進(jìn)方法將會(huì)有更大的用途。該用途適用于環(huán)境的、局部的、地方的或特別是體內(nèi)寄居。本發(fā)明解決了這些和其它有意義的問題。[0015]發(fā)明簡(jiǎn)述
[0016]本發(fā)明部分依據(jù)以下發(fā)現(xiàn):即發(fā)現(xiàn)噬菌體編碼的細(xì)胞壁降解活性物質(zhì)，如胞壁質(zhì)-降解(通常稱為胞壁溶解性(muralytic))酶(通常是噬菌體裂解宿主細(xì)胞功能的核心)也是噬菌體病毒粒的結(jié)構(gòu)組分，幫助菌體進(jìn)入宿主菌細(xì)胞。這些活性物質(zhì)在本文稱為TAME (尾相關(guān)的胞壁質(zhì)降解酶)，具有固有的殺菌活性而不論噬菌體的復(fù)制途徑。據(jù)認(rèn)為，所有這三種形態(tài)的噬菌體顆粒各自含有與尾結(jié)構(gòu)相關(guān)的TAME，或以短尾噬菌體為例，含有與頭部或衣殼的某小組分相關(guān)的TAME。據(jù)認(rèn)為，細(xì)胞壁局部降解有利于(噬菌體)DNA的注入過程。本發(fā)明描述了一種特定的噬菌體TAME，即0RF56，它是葡萄球菌(staphylococcal)肌噬菌體K的orf56的基因產(chǎn)物。具體說，發(fā)現(xiàn)以前認(rèn)為不是“裂解劑”的純化0RF56具有殺菌活性。此外，已鑒定到通過截短衍生自0RF56的殺菌多肽。可從類似或相關(guān)來源，如類似結(jié)構(gòu)來源和各種進(jìn)化相異來源的領(lǐng)域篩選殺菌活性物質(zhì)，以尋找其它具有優(yōu)選性能的其它殺菌活性物質(zhì)。這類來源也可以是誘變和篩選具有其它優(yōu)選性能，如穩(wěn)定性、殺菌效力、大小、底物特異性等等的起點(diǎn)。最重要的是，發(fā)現(xiàn)0RF56的胞壁質(zhì)降解催化結(jié)構(gòu)域與裂解性葡萄球菌細(xì)菌素(溶葡萄球菌素)的非催化性細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)組成的嵌合體具有強(qiáng)效的殺菌活性，比純化的TAME 0RF56或其截短衍生物明顯(例如幅度的數(shù)量級(jí)或多個(gè)因數(shù))更有效。這些TAME-CBD嵌合體的殺菌活性比純化的TAME更有效。然而，在許多有用的制劑混合物中，TAME-CBD嵌合蛋白顯示殺菌活性持續(xù)有效(如保留酶的穩(wěn)定性)。提供了據(jù)此的純化蛋白、其編碼核酸序列以及抗體。提供了應(yīng)用所述組合物的方法，包括減少靶細(xì)菌生長(zhǎng)和存在的方法。
[0017]本發(fā)明提供了殺傷對(duì)細(xì)胞壁降解活性敏感的細(xì)菌的方法，所述方法包括將選自以下的組合物引入所述細(xì)菌的環(huán)境中:a)純化的噬菌體尾部或尾樣細(xì)菌素的TAME組分；b)噬菌體K 0RF56 TAME或噬菌體phill，0RF49的推測(cè)TAME的細(xì)胞壁降解部分；c)含有噬菌體K 0RF56或噬菌體phill 0RF49的細(xì)胞壁降解多肽的基本純的多肽；或d)基本上由其它噬菌體或尾樣細(xì)菌素的TAME同源物或其片段組成的藥物組合物。來源的例子包括:YP_238566 (0RF007 (葡萄球菌噬菌體Twort))、YP_406405 (gp29 (利斯特菌噬菌體PlOO))、NP_765044(分.泌型抗原SsaA-樣蛋白(表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis) ATCC12228)、YP_164769 (orf 134 (胚芽乳桿菌(Lactobacillus pi ant arum)噬菌體LP65))、YP_492702 (轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體蛋白TraG (金黃色葡萄球菌金黃亞科USA300))、AAA71958 (推測(cè)的(金黃色葡萄球菌))、NP_765786 (N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(表皮葡萄球菌ATCC 12228))、YP_189676 (分泌型抗原前體SsaA-相關(guān)蛋白(表皮葡萄球菌RP62A))、ΥΡ_189814 (N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(表皮葡萄球菌RP62A))，其它指定的來源在下文作進(jìn)一步描述。另一來源是噬菌體phill 0RF49，一種推測(cè)的細(xì)胞壁水解酶(NP_803302;GeneID:1258067)。
[0018]本發(fā)明也提供所述方法，其中，所述細(xì)菌屬于葡萄球菌屬，具體是金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和有臨床意義的其它葡萄球菌；所述環(huán)境是體內(nèi)環(huán)境，或在粘膜或其它器官表面，或醫(yī)學(xué)裝置或植入物表面；所述引入是局部、全身、胃腸外或通過吸入；可采用另一種抗微生物治療，包括抗生素或噬菌體衍生產(chǎn)物；或所述殺菌活性對(duì)多種細(xì)菌菌株和/或多個(gè)細(xì)菌種具有廣泛的靶特異性。
[0019]提供各種方法來篩選針對(duì)靶細(xì)菌的噬菌體-衍生殺菌活性，所述方法包括:將源噬菌體片段化成為分離的片段結(jié)構(gòu)；測(cè)定哪個(gè)片段保留了對(duì)所述靶細(xì)菌的結(jié)合活性；測(cè)試所述片段的殺菌活性；從而鑒定具有所述殺菌活性的結(jié)構(gòu)。這也包括其中就該方法與美國(guó)司法部門交流信息所得資料的實(shí)施方式。在某些實(shí)施方式中，所述靶細(xì)菌是革蘭陽(yáng)性菌或所述殺菌活性是胞壁溶解活性。
[0020]提供了更多的方法，包括產(chǎn)生殺菌活性變體的方法，所述方法包括誘變特征為顯示細(xì)胞壁降解活性的多肽的編碼基因；篩選具有改進(jìn)的殺菌活性的變體。也包括將這類方法得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行信息交流。其它方法包括所述的，但評(píng)價(jià)改進(jìn)的殺菌活性，例如不同的底物轉(zhuǎn)換數(shù)量；或酶特性對(duì)包括溫度、鹽、pH、水合等反應(yīng)條件的敏感性的變化。
[0021 ] 提供的治療方法包括治療動(dòng)物的細(xì)菌感染,所述方法包括給予所述動(dòng)物一種或多種殺菌多肽，其中至少有二種所述多肽衍生自不同的細(xì)胞壁降解基因；此殺菌多肽具有廣泛的靶細(xì)菌殺傷活性；所述殺菌蛋白施加在細(xì)胞外部是“溶解性”的；或所述殺菌活性是胞壁質(zhì)降解性或溶胞壁活性的，包括具有胞壁質(zhì)糖苷酶(包括葡糖酰胺酶(glucosamidase)和胞壁酰胺酶(muraminidase))、轉(zhuǎn)糖基酶、溶酶體、酰胺酶或內(nèi)肽酶活性的蛋白質(zhì)。
[0022]本發(fā)明提供對(duì)靶細(xì)菌具有殺菌活性的0RF56或0RF49多肽，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:1的氨基酸殘基620-808或SEQ ID N0:3的氨基酸殘基481-618至少有80%、90%或95%相同性。在一實(shí)施方式中，0RF56蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸殘基620-808的準(zhǔn)確序列，或者0RF49蛋白包含SEQ ID NO: 3的氨基酸殘基481-618的準(zhǔn)確序列。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供基本上由0RF56多肽組成的組合物，該多肽對(duì)靶細(xì)菌具有殺菌活性，其包含的氨基酸序列與SEQ ID NO:1的氨基酸殘基620-808或與SEQ ID N0:3的殘基481-618至少有80%、90%或95%的相同 性。
[0023]在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含對(duì)靶細(xì)菌具有殺菌活性的0RF56或0RF49多肽的組合物，例如藥物組合物、診斷試劑或殺菌組合物，所述多肽包含的氨基酸序列與SEQ IDNO:1的氨基酸殘基620-808或與SEQ ID NO: 3的殘基481-618至少有80%、90%或95%的相同性。該組合物可包含至少一種具有殺菌活性的其它蛋白質(zhì)，如噬菌體P68的pl6蛋白或Pal-型“分解酶”。該組合物也可包含具有抑菌或殺菌活性的其它成分，如抗生素。
[0024]可利用公開的0RF56或0RF49多肽防止靶細(xì)菌即葡萄球菌種，特別是甲氧西林耐藥葡萄球菌的生長(zhǎng)。在另一實(shí)施方式中，所述靶細(xì)菌是復(fù)制緩慢的細(xì)菌種，如倍增時(shí)間在I — 72小時(shí)之間或更多時(shí)間，如2、4、8、12、20、30、40或50小時(shí)的細(xì)菌。
[0025]例如，可采用公開的0RF56和0RF49多肽，或包含0RF56或0RF49多肽的組合物來酶促降解細(xì)菌細(xì)胞壁。
[0026]在另一方面，本發(fā)明提供通過給予對(duì)象0RF56和0RF49多肽，或包含0RF56或0RF49多肽的組合物來治療該對(duì)象的細(xì)菌感染的方法。所述對(duì)象可以是，例如哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、人、農(nóng)業(yè)動(dòng)物、陪伴動(dòng)物、人、家禽、牛、馬、山羊、貓、綿羊、嚙齒類動(dòng)物、狗、豬、雞、鴨、鵪鶉或鵝。也可用本發(fā)明組合物治療展示動(dòng)物(show animal)，如大象、獅、虎、斑馬、鯨、海豚和熊。
[0027]在各種實(shí)施方式中，所述對(duì)象是牛，所述細(xì)菌感染是牛乳腺炎；所述對(duì)象是人，所述細(xì)菌感染由甲氧西林耐藥葡萄球菌種引起；或所述對(duì)象是家禽，所述細(xì)菌感染在皮膚或羽毛上。
[0028]另一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)細(xì)菌或鑒定致病菌的方法，該方法通過使細(xì)菌接觸0RF56或0RF49多肽，檢測(cè)0RF56或0RF49多肽與細(xì)菌的結(jié)合情況。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，0RF56或0RF49多肽所述可檢測(cè)標(biāo)記的。
[0029]在一方面，本發(fā)明提供使某表面與0RF56或0RF49多肽或包含0RF56或0RF49多肽的組合物接觸來消毒該表面的方法。此消毒方法可用于減少或消除表面上的所有細(xì)菌，或多種細(xì)菌，或特定的細(xì)菌種或菌株，如葡萄球菌種。
[0030]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供特征在于具有至少一種以下特性的基本純的或分離的多肽:在至少17個(gè)氨基酸的區(qū)段上與0RF56的殘基1-808、297-808、363-808、603-808、620-808或691-805具有至少約85%的相同性；在至少24個(gè)氨基酸的區(qū)段上與0RF56的691-805殘基具有至少約90%的相同性；或包含與0RF56至少有85%相同性的多個(gè)不同區(qū)段，所述區(qū)段不重疊。其它一些特性包括:例如在至少17個(gè)氨基酸上與0RF56的殘基691-805具有至少約75%相同性的其它不同區(qū)段；顯示與0RF56至少有約65%相同性的至少17個(gè)氨基酸的其它不同區(qū)段；具有全長(zhǎng)或天然0RF56的至少30%細(xì)胞壁降解活性；對(duì)葡萄球菌菌株的胞壁溶解活性至少為0RF56的約50% ;另一種功能多肽序列或結(jié)構(gòu)域，例如信號(hào)序列；或可檢測(cè)標(biāo)記；至少包含0RF56的殘基690-769 ;是全長(zhǎng)0RF56 ;對(duì)應(yīng)于0RF56的 1-808、297-808、363-808、Met-603-808 或 620-808 ;包含一個(gè) CHAP 結(jié)構(gòu)域；基本上沒有其它噬菌體蛋白質(zhì)；基本上沒有其它蛋白性物質(zhì)；與另一種抗微生物劑聯(lián)用，包括抗生素；與藥物賦形劑混合；是緩沖液配制的或滅菌組合物；顯示選自溶胞壁、葡糖酰胺酶、酰胺酶或內(nèi)肽酶活性的細(xì)菌細(xì)胞壁降解活性；顯示對(duì)多種革蘭陽(yáng)性細(xì)菌菌株具有殺菌活性；顯示對(duì)葡萄球菌細(xì)菌菌株具有殺菌活性；或顯示對(duì)一種或多種所述菌株，如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、緩慢葡萄球菌(S.1entis)、模仿葡萄球菌(S.simulans)和肉葡萄球菌(S.carnosus)有殺菌活性。
[0031]在一方面，本發(fā)明提供能表達(dá)分離或重組核酸的表達(dá)載體，所述核酸編碼0RF56或0RF49多肽或本文所述截短的0RF56多肽。本發(fā)明還包括含有0RF56表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是，例如用于產(chǎn)生0RF56多肽或核酸的真核或原核細(xì)胞。
[0032]一方面，本發(fā)明提供含有抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的基本純或分離的0RF56多肽，所述抗體能選擇性結(jié)合細(xì)胞壁成分?？墒惯@種0RF56多肽例如結(jié)合于可檢測(cè)標(biāo)記，或作為用于評(píng)估靶細(xì)菌存在并裝有使用說明書的試劑盒的一部分提供。
[0033]一方面，本發(fā)明提供通過使靶細(xì)菌的細(xì)胞壁接觸0RF56或0RF49多肽從而酶促降解所述細(xì)胞壁的方法。此方法的步驟可以，例如整合入診斷(方法)來測(cè)定細(xì)菌的敏感性；導(dǎo)致工作臺(tái)或家具表面的敏感菌群至少減少約5倍；將0RF56或0RF49多肽引入動(dòng)物導(dǎo)致在選擇的部位或所述動(dòng)物的敏感菌群至少減少約5倍；將所述多肽給予動(dòng)物表面或腔室；可以產(chǎn)生接種到個(gè)體中的細(xì)菌死亡或不能復(fù)制的手段；或可用于治療皮膚、粘膜、尿道、呼吸道、鼻腔、胃腸道或其它細(xì)菌感染。在其它實(shí)施方式中，敏感菌群的減少是，例如2倍、3倍、4倍、7倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍，或甚至更多。
[0034]一方面，本發(fā)明提供SEQ ID勵(lì):1所示截短的重組ORF56蛋白，其中從ORF56蛋白的氨基末端截?cái)?-620個(gè)氨基酸，或其中從0RF56蛋白的羧基末端截?cái)?-3個(gè)氨基酸，并且此0RF56蛋白具有細(xì)胞壁降解活性。其余的0RF56蛋白可以與SEQ ID N0:1中相應(yīng)的氨基酸序列具有約80%、90%或95%的相同性。
[0035]本發(fā)明提供顯示葡萄球菌菌株胞壁質(zhì)降解生物活性的基本純的或重組的多肽，此多肽包含金黃色葡萄球菌感染噬菌體的尾相關(guān)胞壁質(zhì)降解酶(TAME)區(qū)段和異源金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0036]在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述多肽的蛋白質(zhì)骨架分子量低于約400kDa、低于約250kDa、或低于約IOOkDa ;或所述多肽對(duì)金黃色葡萄球菌的胞壁質(zhì)顯示有肽酶、酰胺酶或水解酶活性；或所述多肽來自有尾噬菌體，如肌噬菌體、短尾噬菌體或長(zhǎng)尾噬菌體的尾部。在其它實(shí)施方式中，所述胞壁質(zhì)-降解酶區(qū)段來自噬菌體K 0RF56、噬菌體phillORF49或MRSA衍生的噬菌體。在其它各種實(shí)施方式中，所述細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域來自葡萄球菌細(xì)菌蛋白，如葡萄球菌溶菌素或噬菌體尾蛋白；或包含:細(xì)菌SH3區(qū)段；0RF56的序列、模仿葡萄球菌溶菌素或噬菌體L54a酰胺酶；或任何細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)建物，它們與缺乏該結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能的可比多肽相比，將所述多肽的胞壁質(zhì)降解活性提高至少30倍。
[0037]在一實(shí)施方式中，所述多肽含有SEQ ID N0:4。
[0038]也提供藥物組合物，例如所述多肽是乳膏或凝膠，裝在單劑量容器中，例如含有至少10納克多肽。這類組合物可以是控釋制劑；應(yīng)用于植入物、導(dǎo)管或醫(yī)學(xué)裝置中；或是滅菌的或緩沖劑型。
[0039]在其它優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合物作用于在鼻腔中發(fā)現(xiàn)的葡萄球菌菌株；或引起乳腺炎或感染燒傷或穿剌傷口的葡萄球菌菌株；或是甲氧西林耐藥或萬可霉素耐藥的葡萄球菌菌株。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，用TAME多肽或含TAME多肽的嵌合蛋白浸泡覆蓋傷口用的 敷料、紗布等以最大程度減少細(xì)菌感染的可能。在另一實(shí)施方式中，所述傷口是穿剌或燒傷傷口。在還有一實(shí)施方式中，帶有所述傷口的個(gè)體的免疫系統(tǒng)受損，例如HIV感染、器官移植和相關(guān)治療、干細(xì)胞或骨髓移植或化所致。也可用TAME多肽或含TAME多肽的嵌合蛋白來處理器官或血液產(chǎn)品，然后移植給受者。
[0040]本發(fā)明也提供處理細(xì)菌培養(yǎng)物的方法，該方法包括使所述培養(yǎng)物接觸所述嵌合多肽。通常，這種接觸可降低所述培養(yǎng)菌的生長(zhǎng)速率至少約5倍；或也可采用另一種抗微生物治療；或所述方法采用能靶向不同細(xì)菌菌株的混合多肽。這種處理優(yōu)選降低敏感靶細(xì)菌的生長(zhǎng)速率至少約30% ;將多肽以每種靶細(xì)菌化學(xué)計(jì)量為至少約10種多肽給予，或至少約500ng/ml ;或連續(xù)給予至少給7天。或者,所述培養(yǎng)物包含葡萄球菌菌株(一種革蘭陽(yáng)性菌)，或是感染物，或者所述培養(yǎng)物可包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織。
[0041]本發(fā)明也提供編碼所述多肽的核酸，雖然可用蛋白質(zhì)合成方法來生產(chǎn)此多肽。還提供了包含此核酸的細(xì)胞。
[0042]本發(fā)明也提供衍生自由TAME多肽序列，或含胞壁溶解結(jié)構(gòu)域的TAME區(qū)段與另一多肽中構(gòu)成細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的區(qū)段的融合體的等價(jià)或相關(guān)多肽。這些嵌合構(gòu)建物命名為TAME-CBD。例如，基本純的或重組的多肽顯示具有降解革蘭陽(yáng)性菌胞壁質(zhì)的生物學(xué)活性，此多肽含有革蘭陽(yáng)性菌感染噬菌體的修飾的(例如誘變的)尾相關(guān)胞壁質(zhì)降解酶(TAME)區(qū)段序列；和/或修飾的(如誘變的)異源革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些例子中，“誘變的”主要指與全長(zhǎng)TAME相比，其中完整的TAME蛋白區(qū)域被刪除，而殺菌或酶活性、蛋白溶解性、和/或蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)的TAME形式。
[0043]附圖簡(jiǎn)述
[0044]圖1提供了在感染葡萄球菌的噬菌體中鑒定到的TAME保守性結(jié)構(gòu)區(qū)域表。鑒定到胞壁溶解結(jié)構(gòu)域(MD)，在此表中稱為TAME CD。[0045]發(fā)明詳述
[0046]1.序言
[0047]本研究鑒定到先前未曾鑒定過的多肽，即噬菌體K 0RF56，現(xiàn)已證明它具有殺菌活性。它是某些肌噬菌體中作為病毒體結(jié)構(gòu)組分的一種組分，具有溶解胞壁的活性。其催化位點(diǎn)位于此蛋白的C-末端部分，顯示半胱氨酸一組氨酸依賴性氨基水解酶/肽酶(CHAP)結(jié)構(gòu)域。參見例如Rigden等(2003) Trends Biochem.Sc1.28:230-234。雖然在各種基因的N —末端區(qū)域發(fā)現(xiàn)有CHAP結(jié)構(gòu)域，但只在很少的基因的編碼區(qū)C 一附近區(qū)段中發(fā)現(xiàn)這種CHAP結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的一部分是了解屬于噬菌體蛋白特征的“細(xì)胞壁降解活性”與將“溶解”功能的降解活性(在人工條件下評(píng)估)轉(zhuǎn)變成殺菌功能(在典型的細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境的非人工條件下評(píng)估)的能力之間的關(guān)系。這些“降解活性”可能是用于治療條件的未知?dú)⒕钚缘男聛碓?，可能包括胞壁質(zhì)酰胺酶、葡糖酰胺酶、酰胺酶或內(nèi)肽酶活性。除在高度人工試驗(yàn)條件下測(cè)試噬菌體結(jié)構(gòu)外，在各種示范性的純化可溶性蛋白構(gòu)建物中鑒定到、分離和證明了這種活性，從而對(duì)靶細(xì)胞具有殺菌活性。此外，含有這種活性的重組構(gòu)建物具有用作抗微生物組合物和制劑的顯著優(yōu)選特性。
[0048]類似地，通過其基因結(jié)構(gòu)模式而部分認(rèn)識(shí)到長(zhǎng)尾噬菌體phill具有所述的胞壁質(zhì)降解活性(TAME)。
