專利名稱：一種釀酒酵母菌株及其選育方法以及該菌在酒精生產(chǎn)上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株能快速生長且適于高溫濃醪發(fā)酵生產(chǎn)酒精的釀酒酵母菌株及其 選育方法，以及利用該菌高溫濃醪發(fā)酵淀粉生產(chǎn)燃料乙醇的方法，屬工業(yè)微生物發(fā)酵工程 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
世界石油資源日趨枯竭，大力發(fā)展、使用燃料酒精，是國家一項(xiàng)新能源戰(zhàn)略。木薯 燃料酒精的研究和成功產(chǎn)業(yè)化，具有很大的戰(zhàn)略意義和社會(huì)效益。目前木薯原料生產(chǎn)燃料 乙醇大部分采用間歇式稀醪發(fā)酵，存在技術(shù)水平低，發(fā)酵效率低，能耗大，環(huán)境負(fù)荷大及經(jīng) 濟(jì)性有待進(jìn)一步提高等問題。美國企業(yè)濃醪發(fā)酵酒精濃度普遍可達(dá)15% (ν/ν)以上，而國 內(nèi)濃醪發(fā)酵酒精濃度僅為11%-12% (ν/ν) 0經(jīng)實(shí)際測(cè)算，每提高的發(fā)酵醪酒分(玉米 為原料)，噸酒精收益約為30-40元，酒精生產(chǎn)企業(yè)中酒精含量每提高1 %，能耗下降3%，整 體經(jīng)濟(jì)效益提高3%。作為能源使用的燃料乙醇尋求環(huán)保、低成本的酒精發(fā)酵技術(shù)，濃醪發(fā) 酵技術(shù)是發(fā)展發(fā)酵燃料乙醇工業(yè)的有效途徑之一。濃醪發(fā)酵可以提高設(shè)備利用率，可節(jié)能 省水，縮短發(fā)酵周期。目前，制約木薯原料濃醪發(fā)酵的主要瓶頸是發(fā)酵菌種和酶制劑。在濃 醪發(fā)酵中，由于可發(fā)酵性糖含量高，普通釀酒酵母菌在濃醪液中生長繁殖和發(fā)酵受到抑制， 且對(duì)溫度敏感，高溫耐受范圍小，發(fā)酵最適溫度通常為28 33°C，一般不超過36°C，而糖化 酶的最適溫度為60°C。若提高發(fā)酵溫度，酶活力上升，單位時(shí)間內(nèi)可發(fā)酵性糖的轉(zhuǎn)化率提 高，發(fā)酵周期會(huì)有所縮短，同時(shí)發(fā)酵溫度的提高可減少冷卻水的用量。在酒精生產(chǎn)過程中， 酒精含量對(duì)酵母菌的生長影響很大，普通酵母在乙醇濃度達(dá)11%左右時(shí)，發(fā)酵完全受到抑 制，所以在濃醪發(fā)酵時(shí)，有必要選用酒精耐性高的酵母菌。綜上所述，耐高溫、耐酒精和耐高 糖的酵母菌，可以更好地適合濃醪酒精發(fā)酵的要求，能夠?yàn)榫凭l(fā)酵工業(yè)帶來顯著的經(jīng)濟(jì) 效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，目的在于提供一種能快速生長且適于高溫濃醪發(fā)酵 生產(chǎn)酒精的釀酒酵母菌株及其選育方法，以及利用該菌高溫濃醪發(fā)酵淀粉生產(chǎn)燃料乙醇的 方法。本發(fā)明技術(shù)方案如下一種能快速生長高溫濃醪發(fā)酵生產(chǎn)酒精的釀酒酵母菌，經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所鑒定，其分類學(xué)名為釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，菌株號(hào)為Y09tj，已于 2009年11月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡稱CGMCC， 保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為 CGMCCN0. 3476。所述釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476可在麥芽汁和含葡萄糖或麥芽糖或棉子糖的YPD培養(yǎng)基上生長，YPD培養(yǎng)基成分含蛋白胨20g/L、酵母粉5g/L和糖20g/L，乳白色，表面平滑， 邊緣整齊，適宜生長溫度為28 V -40°C，最適生長溫度37°C，葡萄糖最高耐受濃度為62% (w/v)，且生長快速，且有很好的抗乙醇毒性，適于濃醪發(fā)酵生產(chǎn)酒精。