[0049]本研究證明葡萄球菌噬菌體K的“假定設(shè)0RF56”具有溶胞壁活性，此外，這種重組蛋白產(chǎn)物似乎是從9IkD編碼的“推測(cè)”翻譯產(chǎn)物加工產(chǎn)生的23kD蛋白。使各種葡萄球菌菌株接觸此23kD產(chǎn)物顯示有殺菌活性。截短構(gòu)建物顯示其殺菌活性編碼在該蛋白翻譯產(chǎn)物的C 一末端區(qū)域。
[0050]本研究表明，從0RF56產(chǎn)生的23kD蛋白產(chǎn)物含有CHAP結(jié)構(gòu)域。還有，從此23kD蛋白截短的包含C 一附近區(qū)域和CHAP結(jié)構(gòu)域的16kD產(chǎn)物也有殺菌活性。根據(jù)序列同源性檢索，已鑒定到作為殺菌活性物質(zhì)的潛在替代來源的各種其它類似結(jié)構(gòu)。雖然溶胞壁活性可能不同，但細(xì)菌的敏感性范 圍尚待研究。因此，各種這些新活性可能具有相當(dāng)廣泛的靶抗菌活性。此外，顯示這些活性的這些多肽體積小從而使其在體內(nèi)能有效產(chǎn)生和接觸相關(guān)的細(xì)胞壁靶組分如肽聚糖。
[0051]近年來，作為預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染的一種替代方法，人們重新注意到噬菌體治療。參見 Merril 等(2003)Nat.Rev.Drug Discov.2:489-497 ;和 Sulakvelidze,等(2001)Antimicrob.Agents Chemother.45:649-659。此外，已有人提出卩遼菌體-編碼的內(nèi)溶素(endolysin)是控制革蘭陽(yáng)性菌引起的感染疾病的有效制劑(Fischetti (2003)Ann.N.Y.Acad.Sc1.987:207-214)。一項(xiàng)近年關(guān)于噬菌體內(nèi)溶素的研究論文表明腸球菌(Enterococcus)噬菌體內(nèi)溶素對(duì)腸球菌以外的鏈球菌和葡萄球菌的作用沒有特異性(Yoong 等，(2004) J.Bact.186:4808-4812)。
[0052]在許多噬菌體類型，包括肌噬菌體、短尾噬菌體和長(zhǎng)尾噬菌體種類中發(fā)現(xiàn)屬于噬菌體組分的這些溶胞壁或細(xì)胞壁降解標(biāo)記。
[0053] 申請(qǐng)人:對(duì)這些TAME細(xì)胞壁降解活性進(jìn)行了研究，測(cè)試了在適用于術(shù)語(yǔ)“溶解”的人造條件下的殺菌活性，發(fā)現(xiàn)它們的特異性活性相當(dāng)?shù)汀Ｖ饾u明白這種局限性是TAME活性固有的，只能產(chǎn)生極其有限的細(xì)胞壁降解生物學(xué)作用，這種作用足夠讓噬菌體DNA注入，但對(duì)細(xì)胞完整性沒有有害作用。具體說，細(xì)胞壁的降解速度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)沒有顯著影響，發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)情況下不能滿足商品化治療應(yīng)用。
[0054]噬菌體蛋白可能進(jìn)化成能，可能參與抵抗細(xì)胞外，通常是動(dòng)物體外的惡烈環(huán)境，并進(jìn)化成對(duì)宿主靶細(xì)胞沒有充分殺傷。事實(shí)上，在感染過程中，噬菌體的生命周期要求不殺死細(xì)菌細(xì)胞，另外噬菌體中斷生命周期后方才復(fù)制。因此，TAME蛋白作為殺菌元件先天不足。
[0055]因此， 申請(qǐng)人:進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到雖然噬菌體尾部酶在進(jìn)化目的上是幫助其感染過程，但它們未能演化成足以殺死靶宿主細(xì)胞的程度。因此，如果要將TAME蛋白用作有效的殺菌齊U，需要修飾這種TAME蛋白。本發(fā)明提供的誘變和篩選方法適用于鑒定細(xì)胞壁降解基序，此基序能將TAME催化結(jié)構(gòu)域引到特定的細(xì)菌或細(xì)菌的特定位點(diǎn)。用0RF56作為模型， 申請(qǐng)人:首先認(rèn)識(shí)到可將噬菌體TAME蛋白從邊緣性殺菌試劑轉(zhuǎn)變?yōu)楦咝?qiáng)效殺菌劑，例如通過去除看來是阻止全長(zhǎng)TAME多肽具有高效殺菌功能的序列，和/或?qū)⑵錃埩舻拇呋Y(jié)構(gòu)域與異源性細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域相融合。如上所述，將這些融合蛋白或嵌合蛋白命名為TAME-CBD。
[0056]這些噬菌體TAME蛋白的天然形式的殺菌活性有限。 申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)連接壁降解結(jié)構(gòu)域的靶基序影響細(xì)胞壁底物處催化位點(diǎn)的局部濃度顯著增長(zhǎng)。例如將作用于天然環(huán)境中在細(xì)菌表面上天然發(fā)現(xiàn)的合適細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的TAME蛋白的催化區(qū)段與具有相應(yīng)親和力并靶向相應(yīng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的結(jié)合區(qū)段聯(lián)合可設(shè)計(jì)出特定細(xì)菌的嵌合蛋白。將靶向基序連接于噬菌體衍生的細(xì)胞壁降解區(qū)段可提供許多融合蛋白或雙功能構(gòu)建物，以篩選所需的抑菌、殺菌或細(xì)胞壁“溶解”活性。
[0057]已選擇了其它細(xì)胞壁降解酶區(qū)段，制備了構(gòu)建物以說明本發(fā)明范圍。例如，已采用衍生自噬菌體區(qū)段(通常是尾結(jié)構(gòu))，編碼酶活性，如細(xì)胞壁降解酶活性。已從各種噬菌體或細(xì)菌來源分離了酶活性顯示具有類似活性。類似活性也可獲自基于噬菌體的結(jié)構(gòu)，例如基于與噬菌體進(jìn)入宿主(通常是在感染相關(guān)過程中)所用的已知活性的序列同源性。通過感染酶的基因組成中鑒定其它序列，例如包含噬菌體尾結(jié)合/壁穿透結(jié)構(gòu)的基因盒，在噬菌體基因組中(參見金黃色葡萄球菌噬菌體phi 11細(xì)胞壁水解酶的0RF49 (NP_803302)，其是噬菌體K的0RF56的結(jié)構(gòu)“復(fù)本”。其它例子包括金黃 色葡萄球菌噬菌體69的0RF004(g1:66395297, YP_239591.1)、噬菌體 PhiNM4 的細(xì)胞壁水解酶(g1: 104641981，ABF73289.1)、phi ETA2的細(xì)胞壁水解酶(g1:122891778，YP_001004324.1)、金黃色葡萄球菌噬菌體 85 的 0RF004(g1:66394874, YP_239746.1)和噬菌體 ROSA 的0RF004 (g1: 66395969, YP_240329.1)。這兩種結(jié)構(gòu)域或基序也可衍生自前噬菌體或留在細(xì)菌基因組中的滅活或不完全噬菌體基因組的“殘存噬菌體”。前噬菌體和鑒定它們的方法參見例如 Canchaya 等.,Microbiol.Mole.Biol.Rev.67:238-276 (2003)，此文內(nèi)容出于所有目的納入本文作參考。其它活性肽可衍生自膿菌素(殺菌素)或噬菌體的相關(guān)結(jié)構(gòu)，其不能象正常噬菌體那樣增殖但可作為不完全基因組副產(chǎn)品而產(chǎn)生或維持。因此，可從代表可存活噬菌體的結(jié)構(gòu)中分離這些蛋白或編碼序列，或從其衍生。而且，每種這些結(jié)構(gòu)可作為誘變的起始點(diǎn)以優(yōu)化在所需應(yīng)用條件下(例如上述的)的活性。
[0058]I1.尾相關(guān)的胞壁質(zhì)降解酶(TAME)
[0059]尾相關(guān)的胞壁質(zhì)降解酶(TAME)定義為在細(xì)菌噬菌體顆粒中發(fā)現(xiàn)的溶胞壁酶，包括能消化細(xì)菌細(xì)胞壁(優(yōu)選革蘭陽(yáng)性菌的)的那些酶，但也適用于能消化革蘭陰性菌或其它細(xì)菌細(xì)胞壁的那些酶。此種活性通常是肽聚糖降解酶活性，可以是一種或多種胞壁酸酶、氨基葡萄糖苷酶、轉(zhuǎn)糖基酶、溶酶體酶、酰胺酶或內(nèi)肽酶活性。此種酶能降解細(xì)胞壁，甚至有“溶解”細(xì)胞的特性，但與噬菌體感染過程的正常環(huán)境相比，這種溶解特性是在高度人造條件下才有的。優(yōu)選這種酶衍生自噬菌體結(jié)構(gòu)，短尾噬菌體的尾或尾等同物，或短尾噬菌體的頭內(nèi)蛋白，它們是噬菌體基因組材料從外部環(huán)境進(jìn)入細(xì)菌宿主的手段；因?yàn)檫@些蛋白最常見于尾結(jié)構(gòu)中，對(duì)于本申請(qǐng)的目的，此類結(jié)構(gòu)通稱為TAME蛋白。短尾噬菌體尾等價(jià)物的相關(guān)TAME蛋白的一個(gè)例子是噬菌體T7的gpl6蛋白。gpl6蛋白是作用于肽聚糖的轉(zhuǎn)糖基酶。gpl6蛋白能有助于DNA注入,但它包含在衣殼內(nèi)，當(dāng)感染時(shí)才被吐出，似乎形成尾的一部分。參見例如，Molineux (1999) The T7 family of bacteriophages (細(xì)菌卩遼菌體的 T7 家族)刊于 Encyclopedia of Molecular Biology (分子生物學(xué)百科全書).Creighton TE,主編，紐約,JffC 公司(John ffiley&Col)，2495-2507 頁(yè)。
[0060]靶細(xì)菌通常是影響或感染動(dòng)物，特別是靈長(zhǎng)類動(dòng)物的那些細(xì)菌。然而，優(yōu)選尋求各種抑菌或殺菌應(yīng)用，以及某些公共衛(wèi)生問題。所述細(xì)菌常為革蘭陽(yáng)性菌類，雖然其它致病菌尚未明確分成某類或其它類型，包括分支桿菌、孢子菌或其它原核生物。致病性或病原性靶細(xì)菌是最感興趣的目標(biāo)，革蘭陽(yáng)性菌如葡萄球菌種，包括金黃色葡萄球菌，和鏈球菌種，以及革蘭陰性菌。特別重要的革蘭陰性靶細(xì)菌種包括大腸桿菌屬，特別是大腸桿菌；假單胞菌，特別是綠膿桿菌；彎曲桿菌；沙門菌；奈瑟菌；幽門螺桿菌和弧菌。參見例如MerckManual (默克手冊(cè))和Merck Veterinary Manual (默克獸醫(yī)手冊(cè))。
[0061]本文公開的0RF56多肽可與至少一種其它溶胞壁酶聯(lián)用來治療，例如一種或多種細(xì)菌菌株所致的感染。示范性的其它溶胞壁酶包括，例如噬菌體P68的蛋白16和Pal-型“溶解”酶。噬菌體P68的蛋白16披露于例如(Vybiral D等(2003)，F(xiàn)EMs MicrobiolLett.，219，275-283)。Pal-型“溶解”酶披露于例如Fischetti等，(2005)美國(guó)專利申請(qǐng)20050208038。
[0062]如本文公開的那樣，技術(shù)人員可通過聯(lián)合序列分析與測(cè)定噬菌體基因組中編碼核酸的位置來鑒定TAME蛋白。
[0063]II1.定義
[0064]“細(xì)胞壁降解活性”是降解、斷裂、分裂或削弱或降低細(xì)菌細(xì)胞完整性的酶活性。術(shù)語(yǔ)“溶解”通常用于指“細(xì)胞壁降解”，部分是由于大多數(shù)(有某些例外)壁降解催化活性是水解活性。因此所用的許多術(shù)語(yǔ)指“溶解”，即使其催化機(jī)制不涉及水解?；蛘吣承┐_定的或人工底物可用于測(cè)試“溶解”或抑制活性(以靶細(xì)菌群為基礎(chǔ))。噬菌體的“細(xì)胞壁溶解活性”通常是指定為基于在人工條件下測(cè)試的結(jié)構(gòu)的表征，但這種表征是細(xì)菌種、家族、菌屬或亞類(可根據(jù)敏感性定義)特異性的。因此，"對(duì)細(xì)胞壁降解活性敏感的細(xì)菌"描述細(xì)菌的細(xì)胞壁因一種或多種特定的細(xì)胞壁降解酶活性而遭到降解、破裂、分裂或細(xì)胞壁完整性遭到削弱或降低。許多其它“溶解活性”源自宿主菌細(xì)胞，在細(xì)胞分裂或噬菌體釋放中至關(guān)重要。在噬菌體上發(fā)現(xiàn)了其它噬菌體衍生的細(xì)胞壁降解酶活性，在噬菌體感染的各種滲透步驟中起作用，但如果在噬菌體DNA注入細(xì)胞前噬菌體殺傷宿主細(xì)菌噬菌體復(fù)制將在生理學(xué)上中斷。滲入步驟所用的結(jié)構(gòu)與本發(fā)明特別有關(guān)是因?yàn)檫@些活性從外部對(duì)正常宿主起作用。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞壁降解活性由非穴蛋白(holin)酶和/或非細(xì)胞溶素(Iysin)酶提供。在其它實(shí)施方式中，細(xì)胞結(jié)合活性由非穴蛋白酶和/或非細(xì)胞溶素酶提供。[0065]“細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或"CBD"通常是一種靶向基序，它能識(shí)別細(xì)菌的外表面。在革蘭陽(yáng)性菌中，細(xì)菌的外表面通常是胞壁層。因此，這些靶標(biāo)的優(yōu)選結(jié)合區(qū)段是細(xì)胞表面物質(zhì)，無論蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖或它們的組合。已知溶菌酶、內(nèi)溶素等的結(jié)合區(qū)段是已知的，它們的性質(zhì)不難通過PubMed或Entrez檢索查到。其它能結(jié)合細(xì)菌的蛋白質(zhì)包括下述PGRP、TLR、鞭毛蛋白和菌毛蛋白結(jié)合物質(zhì)，以及參與靶標(biāo)識(shí)別的噬菌體尾蛋白。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，將CBD與均如本文所述的TAME蛋白或細(xì)胞壁降解蛋白融合。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，與TAME蛋白或細(xì)胞壁降解蛋白相比，CBD是異源結(jié)構(gòu)域。即CBD蛋白衍生自非TAME蛋白或非細(xì)胞壁降解蛋白，或衍生自不同噬菌體、細(xì)菌或其它生物的細(xì)胞壁結(jié)合蛋白。因此，此種異源性CBD結(jié)構(gòu)域可用于引導(dǎo)TAME蛋白到特定的靶細(xì)菌，或可用于增加TAME蛋白的靶標(biāo)范圍。
[0066]細(xì)菌的"環(huán)境"可包括體內(nèi)或體外環(huán)境。在采用分離或純化細(xì)菌的某些實(shí)施方式中，體外環(huán)境通常是處于反應(yīng)容器中，但可包括對(duì)儀器或動(dòng)物身體或公共衛(wèi)生設(shè)施如水、腐敗區(qū)域或下水道設(shè)施的表面滅菌、常規(guī)處理。其它體外環(huán)境可能剌激混雜的細(xì)菌群，如包括許多緊密聚集的共生或相互作用菌種。進(jìn)行了許多噬菌體和細(xì)菌的培養(yǎng)研究，其中靶宿主菌與噬菌體的比例是人工的和非生理狀態(tài)的。體內(nèi)環(huán)境優(yōu)選用細(xì)菌感染的宿主生物。體內(nèi)環(huán)境包括器官，如膀胱、腎、肺、皮膚、心臟和血管、胃、腸、肝、腦或脊髓、感覺器官如眼、耳、鼻、舌、胰腺、脾、甲狀腺等等。體內(nèi)環(huán)境包括組織，如牙床、神經(jīng)組織、淋巴組織、腺體組織、血液、精液等等，可反映不同細(xì)菌(其存活依賴于它們的相互作用)協(xié)同相互作用。正常使用的引入機(jī)體的插管、植入裝置和監(jiān)測(cè)或治療裝置可能成為感染的來源。體內(nèi)環(huán)境也包括食物，如魚、肉或植物食品的表面。肉包括，例如牛肉、豬肉、雞肉、火雞肉、鵪鶉肉或其它家禽的肉。植物材料包括蔬菜、水果、或水果和/或蔬菜制成的汁。在某些實(shí)施方式中，與細(xì)菌污染食品接觸的表面可用TAME蛋白或包含TAME蛋白的嵌合蛋白，如0RF56或0RF49處理。
[0067]"引入"某組合物到環(huán)境中包括給予某化合物或組合物，使細(xì)菌與其接觸。引入所述化合物或組合物常受到產(chǎn)生或釋放它們的活細(xì)菌影響。
[0068]"細(xì)胞壁降解蛋白"是對(duì) 細(xì)胞壁或其組分具有可檢測(cè)的(如實(shí)質(zhì)性)降解活性的蛋白。"溶解"活性是降解活性的極端形式或結(jié)果。示范性的殺菌多肽包括例如0RF56或0RF49產(chǎn)品，其結(jié)構(gòu)相關(guān)實(shí)體、突變體和變體，和衍生自其或twort, K, Gl,或phill噬菌體的其它相關(guān)構(gòu)建物。特別優(yōu)選的序列衍生自例如葡萄球菌噬菌體Gl的0RF005 (參見g1: 66394954，YP_240921.1)、葡萄球菌噬菌體Twort的0RF007 (參見g1:66391262，YP_238566.1),或衍生自利斯特菌噬菌體PlOO (參見g1: 82547634，ΥΡ_406405.1)。通過它們?cè)谑删w尾部的位置或天然噬菌體、突變型噬菌體殘留物(如膿菌素或殺菌素)的靶宿主菌接觸位點(diǎn)，或通過前噬菌體序列編碼鑒定到類似的降解活性。優(yōu)選的區(qū)段衍生自例如0RF56或0RF49、模仿葡萄球菌的溶葡球菌素(Iss)，金黃色葡萄球菌的LytM肽酶、頭狀葡萄球菌(S.capitis)的ALEl和其它噬菌體尾部的胞壁溶解多肽。
[0069]" 0RF56多肽"或其語(yǔ)法變體指葡萄球菌噬菌體K的0RF56編碼的殺菌或殺菌活性(與gi I 48696445相關(guān)的特征結(jié)構(gòu))。示范性0RF56多肽變體包括該多肽的多態(tài)變體、等位基因變體、突變體和種間同源物，它們(I)具有的氨基酸序列優(yōu)選在一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，例如至少約8、12、17、25、33、50、65、80、100、200或更多個(gè)氨基酸的區(qū)域中與葡萄球菌噬菌體K的0RF56核酸編碼氨基酸序列(參見登錄號(hào)YP_024486)，或與葡萄球菌噬菌體Twort、K或Gl的胞壁溶解多肽氨基酸序列有大于約60%的氨基酸序列相同性，即約65%、70%、75%、80%、85%、90%，優(yōu)選約 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 或更高的氨基酸序列相同性；(2)能與用含0RF56活性片段和其保守性修飾變體的氨基酸序列的基本純的免疫原產(chǎn)生的抗體，如多克隆抗體結(jié)合；(3)在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能與對(duì)應(yīng)于0RF56多肽的天然編碼核酸序列和其保守性修飾變體的反義鏈特異性雜交；(4)具有的核酸序列優(yōu)選在至少約25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700個(gè)或更多個(gè)核苷酸的區(qū)域中與0RF56編碼核酸或編碼其片段的核酸有大于約65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%，優(yōu)選大于約96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸序列相同性。特別優(yōu)選的區(qū)段衍生自CHAP結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的核酸和蛋白包括天然或重組分子。全長(zhǎng)的0RF56多肽和其N末端截短的片段(小至約16kD)對(duì)細(xì)胞壁組分通常有降解活性?？砂幢绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的和本文所述的方法進(jìn)行細(xì)胞壁組分降解活性的試驗(yàn)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，0RF56多肽對(duì)細(xì)菌的各種葡萄球菌菌株，包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、緩慢葡萄球菌和肉葡萄球菌具有殺菌活性。類似的比較檢測(cè)可適用于其它序列如本文所述的0RF49。
[0070]在某些實(shí)施方式中，可根據(jù)所述細(xì)胞壁降解多肽的序列用PCR引物擴(kuò)增編碼細(xì)胞壁降解多肽的核酸。例如，可用引物擴(kuò)增編碼0RF56多肽變體和其片段，以及可能的細(xì)胞壁降解活性候選物的核酸。參見例如Vybiral 等，(2003)FEMS Microbiol.Lett.219:275-283。因此，細(xì)胞壁降解多肽和其片段包括根據(jù)已鑒定的細(xì)胞壁降解多肽的序列通過PCR擴(kuò)增的核酸編碼的多肽。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，用所述0RF56或0RF49序列相關(guān)引物擴(kuò)增的核酸編碼殺菌或抑菌多肽或其片段。
[0071]"噬菌體顆粒組分"指例如噬菌體的頭部或尾組分，例如噬菌體K、Twort,Gl或Phill的頭和尾組分。然而，本發(fā)明提供的許多不同類型噬菌體可作為與這種噬菌體組分松散相關(guān)的“溶解”活性的來源。參見例如Piuri和Hatfull (2006)A peptidoglycanhydrolase motif within the mycobacteriophage TM4 tape measure protein promotesefficient infectio n of stationary phase cells (肌卩遼菌體TM4帶測(cè)量蛋白中的妝聚糖水解酶基序促進(jìn)對(duì)靜態(tài)細(xì)胞的有效感染)Molecular Microbiology 62:1569-1585。噬菌體核酸指噬菌體的核酸組分，包括雙鏈和單鏈核酸，如DNA、RNA或雜交分子。相關(guān)序列可見于前噬菌體或不完全的噬菌體基因組中，通常發(fā)現(xiàn)整合到細(xì)菌宿主的染色體中。尾組分通?？山閷?dǎo)噬菌體識(shí)別和附著靶宿主菌，其可具有有助于噬菌體組分穿透進(jìn)入宿主菌細(xì)胞壁降解活性。