所述釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476的選育方法，其特征是從常見的農(nóng)家自釀甜酒中 分離并經(jīng)紫外誘變篩選得到，方法如下(1)培養(yǎng)基YPD液體培養(yǎng)基葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，自來水定容至IOOOml ；YPD固體培養(yǎng)基葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，瓊脂15g，自來水定容至 IOOOml ；種子培養(yǎng)基同前述YPD液體培養(yǎng)基；上述培養(yǎng)基經(jīng)高溫121°C滅菌20min ；發(fā)酵培養(yǎng)基30%-40%的淀粉，加自來水定容至100ml，加入量為llu/g淀粉的耐 高溫α-淀粉酶，在震蕩水浴鍋95°C液化2h，冷卻至61°C，加入量為57u/g淀粉的糖化酶， 在61°C水浴鍋糖化45min，再添加尿素0. Ig ；(2)出發(fā)菌株分離篩選菌種初篩取5g甜酒樣品加入裝有IOOml無菌生理鹽水的小三角瓶中，置37°C搖 床振蕩培養(yǎng)2h，靜置5min，取上清液做濃度梯度稀釋至10_6倍，取200 μ 1稀釋液涂布于YPD 平板，37°C倒置培養(yǎng)2d，挑取較大的酵母單菌落轉(zhuǎn)接于IOml含10%葡萄糖的YPD液體培養(yǎng) 基，置37°C，160r/min搖床培養(yǎng)，觀察產(chǎn)泡沫的速度和量，聞發(fā)酵液中酒精濃度，初步篩選 產(chǎn)酒精快而多的菌株，經(jīng)YPD平板分離劃線法得到純種，取一環(huán)活化好的菌種接于5ml液體 YPD培養(yǎng)基，370C，160r/min搖床培養(yǎng)16h得初篩菌種種子液；菌種復(fù)篩30g的淀粉按1 2.2(w/v)的料水比調(diào)好淀粉漿液，加入量為llu/g淀 粉的耐高溫α “淀粉酶，在水浴鍋95°C液化2h，冷卻至61°C，加入量為57u/g淀粉的糖化 酶，在61°C水浴鍋糖化45min，淀粉糊液冷卻至37°C，加入終濃度為0. 1 %的尿素，分別接入 初篩菌種種子液，接種量為5%，置37°C，160r/min搖床發(fā)酵3d，定時(shí)取樣測(cè)酒度和殘?zhí)牵x 出生長發(fā)酵速度快，產(chǎn)酒率高，殘總糖和殘還原糖低的菌株，以此菌株作為出發(fā)菌株；(3)紫外線誘變育種酵母菌原生質(zhì)體制備從活化好的菌種斜面上分別取一環(huán)接種于IOOml液體培養(yǎng) 基上，于30°C，200r/min搖床培養(yǎng)12 16h，收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，各取5ml加入離心管中 3500r/min，離心5min，用0. lmol/L，pH6. 0的磷酸鹽緩沖溶液(PB)洗2次，30°C靜置lOmin， 離心棄去上清液，加入含有纖維素酶和蝸牛酶的PB破壁溶液，于30°C水浴處理處理30min， 2000r/min，離心lOmin，用含0. lmol/L磷酸緩沖液、0. 7mol/L KCl、pH6. 0的高滲PB緩沖液 洗滌2次，離心收集原生質(zhì)體；酵母菌原生質(zhì)體誘變?nèi)Oml原生質(zhì)體液置于帶轉(zhuǎn)子的9cm的平皿中，在15W紫外燈下距30cm磁力攪拌照射15-20s后，取0. 2ml涂在含5% NaCl的YPD固體培養(yǎng)基高滲 平板(ok)，30°C恒溫避光培養(yǎng)3d ；平板初篩將紫外照射后的菌液涂布YPD平板，分別放置在37°C、40°C進(jìn)行培養(yǎng)， 選出生長快且菌落大的耐高溫菌株，將選出的耐高溫菌株的以同樣的方法制備原生質(zhì)體， 以同樣的方法經(jīng)紫外線照射，菌液涂布在含8% 15%酒精濃度的YPD平板，于37°C培養(yǎng)，選出生長快且菌落大的耐高溫、耐高酒精菌株，再利用含0. 1% TTC的YPD固體培養(yǎng)基平板 篩選出產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的突變菌株；發(fā)酵復(fù)篩利用平板初篩獲得的菌株用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵篩選，用顯微鏡觀察 菌體的活菌數(shù)和出芽率，篩選出產(chǎn)酒性能最優(yōu)的酵母菌Y09tj。所述釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476的性能測(cè)定方法及結(jié)果如下穩(wěn)定性驗(yàn)證把釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476在YPD培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)溫度條件下傳 代十次，然后進(jìn)行耐溫和耐酒精試驗(yàn)，并用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其生長發(fā)酵 速度快、產(chǎn)酒率高，其耐溫和耐酒精的優(yōu)良性狀穩(wěn)定遺傳。生長曲線測(cè)定取一環(huán)活化好的菌種接于5ml液體YPD培養(yǎng)基，37°C，160r/min搖 床培養(yǎng)16h，取1ml轉(zhuǎn)接到250ml新鮮液體YPD培養(yǎng)基，37°C，160r/min搖床培養(yǎng)24h，每隔 2小時(shí)取樣，以未接種的液體YPD液體培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間下，菌懸液用分光 光度計(jì)于可見光600nm測(cè)定光吸收值0D_，根據(jù)光吸收值和時(shí)間繪制生長曲線圖，如附圖1 所示，酵母菌CGMCC NO. 3476比對(duì)照菌株生長速度快，接種5小時(shí)就可達(dá)到對(duì)數(shù)生長期，比 對(duì)照菌株提前了 4個(gè)小時(shí)。耐溫測(cè)定將釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476接種入含10%的葡萄糖的YPD液體培養(yǎng) 基的試管中，試管內(nèi)放有杜氏小試管，將試管分別放置在37°C、40°C、42°C和45°C培養(yǎng)箱， 次日觀察試管的產(chǎn)氣泡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在37°C產(chǎn)氣情況很好，40°C產(chǎn)氣情況為37°C的80% 以上，42°C有少量，45°C微量。耐糖測(cè)定將釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476接種入含10% -70%范圍的葡萄糖的YPD 液體培養(yǎng)基的試管中，試管內(nèi)放有杜氏小試管，放置在37°C培養(yǎng)箱，次日觀察試管的產(chǎn)氣泡 情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在含葡萄糖為62%的試管內(nèi)仍有氣泡產(chǎn)生，說明其可耐高達(dá)62%的葡萄 糖。由此可見，釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476具備生長速度快，產(chǎn)酒率高，發(fā)酵周期短的 優(yōu)勢(shì)和耐高溫、耐高糖和耐酒精等性能特點(diǎn)，適于高溫濃醪發(fā)酵制取酒精。本發(fā)明還提供了利用釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476高溫快速濃醪發(fā)酵淀粉生產(chǎn)燃料 酒精的方法，步驟如下1、種子液準(zhǔn)備接種釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476于YPD液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過夜，使0D_ 約為10左右，得種子液；2、濃醪液準(zhǔn)備基于容器的容積，稱取重量體積比30% 40%的淀粉置于容器中，加水?dāng)嚢杈?勻，按20u/g淀粉加入液化酶，加熱升溫使液化溫度為85-90°C，液化時(shí)間lh，使DE值為 15% -20%，得濃醪液；3、接種發(fā)酵濃醪液降溫至37°C，按100u/g淀粉加入糖化酶，添加0. 1 % (m/v)的尿素，以5% 接種量接入種子液，置于37°C搖床進(jìn)行同步糖化發(fā)酵，轉(zhuǎn)速lOOr/m，發(fā)酵時(shí)間46h，即可得 酒精。本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)和有益效果是1、釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476適宜生長溫度范圍廣，一年四季均可使用，尤其保證