[0072]" GMP條件"指藥品生產(chǎn)和質(zhì)量管理，例如由美國(guó)食品藥品管理局制定的。歐洲、日本和大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家制定了類似的規(guī)程和制度。
[0073]上述“基本純”的定義中術(shù)語(yǔ)“基本上”一般指至少約60%、至少約70%、至少約80%，或較優(yōu)選至少約90%、還要優(yōu)選至少約95%純，不論指蛋白質(zhì)、核酸或其它結(jié)構(gòu)，或其它類型的分子。
[0074]術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指天然產(chǎn)生的和合成的氨基酸，及以類似于天然產(chǎn)生的氨基酸的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然產(chǎn)生的氨基酸是遺傳密碼編碼的氨基酸，以及隨后被修飾的那些氨基酸，如羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指具有與天然氨基酸相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，如與氫結(jié)合的α碳原子、羧基、氨基和R基團(tuán)，如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基砜。這種類似物含有修飾的R基團(tuán)(如正亮氨酸)，或修飾的肽骨架，但保留了天然氨基酸的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指結(jié)構(gòu)與氨基酸通用化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，但以類似于天然氨基酸的方式起作用的化合物。
[0075]“蛋白質(zhì)”、“多肽”、或"肽"指聚合物，其大多數(shù)或所有的單體是通過酰胺鍵連接在一起的氨基酸，或者稱為多肽。當(dāng)氨基酸是α-氨基酸時(shí)，可采用或L-光學(xué)異構(gòu)體，或D-光學(xué)異構(gòu)體。此外，也包括非天然氨基酸，如丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。本發(fā)明也可采用不是基因編碼的氨基酸。此外，本發(fā)明也采用經(jīng)過修飾而包含合適結(jié)構(gòu)或反應(yīng)基團(tuán)的氨基酸。本發(fā)明所用的氨基酸可以是D-或L-異構(gòu)體或它們的混合物。通常優(yōu)選L-異構(gòu)體。此外，本發(fā)明也采用其它肽模擬物。綜述可參見Weinstein等編(1983) Chemistryand Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins (氨基酸、妝和蛋白質(zhì)的化學(xué)和生物化學(xué))MD出版社(Marcel Dekker，紐約，第267頁(yè)。
[0076]術(shù)語(yǔ)“重組”用于指細(xì)胞時(shí)，表明細(xì)胞能復(fù)制異源核酸，或表達(dá)異源核酸編碼的肽或蛋白質(zhì)。重組細(xì)胞可包含在該細(xì)胞的天然形式(非重組細(xì)胞)中沒有的基因。重組細(xì)胞也可含有在該細(xì)胞的天然形式中發(fā)現(xiàn)的基因，其中所述基因經(jīng)修飾后重新導(dǎo)入該細(xì)胞。此術(shù)語(yǔ)也包括其內(nèi)源核酸經(jīng)過修飾但沒有從細(xì)胞中除去的細(xì)胞；這種修飾包括通過基因替代、定點(diǎn)突變和相關(guān)技術(shù)獲得的修飾。具體地說，可制備融合序列，例如在所需序列的上游摻入一個(gè)上游分泌盒而產(chǎn)生分泌的蛋白產(chǎn)物。
[0077]“融合蛋白”指其所含的氨基酸序列是除編碼原始或天然全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列或其亞序列以外的、取代的該氨基酸序列或其亞序列，少于和/或不同于該氨基酸序列或其亞序列的蛋白。可將一個(gè)以上其它結(jié)構(gòu)域加到本文所述的細(xì)胞壁溶解蛋白中，例如表位標(biāo)簽或純化標(biāo)簽，或多個(gè)表位標(biāo)簽或純化標(biāo)簽?？蛇B接其它結(jié)構(gòu)域，例如其可添加額外的溶解活性(對(duì)混合菌落或生物膜的靶細(xì)菌或相關(guān)細(xì)菌)、細(xì)菌衣殼降解活性、靶向功能或其可影響生理過程如血管滲透性。或者，可連接能在不同多肽之間導(dǎo)致物理親和力的結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生多鏈聚合的復(fù)合物。
[0078]術(shù)語(yǔ)“核酸”指脫氧核糖核酸、核糖核酸或單鏈或雙鏈形式混合聚合物，除非另有限制，包括能以類似于天然核苷酸的方式與核酸雜交的天然核苷酸的已知類似物。除非另有指出或文中另有說明，特定的核酸序列包括其互補(bǔ)序列。
[0079]“重組表達(dá)盒”或簡(jiǎn)寫為“表達(dá)盒”是重組或合成產(chǎn)生的一種核酸構(gòu)建物，其中的核酸元件能影響結(jié)構(gòu)基因在與這種序列相容的宿主中的表達(dá)。表達(dá)盒通常至少包括啟動(dòng)子和/或轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。重組表達(dá)盒通常包括要轉(zhuǎn)錄的核酸(如編碼所需多肽的核酸)和啟動(dòng)子。也可采用實(shí)現(xiàn)表達(dá)必須的或有幫助的其它因子，例如本文所述的。在某些實(shí)施方式中，表達(dá)盒也可包含編碼信號(hào)序列的核苷酸序列，所述信號(hào)序列引導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞分泌。表達(dá)盒也可包含轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、增強(qiáng)子和能影響基因表達(dá)的其它核酸序列。在某些實(shí)施方式中，在宿主菌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)對(duì)細(xì)胞壁有溶解活性的重組表達(dá)盒編碼的氨基酸序列。
[0080]本文所用的“異源序列”或“異源核酸”是源自特定宿主細(xì)胞的外來來源的序列或核酸，或如果是同一來源，則對(duì)其原始形式作了修飾。可通過，例如用限制性酶處理DNA以產(chǎn)生能操作性連接啟動(dòng)子的DNA片段來修飾此異源序列。也采用定點(diǎn)誘變等技術(shù)來修飾異源序列。
[0081]術(shù)語(yǔ)“分離的”指實(shí)質(zhì)上或基本上沒有干擾酶活性成分的材料。對(duì)于本發(fā)明的糖、蛋白質(zhì)或核酸，術(shù)語(yǔ)“分離的”指實(shí)質(zhì)上或基本上沒有其天然狀態(tài)中所見正常伴隨它們的物質(zhì)。用銀染色凝膠條帶強(qiáng)度或測(cè)定純度的其它方法測(cè)量到本發(fā)明的分離的糖、蛋白質(zhì)或核酸的純度一般是至少約80%純，通常至少約90%，優(yōu)選至少約95%。純度或均質(zhì)性可用本領(lǐng)域熟知的許多方法測(cè)定。例如，可用聚丙烯凝膠電泳分辯樣品中的蛋白質(zhì)或核酸，然后染色觀察該蛋白質(zhì)或核酸。對(duì)于某些目的，可能需要蛋白質(zhì)或核酸的高分辨率，可以采用，例如HPLC或類似方法來純化。
[0082]術(shù)語(yǔ)“操作性相連”指核酸表達(dá)調(diào)控序列(如啟動(dòng)子、信號(hào)序列或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)陣列)與第二核酸序列之間的功能性連接，其中所述表達(dá)調(diào)控序列影響與第二序列相對(duì)應(yīng)的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
[0083]就二個(gè)或多個(gè)核酸或蛋白質(zhì)序列而言，術(shù)語(yǔ)“相同”或“相同性百分比”指當(dāng)比較或比對(duì)最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，采用序列比較算法之一或通過目視檢查測(cè)定到這二個(gè)或多個(gè)序列或亞序列是相同的或含有一定百分比的氨基酸殘基或核苷酸相同。
[0084]就二種核酸或蛋白質(zhì)而言，短語(yǔ)“基本上相同”指當(dāng)比較或比對(duì)最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，采用以下的序列比較算法之一或通過目視檢查測(cè)定到這二條或多條序列或亞序列在相對(duì)應(yīng)的區(qū)段中至少有大于約60%的核酸或氨基酸序列相同性，即65%、70%、75%、80%、85%、90%，優(yōu)選91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸或氨基酸殘基相同性。優(yōu)選在對(duì)應(yīng)于長(zhǎng)度至少約13、15、17、23、27、31、35、40、50個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的序列區(qū)域上，更優(yōu)選在至少約100殘基的區(qū)域上存在基本相同性，最優(yōu)選這些序列在至少約150個(gè)殘基上是基本相同的。優(yōu)選更長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)核酸長(zhǎng)度，雖然要考慮密碼子簡(jiǎn)并性。在一最優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述序列在編碼區(qū)全長(zhǎng) 上基本相同。
[0085]對(duì)于序列比較，通常將一個(gè)序列用作參比序列與測(cè)試序列比較。當(dāng)采用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參比序列輸入計(jì)算機(jī)，如需要，指定亞序列座標(biāo)，指定序列算法程序參數(shù)。然后序列比較算法根據(jù)指定的程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參比序列的序列相同性百分比。
[0086]可米用例如Smith 和 Waterman (1981) Adv.Appl.Math.2:482 的局部同源性算法；Needleman 和 Wunsch (1970) J.Mol.Biol.48:443 的同源性比對(duì)算法；Pearson 和Lipman(1988)Proc.Nat’ I Acad.Sc1.USA 85:2444的類似性檢索；采用計(jì)算機(jī)執(zhí)行的這些和相關(guān)的算法(威斯康星遺傳學(xué)軟件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group (遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組)，575Science Dr.,麥迪遜，威斯康星州)；或目測(cè)檢查(一般可參見Current Protocols inMolecular Biology (最新分子生物學(xué)方法)，Ausubel 等編.,Current Protocols (最新方法)，格林出版合伙公司(Greene Publishing Associates, Inc.)和約翰威利父子公司(John ffiley&Sons, Inc)的合資企業(yè).(1995和增刊)(Ausubel))進(jìn)行序列的最佳比對(duì)。
[0087]適合測(cè)定序列相同性百分比和序列相似性的算法例子有BLAST和BLAST 2.0算法，分別參見 Altschul 等，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410 和 Altschuel 等，(1977)Nucleic Acids Res.25:3389-3402。公眾可從國(guó)家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(ncb1.nlm.nih.gov/)或類似來源獲得實(shí)施BLAST分析的軟件。此算法包括首先通過鑒定查詢序列中長(zhǎng)度為W的短“詞”來鑒定高評(píng)分序列對(duì)(HSP)，該“詞“與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的“詞”比對(duì)時(shí)匹配或滿足某些正域值T。T稱為毗鄰詞評(píng)分域值(Altschul等，同上)。這些最初的毗鄰詞命中(hit)可作為種子來啟動(dòng)檢索以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長(zhǎng)HSP。然后將詞命中沿各序列的二個(gè)方向盡量遠(yuǎn)地延伸以增加累積比對(duì)評(píng)分。對(duì)于核苷酸序列，可采用參數(shù)M(—對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)分，總是>0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分，總是〈O)計(jì)算累積評(píng)分。對(duì)于氨基酸序列，可利用評(píng)分矩陣計(jì)算出累積評(píng)分。當(dāng)出現(xiàn):累積比對(duì)評(píng)分從其達(dá)到的最大值跌落數(shù)量X ;累積評(píng)分因累積了一個(gè)或多個(gè)負(fù)分殘基比對(duì)而到零或以下；或到達(dá)任一序列的末端時(shí)，詞命中向二方向的延伸終止。BLAST算法的參數(shù)W、T和X決定了此算法的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默認(rèn)詞長(zhǎng)(W)為11、預(yù)期值(E)為10、M=5、N=-4和比較二條鏈。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序默認(rèn)詞長(zhǎng)(W)為3、預(yù)期值(E)為10、和BLOSUM62評(píng)分矩陣(參見 Henikoff 和 Henikoff (1989)Proc.Nat’ I Acad.Sc1.USA 89:10915)。
[0088]除了計(jì)算序列相同性百分比外，BLAST算法也能執(zhí)行二條序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見例如 Karl in 和 Altschul (1993) Proc.Nat’I Acad.Sc1.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的一種相似性測(cè)定方法是最小秩和概率(P(N))，其提供二條核苷酸或氨基酸序列之間隨機(jī)匹配的概率。例如，如果在測(cè)試核酸與參比核酸的比較中最小秩和概率小于0.1，更優(yōu)選小于0.01，最優(yōu)選小于0.001，則認(rèn)為此核酸與參比序列相似。
[0089]二條核酸序列或蛋白基本上相同的另一指標(biāo)是:第一核酸編碼的蛋白質(zhì)與第二核酸編碼的蛋白質(zhì)能進(jìn)行免疫交叉反應(yīng)，如下文所述。因此，如果二個(gè)多肽的差別僅在于保守性取代，那么第一種蛋白質(zhì)通常與第二種蛋白質(zhì)基本相同。二種核酸序列基本相同的另一指標(biāo)是這二種分子能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下相互雜交，如下文所述。
[0090]短語(yǔ)“特異性雜交”指在某序列存在于復(fù)雜的混合(如總細(xì)胞)DNA或RNA中時(shí)，某分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下只與該特定的核苷酸序列結(jié)合、形成雙鏈體或雜交。
[0091]術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)條件”指探針能與其靶序列雜交，而不與其它序列雜交的條件。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴的，在不同環(huán)境中不同。較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性雜交。在確定的離子強(qiáng)度和PH條件下，嚴(yán) 謹(jǐn)條件一般選擇比特定序列的解鏈溫度(Tm)低約15°C。此Tm是(在確定的離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下)與靶序列互補(bǔ)的探針有50%與該靶序列雜交達(dá)到平衡時(shí)的溫度。(由于在Tm時(shí)靶序列通常過量存在，平衡時(shí)只有50%的探針被占據(jù))。通常嚴(yán)謹(jǐn)條件是鹽濃度低于約1.0M鈉離子，典型的是約0.01 - 1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，ρΗ7.0 - 8.3,短探針(10 - 15個(gè)核苷酸)的溫度至少約30°C，長(zhǎng)探針(50全核苷酸以上)的溫度至少約60°C。也可通過加入去穩(wěn)定試劑如甲酰胺來實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)條件。對(duì)于選擇性和特異性雜交，陽(yáng)性信號(hào)通常應(yīng)是背景的至少二倍，優(yōu)選背景雜交的10倍。示范性嚴(yán)謹(jǐn)條件如下:50% 甲酰胺、5x SSC和 1%SDS，42°C培育，或 5x SSC、1%SDS，65°C培育，65°C用 0.2xSSC和0.1%SDS洗滌。對(duì)于PCR，通常在溫度約36 °C作低嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增，雖然退火溫度要根據(jù)引物長(zhǎng)度在約32-48°C之間變化。對(duì)于高嚴(yán)謹(jǐn)PCR擴(kuò)增，通常溫度為約62°C，雖然高嚴(yán)謹(jǐn)退火溫度范圍為約50°C至約65°C，這取決于引物長(zhǎng)度和特異性。高和低嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增的典型循環(huán)條件包括:90-95°C變性30-120秒，退火持續(xù)30-120秒，約72°C延伸I 一 2分鐘。低和高嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增反應(yīng)和方法和指南可參見例如Innis等，(1990)PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications (PCR 方案:方法和應(yīng)用指南)學(xué)術(shù)出版社(Academic Press),紐約。[0092]當(dāng)用短語(yǔ)“特異性結(jié)合蛋白”或“與其特異性免疫反應(yīng)”述及抗體時(shí)，指測(cè)定蛋白和其它生物物質(zhì)的異質(zhì)群體中是否存在該蛋白的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定的免疫試驗(yàn)條件下，特定抗體能優(yōu)先結(jié)合特定的蛋白質(zhì)，而與樣品中存在的其它蛋白的結(jié)合量不明顯。在這種條件下特異性結(jié)合某蛋白要求選擇對(duì)該特定蛋白具有特異性的抗體?？刹捎枚喾N免疫試驗(yàn)來選擇能與特定蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，常規(guī)采用固相ELISA免疫試驗(yàn)來選擇能與某蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗體。參見Harlow和Lane (1988)Antibodies, A Laboratory Manual (抗體,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，冷泉港出版社,紐約中描述的免疫試驗(yàn)方法和條件可用于測(cè)定特異性免疫反應(yīng)。
[0093]特定多核苷酸序列的“保守性修飾變體”指編碼相同或基本上相同的氨基酸序列的那些多核苷酸，或如果該多核苷酸不編碼氨基酸序列，則指基本相同的序列。因?yàn)榛蛎艽a的簡(jiǎn)并性，任一給定的蛋白質(zhì)可由許多功能上相同的核酸編碼。例如，密碼子CGU、CGC、CGA,CGG,AGA和AGG都編碼氨基酸精氨酸。因此，在密碼子編碼精氨酸的每個(gè)位置，該密碼子可用所述的另一種相應(yīng)密碼子代替，而不會(huì)改變編碼的蛋白質(zhì)。這類核酸差異是“沉默變異”，是“保守性修飾變異”的一種。除另有說明外，本文所述編碼蛋白質(zhì)的每種多核苷酸序列，也描述了可能的沉默變異。技術(shù)人員知道可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)修飾核酸中的每個(gè)密碼子(除了 AUG通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，和UGG通常是色氨酸的唯一密碼子)以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼蛋白質(zhì)的各核酸的“沉默變異”通常隱含在各所述序列中。