6夏季高溫正常發(fā)酵，適合于南方的天氣條件，有利于節(jié)省能耗。2、釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476性能穩(wěn)定，長期冰箱甘油保藏發(fā)酵性能不降低，多批 次發(fā)酵結(jié)果都有較好的重現(xiàn)性。3、釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476生長快，發(fā)酵能力強(qiáng)，具有很高的抗乙醇毒性，并可 耐高葡萄糖濃度，最高可耐62%葡萄糖濃度，適宜濃醪發(fā)酵，利用本發(fā)明的方法平均產(chǎn)酒率 比其它生產(chǎn)菌提高1. 2%，出產(chǎn)酒率可高達(dá)16. 0% (v/v)，且發(fā)酵周期短，以含26. 8%總糖 的淀粉液化醪為底物發(fā)酵40h其酒度達(dá)15. 0%，一般工業(yè)用酵母菌為發(fā)酵70h其酒度僅達(dá) 14.5%。本發(fā)明發(fā)酵周期短，設(shè)備利用率可大幅提高。保藏信息說明一株能快速生長高溫濃醪發(fā)酵生產(chǎn)酒精的釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)Y09tj,目前保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱 CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期 為2009年11月24日，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 3476。


圖1是釀酒酵母菌CGMCC No. 3476和工業(yè)用菌在37°C的生長曲線。圖2是釀酒酵母菌CGMCC No. 3476在500L發(fā)酵罐的發(fā)酵曲線圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一三角瓶搖床試驗(yàn)1.高溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn)1. 1種子液的準(zhǔn)備將斜面保存的釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476接種入裝有 lOOmLYPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C搖床培養(yǎng)過夜，使種子液的0D6(1(1約為10左右。1. 2工藝方案和基本條件工藝方案按照原料準(zhǔn)備、調(diào)漿、液化、添加糖化酶、添加尿素發(fā)酵的步驟，采用液化 酶一次加入，液化溫度85-90°C，液化時(shí)間lh，無糖化，降溫到37°C后添加諾維信糖化酶并 接種發(fā)酵的發(fā)酵工藝。實(shí)驗(yàn)的基本條件如下(1)原料淀粉量33% (m/v)(2)調(diào)漿方法室溫，加入自來水(3)液化震蕩水浴鍋加熱至85-90°C，液化lh(4)淀粉酶用量22u/g原料(5)糖化酶用量105u/g原料(6)尿素用量0.1% (m/v)(7)接種量5%1. 3發(fā)酵實(shí)驗(yàn)將種子液接入液化醪，分別在溫度為30°C、37°C、4(TC，轉(zhuǎn)速100r/ min的搖床進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酒試驗(yàn)，發(fā)酵46h。1.4結(jié)果如表1所示，釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476在37°C時(shí)產(chǎn)酒量最高，在40°C 時(shí)的產(chǎn)酒量為最高產(chǎn)酒量的80%以上。
表1.酵母菌CGMCC No . 3476在不同溫度下發(fā)酵的酒精含量 2.高溫濃醪發(fā)酵實(shí)驗(yàn)2. 1種子液的準(zhǔn)備，與1. 1相同。2. 2工藝方案和基本條件與本實(shí)施例1. 2的工藝方案和基本條件，除原料淀粉量 分別為30%、33%和40%外，其余相同。2. 3發(fā)酵實(shí)驗(yàn)將種子液接入30%、33%和40%的淀粉液化醪，在37°C，lOOr/min 的搖床進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酒試驗(yàn)，發(fā)酵46h。2. 4結(jié)果如表2所示釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476在高溫濃醪條件下發(fā)酵產(chǎn)酒，產(chǎn) 酒度可達(dá)16. 28%。表2.釀酒酵母菌CGMCC No . 3476三角瓶濃醪發(fā)酵結(jié)果 3.與工業(yè)菌株的發(fā)酵對(duì)照實(shí)驗(yàn)3. 1種子液的準(zhǔn)備與本實(shí)施例1. 1的相同3. 2工藝方案和基本條件本實(shí)施例1. 2相同3. 3對(duì)照發(fā)酵實(shí)驗(yàn)分別將對(duì)照工業(yè)菌株的種子液和釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476 的種子液接入淀粉液化醪，在37°C，lOOr/min的搖床進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酒試驗(yàn)，測(cè)定成熟發(fā)酵醪 的酒度、殘還原糖和殘?zhí)恰?. 4結(jié)果如表3所示，釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476比對(duì)照工業(yè)菌株的發(fā)酵時(shí)間縮 短了 14h，且產(chǎn)酒量也高一些。表3釀酒酵母菌CGMCC No. 3476與對(duì)照工業(yè)菌的發(fā)酵結(jié)果 實(shí)施例二 20L發(fā)酵罐小試1、種子液的準(zhǔn)備將斜面保存的釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476接種入裝有YPD液體 培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C搖床培養(yǎng)過夜，使種子液的0D_約為10左右。2、工藝方案如下按照原料準(zhǔn)備、調(diào)漿、液化、添加糖化酶、添加尿素發(fā)酵的步驟，采用液化酶1次加 入，液化溫度85-90°C，液化時(shí)間lh，無糖化，降溫到37°C后添加諾維信糖化酶并接種發(fā)酵 的發(fā)酵工藝。3、實(shí)驗(yàn)的基本條件如下(1)原料淀粉量33% (m/v)(2)調(diào)漿方法室溫，加入自來水(3)液化邊攪拌邊加熱至90 95°C，液化60min(4)淀粉酶用量22u/g原料(5)糖化酶用量105u/g原料(6)尿素用量0.1% (m/v)(7)接種量10%4、發(fā)酵實(shí)驗(yàn)將種子液接入液化醪，在溫度為37°C，攪拌轉(zhuǎn)速lOOr/min的條件下 發(fā)酵44h。5、結(jié)果酒精濃度可達(dá)到14.9% (v/v)，殘還原糖0.55%，殘總糖1.30%。實(shí)施例三500L發(fā)酵罐放大中試1、種子液的準(zhǔn)備接種一環(huán)斜面保藏的菌種于裝有100ml的YPD液體培養(yǎng)基的三 角瓶中，37°C搖床培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)，使種子液的0D_約為10左右。2、工藝方案與基本條件與實(shí)施例二相同。3、發(fā)酵將種子液接入液化醪，在溫度為37°C，攪拌轉(zhuǎn)速lOOr/min的條件下發(fā)酵 40h 48h，每隔4h取樣測(cè)定其酒度和殘?zhí)?。重?fù)試驗(yàn)三批次。4、發(fā)酵結(jié)果結(jié)果如表4所示，發(fā)酵時(shí)間為40h時(shí)平均酒精濃度就可達(dá)到15.0% (v/v)，殘還原糖0. 55%，殘總糖1.20%。表4.酵母菌CGMCC No . 3476在500L發(fā)酵罐3批次的發(fā)酵結(jié)果