[0094]技術(shù)人員知道許多氨基酸可取代蛋白質(zhì)中的另一種氨基酸而不影響此蛋白質(zhì)的功能，例如，保守性取代可能是蛋白質(zhì)，如公開的細(xì)胞壁溶解蛋白的保守性修飾變體的基礎(chǔ)。下文給出了保守性氨基酸取代的不完全名單。以下8組各含有通常可互相保守性取代的氨基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ;4)精氨酸(R)、賴氨酸⑷；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)、丙氨酸(A) ;6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W) ；7)絲氨酸⑶、蘇氨酸⑴、半胱氨酸(C);和8)半胱氨.酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如Creighton (1984) Proteins)。
[0095]另外，技術(shù)人員知道，如果改變導(dǎo)致用化學(xué)上相似的氨基酸取代某氨基酸，則編碼序列中改變、加入或刪除一個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸(通常不到5%，更典型不到1%)的各取代、刪除或添加是有效的“保守性修飾變異”。本領(lǐng)域熟知提供功能類似氨基酸的保守性取代表。
[0096]技術(shù)人員知道蛋白質(zhì)的許多保守性變異，如細(xì)胞壁溶解蛋白，編碼蛋白質(zhì)的核酸產(chǎn)生基本上相同的產(chǎn)物。例如，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，“沉默取代”(如不會(huì)導(dǎo)致所編碼蛋白改變的核酸序列取代)是編碼某氨基酸的各核酸序列的隱含特征。如本文所述，宜優(yōu)化所述序列在用于產(chǎn)生細(xì)胞壁溶解蛋白的宿主細(xì)胞(如酵母菌、人等)中的表達(dá)。類似地，“保守性氨基酸取代”是氨基酸序列中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被性質(zhì)高度相似的不同氨基酸取代，不難鑒定為高度類似于特定氨基酸序列，或高度類似于編碼氨基酸的特定核酸序列。任何一種特定序列的這種保守性取代變異是本發(fā)明的特征。也可參見Creighton(1984)Proteins (蛋白質(zhì))，WHF公司(ff.H.Freeman and Company)。此外，編碼序列中改變、加入或刪除一個(gè)氨基酸或小百分比例的氨基酸的各種取代、刪除或添加通常也是“保守性修飾變異”。
[0097]本發(fā)明的實(shí)施包括構(gòu)建重組核酸和在宿主細(xì)胞，優(yōu)選宿主菌細(xì)胞中表達(dá)基因。對(duì)特定宿主要采用優(yōu)化的密碼子選擇。本領(lǐng)域知道可用分子克隆技術(shù)達(dá)到此目的。適合構(gòu)建重組核酸和表達(dá)載體的各種克隆及體外擴(kuò)增方法是技術(shù)人員熟知的。足以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行許多克隆實(shí)驗(yàn)的這類技術(shù)和指導(dǎo)的例子可見Berger和Kimmel, Guide to MolecularCloning Techniques (分子克隆技術(shù)指南)，Methods in Enzymology (酶學(xué)方法)”152 卷，學(xué)術(shù)出版社公司，圣迭戈，加利福尼亞州(Berger)和Current Protocols in MolecularBiology (最新分子生物學(xué)方法)Ausubel等編,Current Protocols (最新方案),格林出版合伙公司和約翰威利父子公司合資企業(yè)(1999增刊)(Ausubel)。表達(dá)重組多肽的合適宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括例如，原核細(xì)胞如大腸桿菌，和真核細(xì)胞，包括昆蟲、哺乳動(dòng)物和真菌細(xì)胞(如黑曲霉菌(Aspergillus niger))。
[0098]足以指導(dǎo)技術(shù)人員實(shí)施體外擴(kuò)增方法的方案的例子包括:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、Q -復(fù)制酶擴(kuò)增和其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)，可參見Berger、Sambrook和Ausubel的有關(guān)著作，以及Mullis等，(1987)美國(guó)專利號(hào)4，683，202;PCRProtocols A Guide to Methods and Applications (PCR 方案:方法與應(yīng)用指南)(Innis等編)學(xué)術(shù)出版社公司，圣迭戈，加利福尼亞州(1990) (Innis) ;Arnheim和Levinson (1990年 10 月 I 日)C&EN 36-47;The Journal Of NIH Research(1991)3:81-94;(Kwoh 等，(1989)Proc.Nat， I Acad.Sc1.USA 86:1173;Guatelli 等(1990)Proc.Nat， I Acad.Sc1.USA 87:1874;Lomel 等，(1989)J.Clin.Chem.35:1826;Landegren 等(1988)Science241:1077-1080;Van Brunt(1990)Biotechnology 8:291-294;ffu 和 Wallace(1989)Gene4:560;以及Barringer等，(1990)Gene 89:117。體外克隆擴(kuò)增核酸改進(jìn)方法的描述可參見Wallace等的美國(guó)專利號(hào)5，426，039。
[0099]IV.商業(yè)應(yīng)用
[0100]可立即明白所述的酶活性有多種用途。一種重要的應(yīng)用是抗菌處理正常使用時(shí)可能遭污染的物品?？捎眠@些物質(zhì)處理可能危害公眾健康的被靶細(xì)菌污染的部位、設(shè)備、環(huán)境等。感興趣的部位包括有可能對(duì)付含靶細(xì)菌的材料的公共衛(wèi)生設(shè)施。這類材料包括廢物，如液體、固體或空氣。廢水處理設(shè)施可整合這些酶活性物質(zhì)以消除靶細(xì)菌流出，不論是直接利用酶處理還是通過釋 放產(chǎn)生酶的細(xì)胞?？蓪⑵浼拥焦腆w廢物地點(diǎn)以最大程度減少靶細(xì)菌暴發(fā)。相反，食品制備區(qū)域或設(shè)備必須定期清潔，本發(fā)明提供了有效消除靶細(xì)菌的組合物和手段。受污染的醫(yī)療和其它公共環(huán)境可批準(zhǔn)類似手段來盡可能減少靶微生物的生長(zhǎng)和傳播?？蓪⑦@些方法用于需要滅菌消除靶細(xì)菌的環(huán)境，包括重癥護(hù)理室的空氣過濾系統(tǒng)。
[0101]另一種應(yīng)用包括用于獸醫(yī)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。檢測(cè)是否存在特定細(xì)菌或鑒定特定靶細(xì)菌的方法可利用選擇性試劑對(duì)菌群或培養(yǎng)菌的作用。清潔制劑，包括動(dòng)物或?qū)櫸锏南礈炱分袃?yōu)選包含抑菌或殺菌活性物質(zhì)。
[0102]可用0RF56和相關(guān)多肽治療，例如人或動(dòng)物的細(xì)菌感染。這些多肽可預(yù)防給藥或可給予已接觸細(xì)菌感染的對(duì)象。在優(yōu)選實(shí)施方式中，采用0RF56多肽來治療復(fù)制緩慢細(xì)菌引起的感染，因?yàn)槠錃麢C(jī)制不依賴于宿主細(xì)胞的復(fù)制。許多抗菌制劑如抗生素對(duì)付復(fù)制細(xì)菌最有用。復(fù)制緩慢的細(xì)菌的倍增時(shí)間例如約為1-72小時(shí)、1-48小時(shí)、1-24小時(shí)、1_12小時(shí)、1-6小時(shí)、1-3小時(shí)或1-2小時(shí)。
[0103]在一優(yōu)選實(shí)施方式中，用這些蛋白治療受各葡萄球菌種感染的人或其它哺乳動(dòng)物。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，用0RF56或0RF49蛋白治療受甲氧西林耐藥性葡萄球菌種感染的人或其它動(dòng)物。
[0104]V.給藥
[0105]給藥途徑和劑量視感染菌株、部位和感染程度(如局部或全身感染)及所治療對(duì)象而不同。給藥途徑包括但不限于:口服、肺部遞送的氣溶膠或其它裝置、鼻噴霧、靜脈內(nèi)(IV)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、眼內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部給藥，腰椎穿剌、鞘內(nèi)、和直接應(yīng)用于腦和/或腦膜。采用賦形劑作為運(yùn)載體遞送治療劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。例如，可采用凍干形式的酶在給藥前溶解后IV注射?？紤]的給藥劑量范圍是感染宿主中每個(gè)細(xì)菌約0.03,0.1,0.3、1、10、30、100、300、1000、3000、10000更多個(gè)酶分子。取決于此蛋白質(zhì)的大小，其本身可串聯(lián)結(jié)合或是多亞基形式(二聚體、三聚體、四聚體、五聚體等等)，或可與一種或多種其它實(shí)體，如特異性不同的酶或片段組合，劑量可以是每千克體重每天約100萬至約10兆個(gè)分子，優(yōu)選每千克體重每天約I兆個(gè)分子，可以是每千克體重每天約10E6殺傷單位至約10E13殺傷單位。
[0106]評(píng)價(jià)殺傷力的方法類似于技術(shù)人員評(píng)價(jià)完整復(fù)制性噬菌體所用的方法，例如噬斑形成單位或pfu，雖然測(cè)定殺傷單位滴定后細(xì)菌存活數(shù)來評(píng)價(jià)殺傷單位更好。然而，用殺傷定量測(cè)定更為清楚，因?yàn)榉菑?fù)制性噬菌體不能在菌苔上形成噬斑。故常規(guī)采用連續(xù)稀釋方法代替標(biāo)準(zhǔn)的Pfu來評(píng)價(jià)“殺傷”單位量。使細(xì)菌培養(yǎng)液的連續(xù)稀釋液接觸此殺傷組合物可定量測(cè)定殺傷單位?；蛘?，比較細(xì)菌總數(shù)與活菌落單位可確定哪部分細(xì)菌實(shí)際存活，提示哪部分對(duì)該殺傷構(gòu)建物敏感。對(duì)人工或?qū)ｉT制備底物的活性的其它測(cè)量方法常可用作對(duì)殺傷單位測(cè)量的替代方法。
[0107]通常給予治療劑直到成功消除了致病菌，雖可采用廣譜制劑，同時(shí)測(cè)定對(duì)感染菌株的具體診斷。因此本發(fā)明考慮了本發(fā)明組合物的單劑型(single dosage form)和多劑型(multiple dosage form),以及實(shí)施緩釋方式遞送這種單劑型和多劑型的方法。
[0108]對(duì)于肺部或其 它粘膜表面的氣溶膠給藥，可將治療組合物摻入專門設(shè)計(jì)用于給藥的氣溶膠制劑中。本領(lǐng)域?qū)馊苣z知之甚多，本發(fā)明不限于任何具體制劑。氣溶膠的一個(gè)例子是先林德雅公司(Schering-Plough)生產(chǎn)的Proventil吸入器,它所含的推進(jìn)劑是三氯一氟甲烷、二氯二氟甲烷和油酸。其它實(shí)施方式包括專門設(shè)計(jì)通過對(duì)象或病人的鼻腔和鼻竇給藥的吸入器。如果需要可根據(jù)治療用的具體組合物調(diào)節(jié)推進(jìn)劑和乳化劑的濃度。每次氣溶膠治療給予的酶殺傷單位數(shù)量通常在約10E6-10E13殺傷單位范圍內(nèi)，優(yōu)選約10E12個(gè)殺傷單位。
[0109]評(píng)價(jià)殺傷力的方法常類似于作用于完整復(fù)制型噬菌體所用的許多方法。具體地說，殺傷定量測(cè)定更困難，因?yàn)榉菑?fù)制型噬菌體在細(xì)菌上不形成噬斑。故需要用連續(xù)稀釋方法來評(píng)價(jià)“殺傷”單位的量，其實(shí)施類似于標(biāo)準(zhǔn)的Pfu(噬斑形成單位)，但不能利用菌苔上發(fā)生的殺傷或擴(kuò)增。使細(xì)菌培養(yǎng)液的連續(xù)稀釋液接觸此殺傷組合物可定量測(cè)定殺傷單位?；蛘撸容^細(xì)菌總數(shù)與活菌落單位可確定哪部分細(xì)菌實(shí)際存活，提示哪部分對(duì)該殺傷構(gòu)建物敏感。評(píng)價(jià)靜態(tài)活性的其它方法包括胞內(nèi)成分(無論是天然的或載入的)的釋放，或?qū)?duì)應(yīng)于天然細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的已確定或制備的底物的酶活性。
[0110]通常，所述殺傷將減少細(xì)菌的復(fù)制能力至少約3倍，可能影響其復(fù)制約10、30、100、300倍至許多數(shù)量級(jí)。然而，即使減慢細(xì)菌復(fù)制而不殺死它們也具有顯著療效或商業(yè)價(jià)值。優(yōu)選的基因滅活效力是0.1,0.2,0.3,0.5,0.8、1、1.5,2.0,2.5,3.0,3.5、4、5、6、7、8、或更高對(duì)數(shù)單位。
[0111]V1.制劑
[0112]本發(fā)明也考慮了以藥學(xué)上可接受的賦形劑提供的本發(fā)明的含至少一種細(xì)胞壁降解酶，如胞壁酸酶的藥物組合物。因此，本發(fā)明的制劑和藥物組合物包括含有以下的制劑:對(duì)細(xì)菌具有特異性的分離的酶區(qū)段；是作用于相同或典型細(xì)菌宿主的二種、三種、五種、十種、或二十種或更多種酶的混合物；和作用于不同細(xì)菌或同一細(xì)菌不同菌株的二種、三種、五種、十種、或二十種或更多種酶的混合物，例如能共同抑制金黃色葡萄球菌的多種菌株生長(zhǎng)的酶的混合物。本發(fā)明的組合物可以此方式配制而滿足病人的需要。所述化合物或組合物通常是滅菌的或接近無菌的。
[0113]本文中，"治療有效劑量"指給予后能產(chǎn)生抑菌，或優(yōu)選殺菌效果的劑量。其精確量取決于治療目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員采用已知技術(shù)可確定。參見例如Ansel等人，“Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery (藥物的劑型和藥物遞送)”；Lieberman (1992) “Pharmaceutical Dosage Forms (藥物劑型(1-3 卷)、Dekker, ISBN0824770846,082476918X,0824712692,0824716981 ；Lloyd(1999)The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding (藥物組合的藝術(shù)、科學(xué)和技術(shù))；和Pickar(1999) “Dosage Calculations.(劑量計(jì)算)”。如本領(lǐng)域所知，必須(根據(jù))蛋白質(zhì)降解、全身與局部的藥物遞送、新蛋白酶合成的速率，以及病人的體重、總體健康狀況、性另Ij、飲食、給藥時(shí)間、藥物相互作用、菌落中的細(xì)菌成分譜系、病況的嚴(yán)重性作出調(diào)整，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)此可用某些實(shí)驗(yàn)來測(cè)定。
[0114]本領(lǐng)域熟知各種藥學(xué)上可接受的賦形劑。本文所用的“藥學(xué)上可接受的賦形劑”包括當(dāng)與組合物的活性成分混合時(shí)，能維持該成分的生物學(xué)活性而不會(huì)引起對(duì)象免疫系統(tǒng)的破壞作用的物質(zhì)。這類物質(zhì)包括穩(wěn)定劑、防腐劑、鹽或糖的復(fù)合物或晶體等等。
[0115]示范性的藥物運(yùn) 載體包括無菌的水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。例子包括但不限于:標(biāo)準(zhǔn)的藥物賦形劑，如磷酸緩沖鹽水、水、乳液如油/水乳液，和各種類型的濕潤(rùn)齊U。非水溶劑的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油，例如橄欖油和可注射有機(jī)脂如油酸乙脂。水性運(yùn)載體包括:水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸外運(yùn)載體包括:氯化鈉溶液、林格葡萄糖液、葡萄糖和氯化鈉液、乳酸林格液或非揮發(fā)油。靜脈內(nèi)運(yùn)載體包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如基于林格葡萄糖的那些)等等。在其它實(shí)施方式中，將此組合物摻入到固相基質(zhì)，包括緩釋顆粒、玻璃珠、繃帶、眼睛插片和局部應(yīng)用形式。
[0116]也可用本領(lǐng)域熟知的方法凍干本發(fā)明的含酶組合物，例如隨后按本發(fā)明所述重建和使用。
[0117]還有令人感興趣的是脂質(zhì)體遞送制劑，和微膠囊化酶(包含糖晶體)的制劑?？捎檬熘某Ｒ?guī)方法配制包含這種賦形劑的組合物(參見，Remington’ s PharmaceuticalSciences (雷明頓藥物科學(xué))，13章，14版,馬克出版公司(Mack Publishing Col),伊斯頓市(Easton)，賓夕法尼州18042，美國(guó))。
[0118]通?？芍苽涓鞣N形式的藥物組合物，例如顆粒、片劑、丸劑、栓劑、膠囊(如適用于口服)、微珠、微球、脂質(zhì)體、懸液、藥膏、洗劑等?？刹捎眠m合口服和局部應(yīng)用的藥學(xué)級(jí)有機(jī)或無機(jī)運(yùn)載體制備包含治療活性化合物的組合物。本領(lǐng)域已知的稀釋劑包括水性介質(zhì)、植物和動(dòng)物油及脂肪。制劑可摻入穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑和乳化劑、鹽以改變滲透壓或緩沖劑以確保合適的pH值。
[0119]此藥物組合物可包含除“溶解”酶外的其它組分。此外，此藥物組合物可一種以上的活性成分，如二種以上、三種以上、五種以上、十種以上不同的酶，這些不同的酶對(duì)同一種細(xì)菌、不同種細(xì)菌或相伴細(xì)菌具有特異性。例如，此藥物組合物可包含多種(如至少二種以上)明確的細(xì)胞壁降解酶，其中組合物中至少兩種酶具有不同的細(xì)菌特異性。以這種方式，此治療組合物可適用于治療不同細(xì)菌的混合感染，或可以是一種能選擇性作用于特定環(huán)境常見的各種類型感染的組合物。例如，可通過選擇衍生自特異性不同的各種噬菌體的不同組壁降解性或“溶解”酶組成這種選擇性，其包含至少一種對(duì)懷疑存在于感染(例如，感染部位中)中的不同細(xì)菌或關(guān)鍵細(xì)菌(如特定菌株等)有效的成分。如上所述，可與其它藥物，如常規(guī)的抗微生物劑一起給予此壁降解性酶。在某些實(shí)施方式中，可能需要在同一制劑中給予此種酶和抗生素。
[0120]VI1.方法
[0121]實(shí)施本發(fā)明的某些方面包括普通臨床微生物學(xué)的熟知方法、處理細(xì)菌噬菌體的常規(guī)方法、和普通生物學(xué)基礎(chǔ)、原理和方法。這類方法的參考文獻(xiàn)列于下文中，出于所有目的均納入本文作參考。
[0122]A.普通臨床微生物學(xué)
[0123]普通微生物學(xué)是研究微生物的科學(xué)。參見例如Sonenshein等，(2002出版)“枯草芽孢桿菌及其最近親屬:從基因到細(xì)胞(Bacillus Subtilis and ItsClosest Relatives: From Genes to Cells)，，Amer.Soc.Microbiol.，ISBN: 1555812058; Alexander 和 Strete (2001)的“微生物學(xué):實(shí)驗(yàn)室圖片冊(cè)(Microbiology:APhotographic Atlas for the Laboratory)，，Ben jamin/Cummings, ISBN: 0805327320;Cann(2001) “分子病毒學(xué)原理(Principles of Molecular Virology)” (CD-ROM書籍，第3版)，ISBN:012.1585336;Garrity (2005出版)“系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)(Bergey 1 s Manual of Systematic Bacteriology) ” (2 卷，第 2 版)普萊納姆公司(Plenum), ISBN: 0387950400; Salyers 和 Whitt(2OOl) “細(xì)菌的致病機(jī)理:分子方法(Bacterial Pathogenesis:A Molecular Approach)，，(第 2 版)Amer.Soc.Microbiol.，ISBN: 155581171X; Tierno (2001) “病菌的機(jī)密生活:微生物獵手的觀察和教訓(xùn)(The Secret Life of Germs: Observations and Lessons from a MicrobeHunter)” 袋星公司(Pocket Star), ISBN: 0743421876; Block (2000 出版)“消毒、滅菌和防腐(Disinfection, Sterilization, and Preservation)”(第 5 版)Lffff 出版公司(Lippincott ffilliams&ffilkins Publ.), ISBN:0683307401;Cullimore(2000)“細(xì)菌鑒定的實(shí)用圖冊(cè)(Practical Atlas for Bacterial Identification) ” LewisPub.，ISBN: 1566703921;Madigan 等(2000) “微生物的布魯克生物學(xué)(Brock Biologyof Microorganisms)” (第 9 版)PH 公司(Prentice Hall), ASIN:0130819220;Maier等(2OOO 出版)“環(huán)境微生物學(xué)(Environmental Microbiology) ” AcademicPr.，ISBN:0124975704;Tortora 等(2000) “微生物學(xué)，引言(Microbiology:AnIntroduction) ” 包括微生物學(xué) Place (TM)的網(wǎng)址，學(xué)生指導(dǎo)(Student Tutorial)CD-ROM, T 和細(xì)菌 ID CD-ROM (第 7 版)，Ben jamin/Cummings, ISBN 0805375546; Demain等(1999出版)“工業(yè)微生物學(xué)和生物技術(shù)手冊(cè)(Manual of Industrial Microbiologyand Biotechnology)” (第 2 版)Amer.Soc.Microbiol.， ISBN:1555811280;Flint等(1999出版)“病毒學(xué)、分子生物學(xué)、病理學(xué)和控制的原理(Principles ofVirology:Molecular Biology,Pathogenesis, and Control) ”Amer.Soc.Microbiol.，ISBN:1555811272;Murray 等式(1999 出版)“臨床微生物學(xué)手冊(cè)(Manual of ClinicalMicrobiology)”(第 7 版)Amer.Soc.Microbiol., ISBN:1555811264;Burlage 等(1998出版)“微生物生態(tài)學(xué)技術(shù)(Techniques in Microbial Ecology) ”牛津大學(xué)出版社ISBN:0195092236;Forbes 等(1998) “Bailey&Scott ' s 診斷微生物學(xué))”(第 10 版)Mosby，ASIN:0815125356; Schaechter 等(1998 出版)“微生物致病機(jī)制(Mechanisms ofMicrobial Disease)，，(第 3 版)LWW 公司，ISBN: 0683076051; Tomes (1998) “細(xì)菌、男人、女人和微生物在美國(guó)人生命中的準(zhǔn)則(The Gospel of Germs:Men，Women，and the Microbein American Life) nHarvard Univ.Pr.，ISBN: 0674357078; Snyder 和 Champness (1997)“細(xì)菌的分子學(xué)(Molecular Genetics of Bacteria)，，Amer.Soc.Microbiol.，ISBN: 1555811027;Karlen(1996) “男人和細(xì)菌:歷史和現(xiàn)代的疾病和瘟疫(MAN AND MICROBES:Diseaseand Plagues in History and Modern Times) ”Touchstone Books,ISBN:0684822709;以及 Bergey (1994 出版)“決定性細(xì)菌學(xué)手冊(cè)(Bergey ' s Manual of DeterminativeBacteriology) ”(第 9 版)LWW公司，ISBN:0683006037。
[0124]B.處理細(xì)菌噬菌體的通用方法
[0125]處理細(xì)菌噬菌體的方法是熟知的，例如參見Snustad和Dean(2002) “細(xì)菌病毒的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)(Genetics Experiments with Bacterial Viruses)，，F(xiàn)reeman;0' Brien 和Aitken (2002出版)“抗體的嗷菌體展示:方法和方案(Display:Methods and Protocols)”休瑪納公司；Ring和Blair (eds.2000) “遺傳工程產(chǎn)生的病毒(Genetically EngineeredViruses)” BIOS Sc1.Pub.; Adolf (1995出版)“分子遺傳學(xué)方法:病毒基因技術(shù)(Methodsin Molecular Genetics: Viral Gene Techniques)，，第 6 卷，Elsevier; Adolf (1995 出版)“分子遺傳學(xué)方法:病毒基因技術(shù)(Methods in Molecular Genetics:Viral GeneTechniques) ”第7卷，Elsevier;以及Hoban和Rott (1988出版)“細(xì)菌病毒系統(tǒng)分子生物學(xué)(Molec.Biol, of Bacterial Virus Systems)，，(Current Topics in Microbiology andImmunology N0.136) S-V 公司(Springer-Verlag)0
[0126]C.生物技術(shù)、原理和方法的通用基礎(chǔ)
[0127]生物技術(shù)、原理和方法的通用基礎(chǔ)的描述可參見例如Alberts等(2002) “細(xì)胞的分子生物學(xué)(Molecular Biology of the Cell)”(第 4 版)GarlandISBN:0815332181;Lodish,等.(1999)“分子細(xì)胞生物學(xué)(Molecular Cell Biology)”(第4版)Freeman，ISBN = O7I6737O6X; Janeway等(2OOl 出版)“免疫學(xué)(Immunobiology)(第5版)Garland, ISBN:081533642X;Flint等(1999出版)“病毒學(xué)、分子生物學(xué)、病理學(xué)和控制的原理(Principles of Virology:Molecular Biology, Pathogenesis, and Control)，，Am.Soc.Microbiol., ISBN: 1555811272;Nelson (2000) “生物化學(xué)原理(Lehninger Principlesof Biochemistry)”(第 3 版)Worth，ISBN: 1572599316;Freshney (2000) “動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng):基本技術(shù)手冊(cè)(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique) ”(第 4版)Wiley-Liss; ISBN: 0471348899; Arias 和 Stewart (2002) “動(dòng)物發(fā)育的原理(MolecularPrinciples of Animal Development，)，，牛津大學(xué)出版社，ISBN:0198792840;Griffiths,等(2000) “遺傳分析的引言(An Introduction to Genetic Analysis) ”(第 7 版)Freeman, ISBN:071673771X;Kierszenbaum(2001)“歷史和細(xì)胞生物學(xué)(Histology and Cell Biology,) Mosby, ISBN:0323016391; Weaver (2001) “分子生物學(xué)(Molecular Biology) ”(第2 版)McGraw-Hi11，ISBN:0072345179;Barker(1998)At the Bench:A LaboratoryNavigator CSH Laboratory, ISBN:0879695234;Branden 和 Tooze (1999) “引入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中(Introduction to Protein Structure) ”(第 2 版)，Garland Publishing; ISBN:0815323050; Sambrook和Russell (2001) “分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(第3卷?，第3d版)，CSHLab.Press, ISBN:0879695773;以及 Scopes (1994) “蛋白質(zhì)純化:原理和實(shí)踐(ProteinPurification:Principles and Practice)，，(第 3版)Springer Verlag, ISBN:0387940723。
[0128]D.誘變:位點(diǎn)特異性、隨機(jī)、改組
[0129]根據(jù)本文提供的結(jié)構(gòu)和功能說明，可分離得到或產(chǎn)生產(chǎn)優(yōu)化了優(yōu)選特征的同源物或變體。因此，可通過結(jié)構(gòu)同源性或評(píng)價(jià)特征性基因構(gòu)成基序中發(fā)現(xiàn)的實(shí)體而發(fā)現(xiàn)噬菌體穿透功能的催化性區(qū)段。可檢測(cè)通常見于特定基因排列中的噬菌體尾基因和相應(yīng)排列中的其它基序有無細(xì)胞壁降解活性。這些基序也可作為篩選結(jié)構(gòu)變體的起始點(diǎn)，例如誘變這種結(jié)構(gòu)并篩檢它們是否具有所需特性，如更廣的底物特異性。采用的標(biāo)準(zhǔn)誘變方法可參見例如 Johnson-Boaz 等，(1994)Mol.Microbiol.13:495-504;美國(guó)專利 6，506，602、6，518，065、6，521，453,6, 579，678、和它們所引用的參考文獻(xiàn)。
[0130]類似地可鑒定結(jié)合區(qū)段，可篩檢優(yōu)勢(shì)或特異性靶基序中能與它們相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些靶基序的許多可能是含有在各種潛在靶菌株上發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)的高表達(dá)蛋白質(zhì)、糖類或脂質(zhì)。雖然已知許多蛋白質(zhì)能結(jié)合細(xì)胞壁，但二個(gè)家族包括在昆蟲到哺乳動(dòng)物的物種中發(fā)現(xiàn)的肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRP,參見例如Dziarski和Gupta(2006) “肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRPs) (The peptidoglycan recognition proteins (PGRPs))，，Genome Biol.7:232, PMID: 16930467;Dziarski 和 Gupta(2006) “哺乳動(dòng)物的 PGRP: 一種新的抗菌蛋白質(zhì)(Mammalian PGRPs:novel antibacterial proteins)，，Cell Microbiol.8:1059-69, PMID:16819960;Lu等，(2006) “肽聚糖識(shí)別蛋白是一種新類型的人殺菌蛋白(Peptidoglycanrecognition proteins are a new class of human bactericidal proteins)，，J.Biol.Chem.281:5895-5907;Dziarski (2004) “肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRPs) (Peptidoglycanrecognition proteins (PGRPs) ” Mol.1mmunol.40:877-886，PMID: 14698226 ; Guan 等，(2004) “人肽聚糖識(shí)別蛋白Ia的C-末端肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)(Crystalstructure of the C—terminal peptidoglycan-binding domain of human peptidoglycanrecognition protein la) ” J.Biol.Chem.279:31873-882; Liu 等(2001) “妝聚糖識(shí)別蛋白:四種人先天免疫模式識(shí)別分子的新家族(Peptidoglycan Recognition Proteins:anovel family of four human innate immunity pattern recognition molecules)，，J.Biol.Chem.276:34686-694;和Werner等，(2000) “黑腹果蠅的肽聚糖識(shí)別蛋白家族(A family of peptidoglycan recognition proteins in the fruit fly Drosophilamelanogaster) ”Proc.Nat’ I Acad.Sc1.USA 97:13772-777)。在這些蛋白 C-末端發(fā)現(xiàn)有一個(gè)約60個(gè)氨基酸的保守區(qū)段，利用PubMed或序列檢索可發(fā)現(xiàn)其它區(qū)段。能結(jié)合細(xì)菌的另一組蛋白是toll-樣受體(TLR)，特別是能直接檢測(cè)細(xì)菌LPS的TLR4 ;能結(jié)合細(xì)菌脂蛋白、肽聚糖和酵母菌酵母多糖(zymosan)的TLR2 ;能結(jié)合雙鏈RNA的TLR3以及能識(shí)別鞭毛蛋白(細(xì)菌鞭毛上的蛋白)的TLR5。在細(xì)菌細(xì)胞外部發(fā)現(xiàn)的菌毛結(jié)構(gòu)可能是結(jié)合的蛋白靶標(biāo)的另一種結(jié)構(gòu)。誘變可能拓寬結(jié)合的選擇性或提高區(qū)段或整個(gè)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而刪除策略可消除外部區(qū)段。
[0131]革蘭陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁組分可能與革蘭陰性菌細(xì)胞壁組分相同，或可能與其它分枝桿菌或孢子菌相同。然而，革蘭陰性菌可能有一層額外的壁，其作用是對(duì)抗噬菌體入侵的額外屏障。噬菌體或其它細(xì)菌的其它活性可能聯(lián)合作用以穿透更為復(fù)雜的革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。具休地說，一種構(gòu)建物中的多個(gè)催化區(qū)段可提供多種活性，在功能上協(xié)同作用，或當(dāng)與另一種治療劑如抗生素或抗微生物劑聯(lián)用時(shí)提供協(xié)同作用。.[0132]靶向部分能提高催化片段的局部濃度，但長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)慕宇^也增加局部的胞壁降解作用。因此，可利用與靶標(biāo)和催化性基序相容的長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)慕宇^，從而提高催化穿透活性，進(jìn)而導(dǎo)致抑制或殺傷靶細(xì)菌。
[0133]本發(fā)明部分的概念進(jìn)步是認(rèn)識(shí)到所選擇的噬菌體常在不適宜的生物學(xué)條件下在細(xì)胞外存活。因此，這種結(jié)構(gòu)可能特別結(jié)實(shí)和牢固而能耐受可能滅活噬菌體的環(huán)境條件。能在不適宜環(huán)境，例如溫度、鹽、氧化或極端反應(yīng)、高壓等極端環(huán)境中存活的細(xì)菌可能具有特別適合在細(xì)胞外存活的噬菌體。這些噬菌體結(jié)實(shí)，能耐受那些極端環(huán)境，使它們可能比含有沒以經(jīng)歷類似選擇的蛋白質(zhì)的噬菌體更易存活。衍生自那些來源的多肽各種純化過程、貯存和藥理學(xué)條件下可能更穩(wěn)定。本發(fā)明另一方面內(nèi)容來自于TAME結(jié)構(gòu)的目的是識(shí)別和結(jié)合靶細(xì)菌而非要快速殺死該細(xì)胞這一假設(shè)。因此，TAME進(jìn)化成不要求在商業(yè)可行的應(yīng)用條件下能非常有效地殺死細(xì)菌。測(cè)試檢測(cè)0RF56構(gòu)建物能否增強(qiáng)邊緣商業(yè)上有前途的殺菌活性。事實(shí)上，將多肽缺失和加入結(jié)合結(jié)構(gòu)域組合將該活性提高到對(duì)商業(yè)應(yīng)用有吸引力的水平。連接細(xì)胞壁靶向部分可提高細(xì)胞壁降解活性部位的局部底物濃度，刪除天然TAME的序列有可能刪除了噬菌體在細(xì)胞中復(fù)制前限制其殺菌速度以防殺死宿主菌的某些特征。這些特征普遍存在，因此，噬菌體可作為收集和篩選這些用途的所需特性的起點(diǎn)。
[0134]E.篩選
[0135]可設(shè)計(jì)篩選方法.評(píng)價(jià)突變體或新的候選功能區(qū)段?？珊Y選純化的噬菌體顆粒制品在噬菌體結(jié)構(gòu)中是否存在這種基因產(chǎn)物。結(jié)合檢測(cè)可采用細(xì)菌粗制培養(yǎng)物、分離的細(xì)菌細(xì)胞壁組分、肽聚糖制品、合成的底物或純化的試劑來檢測(cè)親和力和靶細(xì)菌上的靶標(biāo)結(jié)合數(shù)?？稍O(shè)計(jì)穿透或胞壁降解試驗(yàn)以評(píng)價(jià)的是靶菌株細(xì)胞壁的完整性，菌苔抑制試驗(yàn)、培養(yǎng)物活力檢測(cè)、對(duì)細(xì)胞壁制品或其它底物(如結(jié)合基序所述的)的活性、或催化作用細(xì)胞壁組分(如糖、氨基酸、聚合物)的釋放。通過可溶性N-乙酰已糖胺的釋放檢測(cè)酰胺酶活性(例如修飾的Morgan-Elson反應(yīng))，或用DNFB試驗(yàn)檢測(cè)游離氨基來檢測(cè)內(nèi)肽酶活性(丙-甘內(nèi)肽酶檢測(cè)L-丙氨酸，甘-甘內(nèi)肽酶檢測(cè)L-甘氨酸)，所有這三種試驗(yàn)參見Petit等，(1966)“用鏈球菌G的特異性內(nèi)肽酶研究細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中的肽交聯(lián)(Peptide cross-links inbacterial cell wall peptidoglycans studied with specific endopeptidases fromStreptomyces albus G) ,?Biochemistry5:2764-76;PMID: 59685820 甘-甘內(nèi)妝酶活性也可用N-乙酰已糖甘氨酸(乙?；?Gly6)釋放的游離氨基檢測(cè)。參見Kline等，(1994) “用已糖甘氨酸底物檢測(cè)溶葡萄球菌素的比色微量滴定板試驗(yàn)(A colorimetric microtiterplate assay for lysostaphin using a hexaglycine substrate)，，Anal.Biochem.217:329-331;PMID:8203764。[0136]可檢測(cè)接頭的性質(zhì)來比較特定接頭對(duì)結(jié)合或催化的作用，或比較片段的不同取向?？珊Y選多組靶標(biāo)中作用于較廣或較窄靶細(xì)菌譜的催化性片段，可包括可能具有相同細(xì)胞壁組分的其它細(xì)菌，如分枝桿菌或孢子菌。這可應(yīng)用于有關(guān)葡萄球菌的更廣泛組，例如包括:肉葡萄球菌、表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌和緩慢葡萄球菌分離物。可設(shè)計(jì)諸方案來篩選更多候選多肽或變體。
[0137]測(cè)試細(xì)胞壁降解活性的一種方法是用溫和的洗滌劑或變性劑處理噬菌體，使之釋放結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步檢測(cè)這些蛋白質(zhì)對(duì)宿主菌的胞壁降解或“溶解”活性。另一種方法是檢查對(duì)噬菌體耐受宿主菌的從外部(from without)細(xì)胞壁降解或“溶解”活性(LO)。第三種評(píng)估噬菌體結(jié)構(gòu)組分相關(guān)的胞壁降解或“溶解”活性的方法是進(jìn)行Zymogram試驗(yàn)，例如，在加入了高壓滅菌的宿主菌細(xì)胞的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳純化的噬菌體制品。原位復(fù)性凝膠上的蛋白條帶，然后使其作用于細(xì)胞壁組分從而產(chǎn)生清晰的“溶解”區(qū)帶，而其余的凝膠被亞甲基蘭染成蘭色。參見例如L印euple等，(1998) “用復(fù)性聚丙烯酰電泳分析自溶性乳酸乳球菌屬AM2菌株的細(xì)菌溶解酶:前噬菌體-編碼酶的鑒定(Analysisof the bacteriolytic enzymes of the autolytic lactococcus lactis subsp.cremorisstrain AM2 by renaturing polyacrylamide gel electrophoresis:1dentification ofa prophage-encoded enzyme) ,?Appl.Environ.Microbiol.64:4142-428, PMID: 97972580 觀察此清晰區(qū)帶，洗脫區(qū)帶中的蛋白條帶，例如通過N-末端測(cè)序或質(zhì)譜確定其身份。然后分離編碼此蛋白的0RF。
[0138]VII1.分離編碼細(xì)胞壁降解性或結(jié)合多肽的核酸