批次 酒精含量％ 發(fā)酵時(shí)間 殘還原糖~~殘總糖淀粉利用率 附圖2是500L發(fā)酵罐的發(fā)酵曲線圖，由圖中看出，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為40h，就可達(dá)到 15%左右的酒度，殘還原糖下降不明顯，發(fā)酵即可以結(jié)束。本發(fā)明技術(shù)方案中有關(guān)酒精含量、殘還原糖及殘總糖的測(cè)定方法如下1、酒精含量的測(cè)定
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取1. 5ml發(fā)酵醪液，12，000r/min離心lOmin,取上清與10 %乙腈1 1 (v/v)混 合，氣相色譜法測(cè)定酒精含量。2、還原糖、殘總糖的測(cè)定還原糖測(cè)定取1ml發(fā)酵結(jié)束的醪液離心，取上清50 iU，加入450 ill蒸餾水， 375iUDNS，混勻，沸水浴5min，立即冷卻，可見分光光度法測(cè)定0D54(i?？瞻子谜麴s水代替發(fā) 酵醪液，其他條件不變。殘總糖測(cè)定先用20%鹽酸10ml徹底酸解發(fā)酵醪液，再按還原糖測(cè)定法測(cè)定。
權(quán)利要求
一種能快速生長高溫濃醪發(fā)酵生產(chǎn)酒精的釀酒酵母菌，其分類學(xué)名為釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，菌株號(hào)為Y09tj，已于2009年11月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC NO.3476。
2.釀酒酵母菌CGMCCNO. 3476的選育方法，其特征是從常見的農(nóng)家自釀甜酒中分離并 經(jīng)紫外誘變篩選得到， (1)培養(yǎng)基YPD液體培養(yǎng)基葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，自來水定容至IOOOml ；YPD固體培養(yǎng)基葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，瓊脂15g，自來水定容至1000ml ；種子培養(yǎng)基同前述YPD液體培養(yǎng)基；上述培養(yǎng)基經(jīng)高溫121°C滅菌20min ；發(fā)酵培養(yǎng)基30% -40%的淀粉，加自來水定容至100ml，加入量為llu/g淀粉的耐高 溫α-淀粉酶，在震蕩水浴鍋95°C液化2h，冷卻至61°C，加入量為57u/g淀粉的糖化酶，在 61°C水浴鍋糖化45min，再添加尿素0. Ig ；(2)出發(fā)菌株分離篩選菌種初篩取5g甜酒樣品加入裝有IOOml無菌生理鹽水的小三角瓶中，置37°C搖床振 蕩培養(yǎng)2h，靜置5min，取上清液做濃度梯度稀釋至10_6倍，取200 μ 1稀釋液涂布于YPD平 板，37°C倒置培養(yǎng)2d，挑取較大的酵母單菌落轉(zhuǎn)接于IOml含10%葡萄糖的YPD液體培養(yǎng) 基，置37°C，160r/min搖床培養(yǎng)，觀察產(chǎn)泡沫的速度和量，聞發(fā)酵液中酒精濃度，初步篩選 產(chǎn)酒精快而多的菌株，經(jīng)YPD平板分離劃線法得到純種，取一環(huán)活化好的菌種接于5ml液體 YPD培養(yǎng)基，370C，160r/min搖床培養(yǎng)16h得初篩菌種種子液；菌種復(fù)篩30g的淀粉按1 2. 2(w/v)的料水比調(diào)好淀粉漿液，加入量為llu/g淀粉 的耐高溫α-淀粉酶，在水浴鍋95°C液化2h，冷卻至61°C，加入量為57u/g淀粉的糖化酶， 在61°C水浴鍋糖化45min，淀粉糊液冷卻至37°C，加入終濃度為0. 的尿素，分別接入初 篩菌種種子液，接種量為5%，置37°C，160r/min搖床發(fā)酵3d，定時(shí)取樣測(cè)酒度和殘?zhí)?