[0139]已鑒定到編碼上述細(xì)胞壁“溶解”或結(jié)合蛋白，如葡萄球菌噬菌體K、Twort、Gl或Phill的核酸，及其保守性修飾變體。它們編碼的細(xì)胞壁“溶解”蛋白具有細(xì)胞壁降解活性，編碼鑒定的CHAP結(jié)構(gòu)域的那些基礎(chǔ)候選對(duì)象，特別是CHAP結(jié)構(gòu)域是C (末端)附近的那些。其它來源包括噬菌體的尾- 樣結(jié)構(gòu)(如膿菌素或缺陷型噬菌體-樣顆粒)，或具有特征性“溶解”活性元件的基因組序列，如顯示具有這些結(jié)構(gòu)的特征性基因組成的(參見例如 Rybchin (1984) “細(xì)菌卩遼菌體 phi80 的遺傳學(xué)一綜述(Genetics of bacteriophage phi80—a review) ” Gene27:3-11; PMID:6232171)。
[0140]編碼細(xì)胞壁“溶解”多肽的核酸例子也與本發(fā)明核酸實(shí)施方式相關(guān)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道獲得這種核酸的方法。可用體外方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)、或自身連續(xù)的序列復(fù)制系統(tǒng)(the self-sustained sequencereplication system, SSR)克隆或擴(kuò)增合適的核酸(如cDNA、基因組序列或亞序列(探針))。除了合成方法外，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知各種克隆和體外擴(kuò)增方法。這些技術(shù)及其說明的例子足以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行許多克隆試驗(yàn)，可參見Berger和Kimmel, “Guideto Molecular Cloning Techniques (分子克隆技術(shù)指南)”，刊于 Methods inEnzymology (酶學(xué)方法)152學(xué)術(shù)出版社公司，圣迭戈,加利福尼亞州(Berger) ; Sambrook等.(1989) “Molecular Cloning-A Laboratory Manual (分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))”(第2版)1-3卷，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港出版社，紐約；Sambrook等；“最新分子生物學(xué)方法”;Ausubel等編，格林出版合伙公司和約翰威利父子公司合資企業(yè)(1999增刊)(Ausubel) ;Cashion 等,美國(guó)專利號(hào) 5, 017, 478 和 Carr,歐洲專利號(hào).0, 246, 864。
[0141]可采用上述適當(dāng)方法制備編碼細(xì)胞壁降解多肽的DNA，包括例如用限制性酶克隆和切割相應(yīng)序列。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，用常規(guī)克隆方法分離得到編碼細(xì)胞壁降解多肽的核酸?？衫玫卿浱?hào)YP_024486提供的細(xì)胞壁降解多肽的核苷酸序列來制備能與總RNA樣品中編碼該多肽的基因，或編碼細(xì)胞壁降解蛋白的mRNA特異性雜交的探針(如在Southern或Northern印跡中)。一旦鑒定到編碼細(xì)胞壁“溶解”蛋白的靶核酸，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法分離(參見例如SambiOOk等.(1989) “分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(第2版)1-3卷，冷泉港實(shí)驗(yàn)室；Berger和Kimmel (1987) “分子克隆技術(shù)指南”刊載于“酶學(xué)方法”152卷；圣迭戈:學(xué)術(shù)出版社公司或Ausubel等(1987) “現(xiàn)代分子生物學(xué)方法”格林出版和威利交叉科學(xué)公司(Greene Publishing and ffiley-1nterscience),紐約)。此外，可用限制性酶切割分離的核酸以產(chǎn)生編碼全長(zhǎng)細(xì)胞壁降解多肽的核酸或其亞序列，如含有編碼至少細(xì)胞壁降解多肽的催化結(jié)構(gòu)域亞序列的亞序列。然后可將這些編碼細(xì)胞壁降解多肽的限制性酶切片段或其亞序列連接在一起以產(chǎn)生編碼細(xì)胞壁降解多肽的核酸。
[0142]可用類似方法產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞壁結(jié)合片段或片段之間的接頭?？设b定到對(duì)靶細(xì)菌上優(yōu)勢(shì)表面特征性有親和力的結(jié)合區(qū)段，包括例如:噬菌體K的0RF56、模仿葡萄球菌的溶葡萄球菌素、L54a酰胺酶、噬菌體phill的酰胺酶、金黃色葡萄球菌的溶葡萄球菌素同源物ALE-1 (見G1: 3287732)、金黃色葡萄球菌NCTC8325自溶素中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌SH3結(jié)構(gòu)域區(qū)段(見YP_500516)、金黃色葡萄球菌的JH9N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶家族2 (見ΖΡ_01242312、金黃色葡萄球菌的Mu50酰胺酶(見NP_371437)、金黃色葡萄球菌RF122噬菌體-相關(guān)的酰胺酶(見YP_417165)、金黃色葡萄球菌肽聚糖水解酶(見ΑΑΑ26662)、金黃色葡萄球菌溶血JCSC1435N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰酶(見ΥΡ_254248)、模仿葡萄球菌的蛋白產(chǎn)物CAA29494、細(xì)菌肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRP或PGLYRP，從昆蟲到哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的能結(jié)合革蘭陽(yáng)性菌或革蘭陰性菌肽聚糖(PGN)的高度保守性蛋白大家族)，或其它相關(guān)序列，如因基因盒中的序列或位置而具有同源性的序列。已表征了各種細(xì)菌的細(xì)胞壁，在例如PubMed中常報(bào)導(dǎo)與其結(jié)合的蛋白質(zhì)。此種結(jié)合性蛋白質(zhì)常具有Sarc同源性3結(jié)構(gòu)域(SH3)真核細(xì)胞的對(duì)應(yīng)物?？刹捎瞄L(zhǎng)度和性能適當(dāng)?shù)慕宇^區(qū)段連接結(jié)合與催化結(jié)構(gòu)域。參見例如Bae等，(2005) “隱藏Markov模型中蛋白相互作用區(qū)域接頭的預(yù)測(cè)(Predictionof protein interdomain linker regions by a hidden Markov model)，T3ioinformatics21:2264-2270;以及Geor.ge和Heringa(2003)“蛋白結(jié)構(gòu)域接頭的分析:它們的類型和在蛋白折疊中的作用(An analysis of protein domain linkers:their classification androle in protein folding)，，Protein Engineering 15:871-879。
[0143]通過測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物可表征編碼相應(yīng)多肽的核酸或其亞序列。可采用根據(jù)表達(dá)多肽的物理、化學(xué)或免疫學(xué)性質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果的試驗(yàn)。例如，可根據(jù)核酸編碼的多肽降解或消化細(xì)菌細(xì)胞的能力來鑒定細(xì)胞壁降解多肽，如本文所述。
[0144]也可化學(xué)合成編碼所需多肽的核酸或其亞序列。合適的方法包括Narang等(1979)Meth.Enzymol.68:90-99 所述的憐酸三酯法；Brown 等(1979)Meth.Enzymol.68:109-151 所述的憐酸二酯法；Beaucage,等(1981)Tetra.Lett.22:1859-1862二乙基磷酸亞胺法，和美國(guó)專利號(hào)4，458，066所述的固相支持物法?；瘜W(xué)合成產(chǎn)生的是單鏈寡核苷酸?？赏ㄟ^與互補(bǔ)序列雜交，或用此單鏈作為模板通過DNA聚合酶使之聚合而轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈。技術(shù)人員知道雖然化學(xué)合成DNA常限于約100個(gè)堿基的序列，但可將較短序列連接獲得較長(zhǎng)的序列。[0145]可用DNA擴(kuò)增方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆編碼所需多肽的核酸或其亞序列。因此，例如，用含有一個(gè)限制性酶位點(diǎn)(如NdeI)的有義引物，和含另一個(gè)限制性酶位點(diǎn)(如HindIII)的反義引物，以PCR擴(kuò)增此核酸或亞序列。這將產(chǎn)生編碼所需多肽或亞序列并含有末端限制性酶位點(diǎn)的核酸。然后不難將這種核酸連接入含有編碼第二種分子并具有合適的相應(yīng)性酶切位點(diǎn)的核酸的載體中。合適的PCR引物可由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用GenBank提供的或從其它來源獲得的序列信息來確定。也可通過定點(diǎn)誘變將相應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)加入到編碼細(xì)胞壁降解多肽或其多肽亞序列的核酸中。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割含細(xì)胞壁降解多肽編碼核苷酸序列或亞序列的質(zhì)粒，然后連接入適當(dāng)?shù)妮d體中進(jìn)行擴(kuò)增和/或表達(dá)。足以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行體外擴(kuò)增方法的技術(shù)例子參見Berger、Sambrook和Ausubel,以及Mullis等，(1987)美國(guó)專利號(hào)4，683，202;PCR方案:方法與應(yīng)用指南(Innis等編)學(xué)術(shù)出版社公司，圣迭戈，加利福尼亞州(1990)(Innis);Arnheim 和 Levinson(Octoberl, 1990)C&EN36-47;TheJournal Of NIH Research(1991)3:81-94; (Kwoh 等(1989)Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA86:1173;Guatelli 等(1990)Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA 87:1874;Lomell 等(1989)J.Cl in.Chem.35:1826;Landegren 等(1988) Science241:1077-1080;Van Brunt(1990)Biotechnology8:291-294;Wu 和 Wallace (1989)Gene 4:560;以及 Barringe 等?(1990)Gene 89:117。
[0146]可根據(jù)所鑒定的多肽序列用PCR引物擴(kuò)增編碼細(xì)胞壁降解多肽的某些核酸。
[0147]可將例如特定核酸表達(dá)的重組細(xì)胞壁降解多肽的其它物理性能與已知所需多肽的特性作比較，以提供鑒定合適的序列或結(jié)構(gòu)域，如作為細(xì)菌特異性、結(jié)合特異性和/或催化活性決定因素的細(xì)胞壁降解蛋白的另一種方法?；蛘撸赏蛔兺茰y(cè)的細(xì)胞壁降解多肽編碼核酸或重組細(xì)胞壁“溶解”多肽的基因，檢測(cè)未突變的、天然或?qū)φ占?xì)胞壁降解多肽的正常增強(qiáng)的細(xì)菌“溶解”變異來確定其作為細(xì)胞壁降解多肽的作用，或特定序列或結(jié)構(gòu)域的作用。技術(shù)人員知道可用分子生物學(xué)技術(shù)(如PCR)操作編碼多肽的核酸以促進(jìn)本發(fā)明細(xì)胞壁降解多肽的突變或修飾。誘變或基因改組技術(shù)可應(yīng)用于本文所述的功能片段，包括與嵌合構(gòu)建物相容的細(xì)胞壁降解.活性、胞壁結(jié)合特性或接頭特性。
[0148]可用標(biāo)準(zhǔn)方法來突變或修飾多肽并如本文所述檢測(cè)它們的活性，例如受體底物活性和/或催化活性，來鑒定新鑒定的細(xì)胞壁降解多肽的功能結(jié)構(gòu)域。可利用不同細(xì)胞壁降解蛋白的功能結(jié)構(gòu)域序列來構(gòu)建編碼或組合一種或多種細(xì)胞壁降解多肽的功能結(jié)構(gòu)域的核酸。然后可檢測(cè)這些多活性融合多肽的殺菌或抑菌活性。可以根據(jù)與鑒定的“溶解”活性的同源性鑒定相關(guān)序列，并篩選對(duì)相應(yīng)底物的活性。在噬菌體結(jié)構(gòu)上發(fā)現(xiàn)的用于附著和穿透靶細(xì)菌壁結(jié)構(gòu)，例如盒結(jié)構(gòu)的多肽的特征性噬菌體基因結(jié)構(gòu)可能鑒定到具有用于從外部攻擊細(xì)胞壁的結(jié)合和/或殺菌或抑菌活性的新序列。具體例子包括前噬菌體序列，包括功能性噬菌體基因組的不完全遺留物，或膿菌素樣結(jié)構(gòu)，包括衍生自噬菌體-樣基因區(qū)段的序列，如細(xì)菌DNA中保留的噬菌體缺失或突變基因遺留物。
[0149]在克隆細(xì)胞壁降解多肽編碼核酸的示范性方法中，比對(duì)所克隆多肽的已知核酸或氨基酸序列以測(cè)定它們之間序列相同性的程度。利用這種信息鑒定和選擇能賦予或調(diào)節(jié)細(xì)胞壁降解多肽活性，如細(xì)菌靶向或結(jié)合特異性，和/或基于感興趣多肽之間序列相同性程度的降解或“溶解”活性的結(jié)構(gòu)域。例如，可利用在感興趣細(xì)胞壁降解多肽之間具有序列相同性的結(jié)構(gòu)域，和與已知活性相關(guān)的結(jié)構(gòu)域來構(gòu)建包含此結(jié)構(gòu)域與其它結(jié)構(gòu)域并具有該結(jié)構(gòu)域相關(guān)活性(如細(xì)菌或結(jié)合特異性和/或細(xì)胞壁降解活性)的多肽?？捎妙愃频牟呗詠矸蛛x能結(jié)合細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的細(xì)菌SH3結(jié)構(gòu)域、肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRP)、噬菌體尾“溶解”多肽、或隔開這些結(jié)構(gòu)域的相連接頭。
[0150]IX.在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需多肽
[0151]本發(fā)明的細(xì)胞壁降解蛋白或其它蛋白可在不同的宿主細(xì)胞中表達(dá)，包括大腸桿菌、其它細(xì)菌宿主和酵母菌。宿主細(xì)胞優(yōu)選微生物，例如，酵母菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或絲狀真菌細(xì)胞。合適宿主細(xì)胞的例子包括，例如，固氮菌屬(Azotobacter sp.)(如棕色固氮菌(A.vinelandii));假單胞菌屬(Pseudomonas sp)、根瘤菌(Rhizobium sp.);歐文菌屬(Erwinia sp);大腸桿菌屬(如大腸桿菌)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas);變形菌(Proteus);沙門菌(Salmonella);沙雷菌(Serratia):志賀桿菌(Shigella)、根瘤菌屬(Rhizobia);透明顫菌屬(Vitreoscilla);副球菌(Paracoccus)和克雷伯菌屬(Klebsiella sp)和其它許多細(xì)菌。所述細(xì)菌細(xì)胞可以是幾種菌屬之一，包括酵母菌(Saccharomyces)(如釀酒酵母菌(S.cerevisiae))、假絲酵母菌(Candida)(如產(chǎn)朊假絲酵母菌(C.utilis)、近平滑假絲酵母菌(C.parapsilosis)、克魯斯假絲酵母菌(C.krusei)、生香假絲酵母菌(C.versatilis)、解脂假絲酵母菌(C.1ipolytica)、涎沫假絲酵母菌(C.zeylanoides)、季也蒙假絲酵母菌(C.guilliermondii)、白色念珠菌(C.albicans)和土生假絲酵母菌(C.humicola);畢赤酵母(Pichia)(如粉狀畢赤酵母(P.farinosa)和奧默畢赤酵母菌(P.0hmeri));球擬酵母屬(Torulopsis)(如白球擬酵母菌(T.Candida)、圓球擬酵母菌(T.sphaerica)、膠膜醋酸球擬酵母菌(T.xylinus)、麥角固醇球擬酵母菌(T.famata)和易變球擬酵母菌(T.versatilis));德巴利酵母屬(Debaryomyces)(如類球形德巴利酵母(D.subglobosus)、D.cantarelli1、球形德巴利酵母(D.globosus)、漢遜德巴利酵母(D hanseni)和D.japonicus);接合酵母菌屬(Zygosaccharomyces)(如魯氏接合酵母菌(Z.rouxii)和子囊酵母菌(Z.bailii))；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)(如馬克斯克魯維酵母(K.marxianus));漢遜酵母屬(Hansenula)(如異常漢遜酵母(H.anomala)和杰丁漢遜酵母(H.jadinii))以及酒香酵母菌(Brettanomyces)(如郎比可酒香酵母(B.1ambicus)和異酒香酵母菌(B.anomalus))。有用的細(xì)胞例子包括但不限于:大腸桿菌、腸桿菌(EnteiObacter)、固氮菌、歐文菌、克魯伯酵母菌、芽胞桿菌、假單胞菌、變形桿菌和沙門菌。
[0152]細(xì)胞壁降解多肽一旦在宿主細(xì)胞中表達(dá)，可用其防止相應(yīng)細(xì)菌的生長(zhǎng)。在一優(yōu)選區(qū)實(shí)施方式中，利用0RF56多肽降低金黃色葡萄球菌或其它相似葡萄球菌生長(zhǎng)。可產(chǎn)生組合這些片段的融合構(gòu)建物，包括含多種細(xì)胞壁降解活性酶，包括肽酶和酰胺酶催化活性(它們能切斷gly-gly和gly-ala連接鍵)，或組合了活性(片段)與結(jié)合細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的革巴向區(qū)段的融合蛋白。降解活性的組合能協(xié)同作用而更好地發(fā)揮抑菌或殺菌功能?？杉尤虢宇^以在結(jié)合靶部位附近提供大體積的高局部濃度催化位點(diǎn)。
[0153]通常，將編碼細(xì)胞壁降解多肽的多核苷酸放在在所需宿主細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子控制下。根據(jù)具體用途，在 本發(fā)明的表達(dá)載體中可采用各種熟知的示范性啟動(dòng)子。通常，根據(jù)啟動(dòng)子在所述細(xì)胞中有活性來選擇啟動(dòng)子。任選也可包含其它表達(dá)控制序列，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)等等。包含一種或多種這些調(diào)控序列的構(gòu)建物稱為“表達(dá)盒”。因此，本發(fā)明提供的表達(dá)盒中摻入了編碼例如組合了催化片段與結(jié)合片段的融合蛋白的核酸從而在所需宿主細(xì)胞中聞水平表達(dá)。
[0154]通過克隆在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因?？色@得適合用于特定宿主細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控序列。本文定義的常規(guī)使用的原核調(diào)控序列包括啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，任選含有操縱子及核糖體結(jié)合位點(diǎn)，包括以下常規(guī)使用的啟動(dòng)子，如￠-內(nèi)乳酶(青霉素酶)和乳糖(Iac)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Change等,(1977)Nature 198:1056)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel等
(1980)NucleicAcids Res.8:4057)、tac 啟動(dòng)子(DeBoer 等，(1983)Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA 80:21-25)以及入-驅(qū)動(dòng)的PL啟動(dòng)子和N-基因核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Shimatake等，
(1981)Nature292:128)。具體的啟動(dòng)子系統(tǒng)對(duì)本發(fā)明而言不是關(guān)鍵，可采用在原核細(xì)胞中具有功能的許多可得到的啟動(dòng)子。各種實(shí)施例中采用了細(xì)菌噬菌體17啟動(dòng)子。
[0155]為了在大腸桿菌以外的原核細(xì)胞中表達(dá)細(xì)胞壁降解多肽，要采用在特定原核細(xì)菌生產(chǎn)中具有功能的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可獲自從這些細(xì)菌中已克隆的基因，或可采用異源啟動(dòng)子。例如，雜交trp-lac啟動(dòng)子在除大腸桿菌以外的桿菌中具有功能。