，選出 生長發(fā)酵速度快，產(chǎn)酒率高，殘總糖和殘還原糖低的菌株，以此菌株作為出發(fā)菌株；(3)紫外線誘變育種酵母菌原生質(zhì)體制備從活化好的菌種斜面上分別取一環(huán)接種于IOOml液體培養(yǎng)基 上，于30°C，200r/min搖床培養(yǎng)12 16h，收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，各取5ml加入離心管中 3500r/min，離心5min，用0. lmol/L，pH6. 0的磷酸鹽緩沖溶液(PB)洗2次，30°C靜置lOmin， 離心棄去上清液，加入含有纖維素酶和蝸牛酶的PB破壁溶液，于30°C水浴處理處理30min， 2000r/min，離心lOmin，用含0. lmol/L磷酸緩沖液、0. 7mol/L KCl、pH6. 0的高滲PB緩沖液 洗滌2次，離心收集原生質(zhì)體；酵母菌原生質(zhì)體誘變?nèi)Oml原生質(zhì)體液置于帶轉(zhuǎn)子的9cm的平皿中，在15W紫外燈 下距30cm磁力攪拌照射15-20s后，取0. 2ml涂在含5% NaCl的YPD固體培養(yǎng)基高滲平板， 30°C恒溫避光培養(yǎng)3d ；平板初篩將紫外照射后的菌液涂布YPD平板，分別放置在37°C、40°C進(jìn)行培養(yǎng)，選出 生長快且菌落大的耐高溫菌株，將選出的耐高溫菌株的以同樣的方法制備原生質(zhì)體，以同 樣的方法經(jīng)紫外線照射，菌液涂布在含8% 15%酒精濃度的YPD平板，于37°C培養(yǎng)，選出生長快且菌落大的耐高溫、耐高酒精菌株，再利用含0. 1% TTC的YPD固體培養(yǎng)基平板篩選 出產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的突變菌株；發(fā)酵復(fù)篩利用平板初篩獲得的菌株用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵篩選，用顯微鏡觀察菌體 的活菌數(shù)和出芽率，篩選出產(chǎn)酒性能最優(yōu)的酵母菌。
3.利用釀酒酵母菌CGMCCNO. 3476發(fā)酵淀粉生產(chǎn)酒精的應(yīng)用。
4.利用釀酒酵母菌CGMCCNO. 3476高溫快速濃醪發(fā)酵淀粉生產(chǎn)燃料酒精的方法，步驟 如下1)種子液準(zhǔn)備接種釀酒酵母菌CGMCC NO. 3476于YPD液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過夜，使0D_約 為10左右，得種子液；2)濃醪液準(zhǔn)備基于容器的容積，稱取重量體積比30% 40%的淀粉置于容器中，加水?dāng)嚢杈鶆颍?按20u/g淀粉加入液化酶，水浴加熱使液化溫度為85-90 0C，液化時(shí)間Ih，使DE值為 15% -20%，得濃醪液；3)接種發(fā)酵濃醪液降溫至37°C，按lOOu/g淀粉加入糖化酶，添加0. (m/v)的尿素，以5%接種 量接入種子液，置于37°C搖床進(jìn)行同步糖化發(fā)酵，轉(zhuǎn)速lOOr/m，發(fā)酵時(shí)間46h，即可得酒精。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種釀酒酵母菌株，分類命名為Saccharomyces cerevisiae Y09tj，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.3476。本發(fā)明還提供了該菌株的選育以及高溫快速濃醪發(fā)酵淀粉生產(chǎn)乙醇的方法。該菌株從自農(nóng)家常見自釀甜酒中分離經(jīng)紫外誘變選育得到。釀酒酵母菌CGMCC NO.3476生長快，發(fā)酵能力強(qiáng)，具有很高的抗乙醇毒性，并可耐高葡萄糖濃度，最高可耐62％(m/v)葡萄糖濃度，利用本發(fā)明的方法平均出酒率比其它生產(chǎn)菌提高1.2％，出酒率可高達(dá)16.0％(v/v)，且發(fā)酵周期短，僅需46h，設(shè)備利用率可大幅提高，發(fā)酵成本大大降低。
文檔編號(hào)C12N15/01GK101845404SQ20101004562
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者孫靚, 廖思明, 楊登峰, 王成華, 王青艷, 申乃坤, 秦艷, 陸琦, 陸雁, 黃日波 申請(qǐng)人:廣西科學(xué)院