[0156]本發(fā)明的表達(dá)盒中常規(guī)包含核糖體結(jié)合點(diǎn)(RBS)。大腸桿菌中示范性RBS由長(zhǎng)3-9個(gè)核苷酸的核苷酸序列組成，其位于起始密碼子上游3-11個(gè)核苷酸(Shine和Dalgarno (1975)Nature 254:34; Steitz 刊于 Goldberger (1979 編)“生物學(xué)調(diào)節(jié)和發(fā)育:基因表達(dá)(Biological regulation and development:Gene expression)，，(第 I 卷，349頁(yè))普萊納姆出版社，紐約)。
[0157]為在酵母菌中表達(dá)蛋白質(zhì)，便利的啟動(dòng)子應(yīng)包含GALl-1O (Johnson和Davies(1984)Mol.Cell.Biol.4:1440-1448)、ADH2 (Russell 等(1983)J.Biol.Chem.258:2674-2682)、PH05 (EMB0 J.(1982)6:675-680)和 MF a (Herskowitz 和Oshima (1982),見 Strathern 等編:“酵母菌的分子生物學(xué)(The Molecular Biology of theYeast Saccharomyces) ”冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約，第181-209頁(yè))。酵母菌所用的另一種合適啟動(dòng)子是ADH2/GAPD H雜交啟動(dòng)子，見Cousens等，(1987) Gene 61:265-275(1987)中的描述。對(duì)于絲狀真菌，例如黑曲霉真菌菌株(McKnight等的美國(guó)專利號(hào)4，935，349)，有用的啟動(dòng)子例子包括衍生自黑曲霉酵解基因的啟動(dòng)子，如ADH3啟動(dòng)子(McKnight等，(1985)EMBO J.4:2093-2099)和tpiA啟動(dòng)子。合適的終止子的例子是ADH3終止子(McKnight等)。
[0158]組成型或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子均可用于本發(fā)明。優(yōu)選調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，因?yàn)樗拗骷?xì)胞可生長(zhǎng)至高密度然后誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。高水平表達(dá)的異源多肽在某些情況下減慢了細(xì)菌生長(zhǎng)。可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子是在改變培養(yǎng)環(huán)境或發(fā)育因素，如改變溫度、pH、厭氧或需氧條件、光照、轉(zhuǎn)錄因子和化學(xué)物時(shí)能導(dǎo)致基因表達(dá)水平改變的啟動(dòng)子。這類啟動(dòng)子本文稱為“可誘導(dǎo)”啟動(dòng)子，可控制所需多肽表達(dá)的時(shí)間。對(duì)于大腸桿菌和其它細(xì)菌宿主細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子例如包括Iac啟動(dòng)子、細(xì)菌噬菌體X PL啟動(dòng)子、雜交trp-lac 啟動(dòng)子(Amann 等，(1983) Gene25:167; de Boer 等，.(1983) Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA 80:21)以及細(xì)菌噬菌體 17 啟動(dòng)子(Studier 等(1986) J.Mol.Biol.; Tabor 等，(1985)Proc.Nat’ I Acad.Sc1.USA 82:1074-78)。這些啟動(dòng)子及其應(yīng)用的討論參見Sambrook等(同上)。
[0159]包含操作性連接于基因表達(dá)調(diào)控信號(hào)的感興趣多核苷酸的構(gòu)建物稱為“表達(dá)盒”，置于合適的宿主菌細(xì)胞中時(shí)驅(qū)動(dòng)該多核苷酸表達(dá)。常將編碼本發(fā)明融合蛋白的表達(dá)盒置于表達(dá)載體中，將該載體引入宿主細(xì)胞。除表達(dá)盒外，所述載體通常包含能使該載體在一種或多種選擇的宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制的核酸序列。這種序列通常是能使載體獨(dú)立于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，包含復(fù)制或自發(fā)復(fù)制序列的起點(diǎn)。許多細(xì)菌的這種序列是熟知的。例如，質(zhì)粒PBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭陰性菌。或者，此種載體可整合入宿主細(xì)胞基因組成分中隨細(xì)胞DNA的復(fù)制而復(fù)制。
[0160]構(gòu)建多核苷酸構(gòu)建物通常要求采用能在細(xì)菌中復(fù)制的載體?？少?gòu)得商品化的純化細(xì)菌質(zhì)粒的各種試劑盒(參見例如法瑪西亞生物技術(shù)公司(Pharmacia Biotech)的EasyPrepJ、FlexiPrepJ ;斯特拉特基因公司(Stratagene)的 StrataCleanJ ;和恰根公司的QIAexpress表達(dá)系統(tǒng)(Qiagen))。然后可進(jìn)一步操作分離和純化的質(zhì)粒產(chǎn)生其它質(zhì)粒,并用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。也可在鏈球菌或桿菌中克隆。
[0161]常將可選擇性標(biāo)記摻入用于表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體中。這些基因能編碼基因產(chǎn)物，例如轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中存活或生長(zhǎng)所必須的多肽。未被含有此選擇基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在此種培養(yǎng)基中不能存活。典型的選擇基因編碼能賦予抗生素或其它毒素，如氨節(jié)青霉素、新霉素、卡拉霉素、氯霉素或四環(huán)素耐藥性的多肽?；蛘撸蛇x擇標(biāo)記編碼補(bǔ)充自身的營(yíng)養(yǎng)缺陷型或提供不能從復(fù)合培養(yǎng)基中獲得的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分的蛋白質(zhì)，如桿菌的編碼D-丙氨酸內(nèi)旋酶的基因。通常，所述載休包含在，例如大腸桿菌或其它細(xì)胞中具有功能的一種選擇標(biāo)記，先復(fù)制該載體再將其引入宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道許多可選擇標(biāo)記，其描述可見SambiOok等(同上)。
[0162]構(gòu)建包含一種或多種上述組分的合適載體可采用以上引用參考文獻(xiàn)中描述的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。將分離的質(zhì)?；駾NA片段切割、定制(tailor)并重新連接成所需形式以產(chǎn)生所要的質(zhì)粒。為驗(yàn)證構(gòu)建的質(zhì)粒中的序列正確，可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如限制性內(nèi)切酶消化和/或用已知方法測(cè)序來分析該質(zhì)粒。本領(lǐng)域知道可用分子克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)這些目的。技術(shù)人員熟知適合于構(gòu)建重組核酸的各種克隆和體外擴(kuò)增方法。足以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行許多克隆實(shí)驗(yàn)的這些技術(shù)和說明的例子可參見Berger和Kimmel，“分子克隆技術(shù)指南”，刊于“酶學(xué)方法”152學(xué)術(shù)出版社公司，圣迭戈，加利福尼亞州(Berger);和“最新分子生物學(xué)方法”；Ausubel等編，格林出版合伙.公司和約翰威利父子公司合資企業(yè)(1999增刊)(Ausubel)。
[0163]本領(lǐng)域熟知適合用作構(gòu)建本發(fā)明表達(dá)載體的起始材料的各種常用載體。對(duì)于在細(xì)菌中克隆，常用載體包括PBR322衍生的載體，如pBLUESCRIPT?和λ -噬菌體衍生載體。在酵母菌中，載體包括酵母菌整合質(zhì)粒(如ΥΙρ5)和酵母菌復(fù)制質(zhì)粒(YRp系列質(zhì)粒)以及pGPD-2?？刹捎酶鞣N正常可購(gòu)得的質(zhì)粒，包括pSV2、pBC12BI和p91023以及裂解病毒載體(如牛痘病毒、腺病毒和桿狀病毒)、游離型病毒載體(如牛乳頭瘤病毒)和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(如小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒)實(shí)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。
[0164]將表達(dá)載體引入所選宿主細(xì)胞的方法通常是標(biāo)準(zhǔn)方法，如本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法。例如，通過氯化鈣轉(zhuǎn)化將表達(dá)載體引入原核細(xì)胞，包括大腸桿菌中，通過磷酸鈣處理或電穿孔轉(zhuǎn)化入真核細(xì)胞中。其它轉(zhuǎn)化方法也適合。
[0165]可利用翻譯偶連增強(qiáng)表達(dá)。該方案利用衍生自翻譯系統(tǒng)的天然高表達(dá)基因的上游短開放讀框，其安置在啟動(dòng)子下游，隨后是核糖體結(jié)合位點(diǎn)、幾個(gè)氨基酸密碼子后是終止子。在終止密碼子之前是第二核糖體結(jié)合位點(diǎn)，終止密碼子后是啟動(dòng)翻譯的起始密碼子。此系統(tǒng)解決了 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)問題，得以有效啟動(dòng)翻譯。見Squires等，(1988) J.Biol.Chem.263:16297-16302。
[0166]本發(fā)明的各種多肽可在胞內(nèi)表達(dá)，或從細(xì)胞分泌。胞內(nèi)表達(dá)常導(dǎo)致高產(chǎn)率。如果需要，通過進(jìn)行折疊過程可提高可溶的活性融合多肽的表達(dá)量。(參見例如，Sambrook等，同上，Marston 等,(1984)Bio/Technology 2:800 ;Schoner 等，(1985)Bio/Technology3:151)。在所需的多肽才細(xì)胞中分泌到周質(zhì)或分泌到胞外介質(zhì)中的實(shí)施方式中，所述DNA序列常連接于可切割的信號(hào)肽序列。此信號(hào)序列指引融合多肽經(jīng)細(xì)胞膜易位。用于大腸桿菌中含有啟動(dòng)子信號(hào)序列單元的合適載體的例子是PTA1529，其具有大腸桿菌的phoA啟動(dòng)子和信號(hào)序列(參見例如Sambrook等，同上；Oka等,(1985)Proc.Nat’ I Acad.Sc1.USA82:7212;Talmadge 等，(1980)Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA 77:3988;Takahara 等，(1985)J.Biol.Chem.260:2670)。在另一實(shí)施方式中，使此整合多肽融合于A蛋白或牛血清白蛋白(BSA)的亞序列，例如可促進(jìn)其純化、分泌或穩(wěn)定性。親和方法，例如利用結(jié)合片段的靶標(biāo)可能適合。
[0167]也可將本發(fā)明的細(xì)胞壁降解多肽進(jìn)一步連接于其它細(xì)菌多肽區(qū)段，如靶向片段。此法常導(dǎo)致高產(chǎn)率，因?yàn)檎５脑苏{(diào)控序列指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和翻譯。在大腸桿菌中，常利用IacZ融合體表達(dá)異源蛋白質(zhì)。合適的載體不難得到，例如PUR、pEX、和pMRlOO系列(參見例如Samtoook等，同上)。對(duì)于某些應(yīng)用，純化后可能需要切割融合多肽的外部序列。這可用本領(lǐng)域已知的幾種方法實(shí)施,包括用溴化氫、蛋白酶、或因子Xa切割(見例如Sambrook等，同上；Itakura 等,(1977) Science 198:1056; Goeddel 等，(1979) Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA 76:106; Nagai 等，(1984) Nature 309:810; Sung 等，(1986) Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA83:561)?？山?jīng)工程改造將切割位點(diǎn)加入融合多肽基因的所需切割位點(diǎn)。
[0168]通過在一個(gè)表達(dá)載體中安置多個(gè)轉(zhuǎn)錄盒，或在克隆策略中對(duì)各表達(dá)載體采用不同的選擇標(biāo)記可在一個(gè)宿主細(xì)胞中表達(dá)一種以上重組多肽。
[0169]從大腸桿菌獲得保持其N-末端完整性的重組蛋白的合適系統(tǒng)描述于Miller等，(1989)Biotechnology 7 :698-704。此系統(tǒng)中，感興趣基因產(chǎn)生為C-末端融合于含有肽酶切割位點(diǎn)的酵母菌遍在蛋白基因的前76殘基。在此二部分的連接處切割產(chǎn)生具有完整的真實(shí)N-末端殘基的蛋白質(zhì)。
[0170]X.純化所需多肽
[0171]本發(fā)明的多肽可表達(dá)為胞內(nèi)蛋白，或從細(xì)胞分泌的蛋白，在本發(fā)明方法中可采用此形式。例如，可在本發(fā)明方法中使用含有表達(dá)的胞內(nèi)多肽或分泌多肽的細(xì)胞粗提物。
[0172]或者，可按照本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法純化此多肽，包括:硫酸銨沉淀、親和層析、柱層析、凝膠電泳等。(可參見Scopes (1982) “蛋白質(zhì)純化(Protein Purification) ” S-V公司，紐約;Deutscher (1990)酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)(第 182 卷)“蛋白純化指南(Guide to Protein Purification) ”學(xué)術(shù)出版社公司，紐約)。因?yàn)橹辽傺苌在噙|菌體蛋白的降解片段因穩(wěn)定而選擇，純化可利用此特性使污染物變性?；炯兊慕M合物優(yōu)選至少有約92、95、98至99%或更高的均一性?？蓪⒋思兓亩嚯挠米髅庖咴瓉懋a(chǎn)生抗體，在免疫選擇性純化方法中可使用此抗體。
[0173]為促進(jìn)本發(fā)明多肽的純化，編碼它們的核酸也可包含有親和結(jié)合試劑可用的表位或“標(biāo)簽”，例如純化標(biāo)簽的編碼序列。合適表位的例子包括myc和V-5報(bào)道基因；可商品化購(gòu)得的用于重組產(chǎn)生含有這些表位的融合多肽的表達(dá)載體(如加利福尼亞州卡爾斯巴德市英杰公司(Invitrogen Carlsbad CA)的載體 pcDNA3.1/Myc-His 和 pcDNA3.1/V5-His適合在哺乳動(dòng)物中表達(dá))。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道適合連接標(biāo)簽與本發(fā)明多肽的其它表達(dá)載體，以及相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)，幾種可商品化購(gòu)得(如FLAG，新澤西州羅切斯特市柯達(dá)公司(Kodak, Rochester NY))。合適標(biāo)簽的另一個(gè)例子是聚組氨酸序列，它能夠結(jié)合金屬螯合親和配體。通常采用六個(gè)毗連的組氨酸，雖然可采用少于或多于六個(gè)?？捎米骶劢M氨酸標(biāo)簽的結(jié)合部分的合適金屬螯合親和配體包含腈基-三-乙酸(NTA) (Hochuli “用金屬螯合吸附劑純化重組蛋白(Purification of recombinant proteins with metalchelating adsorbents) ”，刊于 Setlow 編(1990) “基因工程:原理和方法(GeneticEngineering:Principles an dMethods,)普萊納姆出版社，紐約；可商品化購(gòu)自加利福尼亞州圣塔克拉里塔市的恰根公司(Santa Clarita，CA))。純化標(biāo)簽也包含甘露糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。純化甘露糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。
[0174]本領(lǐng)域技術(shù)人員知道適合用作標(biāo)簽的其它半抗原，例如，可見“熒光探針和化學(xué)物研究手冊(cè)(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)，，(第 6 版)分子探針公司(Molecular Probes, Inc.)，尤金，俄勒岡州)。例如二硝基苯酚(DNP)、地高辛、巴比妥鈉(參見例如美國(guó)專利號(hào)5，414，085)，幾種類型的熒光團(tuán)可用作半抗原，如這些化合物的衍生物。已有將半抗原和其它部分連接于蛋白質(zhì)和其它分子的商品化試劑盒。例如，如果所述半抗原包括硫醇，可利用異質(zhì)雙功能接頭如SMCC將所述標(biāo)簽連接于捕獲試劑上的賴氨酸殘基。
[0175]技術(shù)人員明白，可對(duì)所述多肽的催化或功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行某種修飾而不破壞它們的生物學(xué)活性。作出某些修飾有利于將催化結(jié)構(gòu)域克隆、表達(dá)或摻入融合多肽中。這種修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括例如在編碼催化結(jié)構(gòu)域的多核苷酸二末端之一加入密碼子，如在氨基末端加入甲硫氨 酸以提供起始位點(diǎn)，或?qū)㈩~外的氨基酸(如聚組氨酸)置于二末端之一從而產(chǎn)生方便定位的限制性酶位點(diǎn)或終止密碼子或純化序列。
[0176]必須注意，在本文和隨附的權(quán)利要求書中，單數(shù)形式”一種”和“該”包括其復(fù)數(shù)形式，除非另有明確說明。因此，例如，述及“一種細(xì)菌噬菌體”包括多個(gè)這種細(xì)菌噬菌體；述及“一種宿主細(xì)菌”包括一個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)菌及本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的等價(jià)詞，等等。
[0177]提供本文討論的出版物只是因?yàn)樗鼈兊陌l(fā)表在本文之前。本文并不承認(rèn)本發(fā)明因在先發(fā)明而不具資格在這些出版物之前。另外，提供的出版日期可能與真實(shí)出版日期不同，這需要獨(dú)立核實(shí)。引用的文獻(xiàn)全文納入本文作為參考。
[0178]如同每份出版物或?qū)＠暾?qǐng)專門而單獨(dú)地納入用作參考一樣，本說明書引用的所有出版物和專利申請(qǐng)納入本文作參考。
[0179]雖然出于清楚理解的目的上文已借助說明和實(shí)例描述了本發(fā)明的某些細(xì)節(jié)，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難明白借鑒本發(fā)明的教導(dǎo)可作出某些改變和改進(jìn)，而不脫離隨附權(quán)利要求書的思路和范圍。
實(shí)施例
[0180]1.全長(zhǎng) 0RF56
[0181]登錄號(hào)YP_024486報(bào)道了在葡萄球菌噬菌體K中發(fā)現(xiàn)的推定0RF56。根據(jù)此報(bào)告，可從合適的噬菌體來源用PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)的噬菌體K 0RF56。采用的基因特異性引物是:正向引物含NdeI位點(diǎn)，反向引物含XhoI位點(diǎn)，將該P(yáng)CR產(chǎn)物作為Nde1-XhoI插入物克隆到pET21a載體中處于17啟動(dòng)子控制下。此克隆標(biāo)記為PGMB617，含有對(duì)應(yīng)于預(yù)計(jì)產(chǎn)物1-808位氨基酸的編碼區(qū)序列(SEQ ID勵(lì):1)，應(yīng)產(chǎn)生約911的蛋白質(zhì)。
[0182]A.CHAP 結(jié)構(gòu)域
[0183]描述登錄號(hào)YP_024486的報(bào)道鑒定了描述為半胱氨酸-組氨酸依賴性氨基水解酶/肽酶結(jié)構(gòu)域(CHAP)的結(jié)構(gòu)域。參見例如Rigden等?(2003) Trends Biochem.Sc1.28:230-234。知道某些基因包含溶解活性CHAP結(jié)構(gòu)域，和位于此編碼多肽N附近區(qū)域的結(jié)構(gòu)域。CHAP結(jié)構(gòu)域位于推定0RF56的C附近區(qū)域，應(yīng)對(duì)應(yīng)于指定的氨基酸690-805。
[0184]B.降解產(chǎn)物
[0185]然而，產(chǎn)生和純化后，經(jīng)PAGE觀察存在實(shí)質(zhì)量的約50kDa和約為23kDa的蛋白產(chǎn)物。這些蛋白看來代表了最初表達(dá)的91kDa蛋白的穩(wěn)定降解產(chǎn)物。
[0186]I1.葡萄球菌靶細(xì)菌
[0187]首先測(cè)試純化的蛋白構(gòu)建物對(duì)金黃色葡萄球菌分離株的CFU(菌落形成單位)的降低情況。再測(cè)試某些構(gòu)建物對(duì)表皮葡萄球菌、緩慢葡萄球菌、肉葡萄球菌分離株的CFU的降低情況?？磥砼c許多噬菌體的感染選擇性相比，所觀察到的溶解活性的菌株特異性較差。因此，有可能本文所述的溶解活性也具有多種菌株特異性，甚至更寬跨越許多菌屬或?qū)ζ渌δ芎徒Y(jié)構(gòu)類型的細(xì)菌，如所有革蘭陽(yáng)性菌，甚至包括某些或所有革蘭陰性菌。此外，此溶解活性對(duì)于革蘭陽(yáng)性與革蘭陰性菌之間的共同結(jié)構(gòu)特征可能是通用的。例如，革蘭陰性內(nèi)部細(xì)菌細(xì)胞壁(Gram-negative inner bacterial cell wall)可能與革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁有某些特征相同。
[0188]II1.截短構(gòu)建物
[0189]描述為假設(shè)0RF56的區(qū)域包含唯一的內(nèi)部PstI位點(diǎn)，利用此位點(diǎn)不難產(chǎn)生一構(gòu)建物，該構(gòu)建物可提供約57kD的SEQ ID NO:1氨基酸297-808的蛋白質(zhì)C末端區(qū)域。從上述全長(zhǎng)0RF56克隆切下編碼讀框的C末端部分的Pst1-HindIII片段。將Pst1-HindIII片段克隆到pRSETA載體中產(chǎn)生pRSETA-57kDa(pGMB 599) 0RF56克隆構(gòu)建物。將從其切下的Nde1-HindIII片段作為Nde1-HindIII克隆到pET21a載體中產(chǎn)生pGMB 612。這個(gè)克隆表達(dá)57kDa蛋白(預(yù)期的)及約50kDa和約23kDa的蛋白。出乎意料的是，這些較小的蛋白明顯是大小與構(gòu)建物表達(dá)的全長(zhǎng)91kDa蛋白大致相同的穩(wěn)定的降解產(chǎn)物。
[0190]構(gòu)建DNA序列產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1大致氨基酸363-808的推定0RF56區(qū)域的50kDa C末端部分。利用合適是特異性引物產(chǎn)生PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。該P(yáng)CR產(chǎn)物在正向引物中含NdeI位點(diǎn)，在反向引物中含XhoI位點(diǎn)，將得到的Nde1-XhoI片段克隆到pET21a載體中以摻入Nde1-XhoI插入物。此產(chǎn)物標(biāo)記為p⑶C060/061。此構(gòu)建物表達(dá)50kDa蛋白(預(yù)期的)和約23kDa蛋白。出乎意料的是，這些較小的蛋白明顯仍是大小與全長(zhǎng)91kDa0RF56蛋白和截短的57kDa 0RF56蛋白構(gòu)建物觀察到的大致相同的穩(wěn)定的降解0RF56產(chǎn)物。
[0191]制作DNA構(gòu)建物以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于約Met-(氨基酸603至808)的0RF56蛋白的23kDaC末端部分。編碼23kDaC末端區(qū)的0RF56的DNA序列經(jīng)PCR擴(kuò)增，從而在正向引物中引入ATG起始密碼子。將此PCR產(chǎn)物作為Nde1-XhoI片段克隆到pET21a中產(chǎn)生標(biāo)記為p⑶C070的構(gòu)建物。此構(gòu)建物表達(dá)的蛋白在SDS PAGE中約為27kDa，另一種蛋白約為23kDa。4°C貯存，這二種形式收縮成一條約23kDa的條帶。[0192]制作DNA構(gòu)建物以產(chǎn)生約對(duì)應(yīng)于氨基酸620至808的0RF56蛋白的19kDa C末端片段。用特異性引物擴(kuò)增與其對(duì)應(yīng)的DNA序列，然后作為Nde1-XhoI插入物克隆到pET21a中。產(chǎn)生的構(gòu)建物命名為P⑶C089。此構(gòu)建物表達(dá)的蛋白在SDS PAGE中約為21kDa，與上述構(gòu)建物觀察到的穩(wěn)定降解產(chǎn)物大致相同。
[0193]這些不同的構(gòu)建物提示，9IkDa全長(zhǎng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物在所用條件下不是特別穩(wěn)定。出現(xiàn)了二種相當(dāng)穩(wěn)定的降解產(chǎn)物，第一種是50kDa蛋白，另一是23kDa蛋白。降解是來自快速外蛋白酶(exoprotease)還是內(nèi)蛋白酶(endoprotease)的活性,或是二者的組合尚不清楚。然而，似乎確實(shí)是不同的構(gòu)建物降解成穩(wěn)定的23kDa截短0RF56蛋白。
[0194]IV.純化蛋白的抗微生物活性
[0195]利用測(cè)定金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物CFU (菌落形成單位)降低的試驗(yàn)檢測(cè)各種0RF56截短物和/或降解產(chǎn)物的溶解活性。在所有情況下，0RF56的截短或降解產(chǎn)物均顯示明顯能夠減少溶液中的金黃色葡萄球菌CFU，提示這些構(gòu)建物和穩(wěn)定的降解產(chǎn)物都保留了對(duì)細(xì)胞壁的溶解活性。所有這些構(gòu)建物的共同特征是C末端區(qū)域包含CHAP結(jié)構(gòu)域。
[0196]V.待檢測(cè)溶解活性的含CHAP結(jié)構(gòu)域的候選同源基因
[0197]0RF56殺菌活性與C-末端CHAP結(jié)構(gòu)域相關(guān)。因此，可用BLAST檢索鑒定測(cè)序噬菌體基因組中其它的“溶解”活性。這些“溶解”區(qū)段的其它有用來源包括參與噬菌體基因組穿透進(jìn)入宿主的組分，如衍生自噬菌體用于附著靶宿主的尾或結(jié)合組分，或衍生自前噬菌體或膿菌素樣結(jié)構(gòu)。此外，所謂的“溶解”活性可以鑒定在噬菌體尾基因盒的編碼區(qū)段中，例如根據(jù)特征性基因組成。
[0198]利用CHAP結(jié)構(gòu)域或其它特征作了研究。具體地說，CHAP結(jié)構(gòu)域處于ORF的C-末端區(qū)域的那些基因更可能與此活性相關(guān)。特別感興趣的是金黃色葡萄球菌噬菌體K、Twort、和Gl的含CHAP結(jié)構(gòu)域的蛋白。
[0199]V1.嵌合構(gòu)建物
[0200]制備了將作用于靶葡萄球菌菌株細(xì)胞壁的催化片段與結(jié)合細(xì)胞表面物質(zhì)的靶向片段的許多融合構(gòu)建物。此結(jié)合部分能選擇性定位在合適靶細(xì)菌的表面，催化活性則作用于附近的底物位點(diǎn)?？蓳饺虢宇^以拓寬底物可接近的區(qū)域(活性位點(diǎn)濃度高的區(qū)域)。可利用能識(shí)別高度可接近、高表達(dá)的或選擇性細(xì)胞表面標(biāo)記的不同結(jié)合部分。在宿主細(xì)菌衍生的蛋白中可發(fā)現(xiàn)包含革蘭陰性菌細(xì)胞壁標(biāo)記結(jié)合區(qū)段，在革蘭陰性菌用于控制細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的蛋白中可發(fā)現(xiàn)類似革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)段。宿主的特異性噬菌體也應(yīng)包含能識(shí)別和結(jié)合它們各自宿主細(xì)胞壁的多肽。低等到高等真核細(xì)胞來源的肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRP)和與特定細(xì)菌細(xì)胞壁具有結(jié)合親和力的其它結(jié)合蛋白(優(yōu)選生理?xiàng)l件和形式)合適的結(jié)合活性片段的來源。在某些情況下，可采用多個(gè)不同的部分。選擇的接頭應(yīng)能讓其它片段適當(dāng)折疊但不會(huì)相互干擾，同時(shí)能提供相應(yīng)底物附近的局部催化劑濃度升高的范圍。催化片段能靶向優(yōu)選的底物，多個(gè)片段可靶向靶細(xì)菌上發(fā)現(xiàn)的不同連接鍵。
[0201]具體地說，為尋址革蘭陽(yáng)性菌靶標(biāo)，結(jié)合片段優(yōu)選來源于能識(shí)別細(xì)菌生理“展示”的胞外細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)。因此，識(shí)別革蘭陰性菌細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)包括能識(shí)別這些感染物質(zhì)的免疫系統(tǒng)組分。細(xì)胞壁降解結(jié)構(gòu)域的合適來源是能感染革蘭陰性宿主的噬菌體尾結(jié)構(gòu)。同樣，對(duì)于革蘭陽(yáng)性菌，結(jié)合結(jié)構(gòu)域可衍生自革蘭陽(yáng)性感染噬菌體的尾結(jié)構(gòu)，或?qū)τ诟锾m陰性菌，衍生自PGRP。細(xì)胞壁降解活性可衍生自感染革蘭陰性宿主的尾結(jié)構(gòu)。就分支桿菌、孢子菌或其它原核生物或相關(guān)生物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相同的程度而言，也可用這些物質(zhì)調(diào)節(jié)它們的生長(zhǎng)。
[0202]此外，由于感染特定宿主的噬菌體選擇過程，靶向生活在極端條件中、嗜熱、嗜鹽、高度氧化或反應(yīng)條件、極端pH、高度蛋白溶解環(huán)境等中的宿主的噬菌體是有用的催化或結(jié)合片段的特別感興趣的來源。接觸細(xì)胞外部極端環(huán)境的蛋白質(zhì)(傾向于進(jìn)入)應(yīng)具有高度演化的特征，從而能在相對(duì)安全的胞內(nèi)環(huán)境之外存活。因此，選擇結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征對(duì)不適宜條件的穩(wěn)定性從而能提供穩(wěn)定性更好的產(chǎn)物。這種產(chǎn)物應(yīng)具有良好的貯存性能，選擇具有良好的藥理學(xué)保存和儲(chǔ)存期的產(chǎn)物，并可提供簡(jiǎn)單的純化分離手段。
[0203]制備的構(gòu)建物包含0RF56序列的各種區(qū)段(見GeneID2948023, YP_024486, YP_024486.1);其中 16KDa 片段對(duì)應(yīng)于氨基酸 669-808; 19KDa 片段對(duì)應(yīng)于氨基酸629-808; 13KDa片段對(duì)應(yīng)于氨基酸691-808 ；0RF56結(jié)合片段對(duì)應(yīng)于氨基酸629-690。葡萄球菌溶葡萄球素(lss;AAB53783)區(qū)段包含的結(jié)合區(qū)段對(duì)應(yīng)于氨基酸395-493;催化(lys-lys切割)片段對(duì)應(yīng)于氨基酸248-394。L54a酰胺酶(AAW38858;YP_185281)結(jié)合片段對(duì)應(yīng)于氨基酸 76-484。LytM 肽酶(L77194;AAV62278.1)催化片段對(duì)應(yīng)于氨基酸223-322。噬菌體phill的酰胺酶(NP_803306;AAL82281;參見AF424781.1的40893-42365)片段對(duì)應(yīng)于氨基酸391-490。這些構(gòu)建物由17啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。
[0204]制備了許多融合構(gòu)建物:構(gòu)建物I含有序列Met- (16KDa 0RF56催化片段)-Leu-Glu-(溶葡萄球菌素結(jié)合片段)，其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)稱為嵌合體128 (SEQ ID N0:4)。構(gòu)建物2含有序列(19KDa 0RF56催化片段)-Leu-Glu-(溶葡萄球菌素結(jié)合片段)。構(gòu)建物3含有序列(13KDa 0RF56催化片段)-Leu-Glu-(溶葡萄球菌素結(jié)合片段)。構(gòu)建物4含有序列(16KDa 0RF56催化片段)-Leu-Glu-(L54a酰胺酶結(jié)合片段)。構(gòu)建物5含有序列Met-(LytM肽酶催化片段)-Leu-Glu-(溶葡萄球菌素結(jié)合片段)。構(gòu)建物6含有序列Met-(溶葡萄球菌素催化片段)-(0RF56結(jié)合片段)。構(gòu)建物7含有序列(LytM肽酶催化片段)_構(gòu)建物1，它含有二個(gè)催化結(jié)構(gòu)域(LytM肽酶，0RF56)。構(gòu)建物8含有序列Met_16KDa0RF56催化片段-Leu-Glu-(phi 11酰胺酶結(jié)合片段)。同樣，可采用其它來源的其它催化或結(jié)合片段，或可產(chǎn)生它們的變 體并優(yōu)化所需特征。
[0205]在相應(yīng)宿主中產(chǎn)生構(gòu)建物1，宿主裂解包括超聲步驟。類似方法適用于其它構(gòu)建物。通過硫酸銨(20-50%)沉淀、Q-500柱層析(pH 7.5)、CM纖維素層析(pH6.0)，用200mMNaCl洗脫和凝膠過濾純化粗制的裂解液。用銀染色估計(jì)此產(chǎn)品的純度>98%。
[0206]VI1.活性檢測(cè)
[0207]用一組30個(gè)類型不同的金黃色葡萄球菌菌株(選擇spa、Agr或Mec類型,包括MLST和甲氧西林耐藥性)測(cè)試構(gòu)建物I產(chǎn)品，嵌合體128。嵌合體128對(duì)這些測(cè)試菌株均有活性，觀察到點(diǎn)樣1.5微克蛋白有菌苔抑制。利用約1E8 CFU的MRSA菌株B911，50微克全長(zhǎng)0RF56蛋白使CFU降低約21og單位，而1.5微克嵌合體128將CFU降低約51og單位(10，000倍)。35°C，在含1%BSA的Mueller Hinton肉湯中以5E5細(xì)胞/ml培育各種代表性金黃色葡萄球菌菌株(見Kusuma和Koka1-Kun (2005)“檢測(cè)不同金黃色葡萄球菌菌株對(duì)溶葡萄球菌素敏感性的四種方法比較(Comparison of four methods for determining lysostaphinsusceptibility of various strains of Staphylococcus aureus)，，Antimicrob.AgentsChemother.49:3256-263; PMID: 16048934)，菌落靜置16小時(shí)。嵌合體128的最低抑制濃度(MIC)約為1-10微克/ml。測(cè)試金黃色葡萄球菌COL株中首次接觸嵌合體128的存活菌，發(fā)現(xiàn)存活菌再次接觸此蛋白時(shí)敏感。測(cè)試金黃色葡萄球菌菌株B911的溶葡萄球菌素耐受變體顯示99.9%的細(xì)胞對(duì)1.5微克嵌合體128敏感。
[0208]4°C，嵌合體128在Tris緩沖液中穩(wěn)定至少一個(gè)月，室溫(約25°C )穩(wěn)定約四周，37°C約一天。某些凝膠和液體制劑的穩(wěn)定期更長(zhǎng)。
[0209]用菌苔抑制試驗(yàn)、酶譜試驗(yàn)、菌落形成單位(CFU)降低試驗(yàn)檢測(cè)了其它嵌合構(gòu)建物。菌苔抑制試驗(yàn)是定性試驗(yàn)，其中將測(cè)試蛋白點(diǎn)在細(xì)菌菌苔上，檢測(cè)生長(zhǎng)抑制區(qū)。殺菌活性對(duì)應(yīng)于菌苔抑制區(qū)；沒有活性則對(duì)應(yīng)于無可見的抑制區(qū)。酶譜試驗(yàn)也是定性試驗(yàn)，其中用高壓滅菌的靶細(xì)菌細(xì)胞浸潰SDS-PAGE凝膠，對(duì)噬菌體制品作凝膠電泳。使凝膠上的蛋白質(zhì)原位復(fù)性然后作用于細(xì)胞壁組分，用亞甲基蘭染料染色凝膠后產(chǎn)生清晰的“溶解”區(qū)。參見例如 L印eupl 等，(1998)Appl.Environ.Microbiol.64:4142-428, PMID:9797258? 活性對(duì)應(yīng)于深蘭色背景所襯托的可見清晰區(qū)。CFU降低試驗(yàn)是定量試驗(yàn)，其中用殺傷百分比衡量活性。將培養(yǎng)的細(xì)菌與嵌合蛋白混合后接種在LB培養(yǎng)基上?；钚詫?duì)應(yīng)于細(xì)胞數(shù)至少減少99.9%。無活性對(duì)應(yīng)于細(xì)胞數(shù)不減少。每次試驗(yàn)設(shè)置合適的陽(yáng)性和陰性對(duì)照。許多嵌合蛋白的結(jié)果見表I。許多含0RF56胞壁溶解結(jié)構(gòu)域，也稱為催化結(jié)構(gòu)域(CD)的TAME-CBD蛋白證明有活性。含溶葡萄球菌素CD和0RF56結(jié)合結(jié)構(gòu)域的TAME-CBD蛋白也具有殺菌活性。
[0210]表I
[0211]
【權(quán)利要求】
1.一種嵌合型尾相關(guān)溶胞壁酶(TAME)多肽，其特征在于，所述嵌合型TAME多肽包含: 溶胞壁結(jié)構(gòu)域，和 結(jié)合靶細(xì)菌的異源細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 其中所述靶細(xì)菌與所述嵌合型TAME多肽接觸后顯示生長(zhǎng)減慢或不生長(zhǎng)， 其中所述嵌合型多肽的序列選自下組: SEQ ID NO:8的2-257號(hào)氨基酸； SEQ ID NO: 10的2-211號(hào)氨基酸；和 SEQ ID NO: 11 的 2-340 號(hào)氨基酸。
2.一種嵌合型尾相關(guān)溶胞壁酶(TAME)多肽，其特征在于，所述嵌合型TAME多肽包含: 溶胞壁結(jié)構(gòu)域，和 結(jié)合靶細(xì)菌的異源細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 其中所述靶細(xì)菌與所述嵌合型TAME多肽接觸后顯示生長(zhǎng)減慢或不生長(zhǎng)， 其中所述嵌合型多肽的序列選自下組: SEQ ID NO:8的1-257號(hào)氨基酸；
SEQ ID NO: 10 的 1-211 號(hào)氨基酸； SEQ ID NO: 11 的 1-340 號(hào)氨基酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述靶細(xì)菌是甲氧西林耐藥葡萄球菌。
4.由SEQID NO:8的2-146和149-257號(hào)氨基酸組成的多肽，可選由接頭連接。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其由SEQID NO:8的2-257號(hào)氨基酸組成。
6.由SEQID NO:8的1-146和149-257號(hào)氨基酸組成的多肽，可選由接頭連接。
7.如權(quán)利要求6所述的多肽，其由SEQID NO:8的1-257號(hào)氨基酸組成。
8.由SEQID NO: 10的2-148和149-211號(hào)氨基酸組成的多肽，可選由接頭連接。
9.如權(quán)利要求8所述的多肽，其由SEQID NO: 10的2-211號(hào)氨基酸組成。
10.由SEQID NO: 10的1-148和149-211號(hào)氨基酸組成的多肽，可選由接頭連接。
11.如權(quán)利要求10所述的多肽，其由SEQID NO: 10的1-211號(hào)氨基酸組成。
12.由SEQID NO: 11的2-100，102-241和244-340號(hào)氨基酸組成的多肽，可選由接頭連接。
13.如權(quán)利要求12所述的多肽，其由SEQID NO: 11的2-340號(hào)氨基酸組成。
14.由SEQID NO: 11的1-100，102-241和244-340號(hào)氨基酸組成的多肽，可選由接頭連接。
15.如權(quán)利要求14所述的多肽，其由SEQID NO: 11的2-340號(hào)氨基酸組成。
16.一種酶促降解細(xì)菌細(xì)胞壁的方法，該方法包括使細(xì)胞壁接觸。
17.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的多肽在藥物生產(chǎn)中的用途，所述藥物用于治療需要這種治療的對(duì)象中的細(xì)菌感染。
18.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的多肽在制備消毒劑中的用途。
19.一種編碼權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述多肽的分離核酸。
20.一種與權(quán)利要求19所述核酸互補(bǔ)的分離的核酸探針。
21.—種包含權(quán)利要求19所述核酸的表達(dá)載體。
22.—種包含權(quán)利要求21所述表達(dá)載體的細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103436507SQ201310322283
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2007年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2006年5月5日
【發(fā)明者】S·帕德馬納巴恩, V·D·保羅, R·S·薩拉瓦納, B·斯里拉姆 申請(qǐng)人:岡戈根股份有限公司