一種來源于虎眼萬年青的4-香豆酸輔酶a連接酶，其核苷酸序列及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種來源于虎眼萬年青的4香豆酸輔酶A連接酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；還提供了編碼4香豆酸輔酶A連接酶基因的核苷酸序列，如SEQIDNO.2所示，以及含有該編碼核苷酸序列的載體和宿主細胞。本發(fā)明還提供了4香豆酸輔酶A連接酶或含有4香豆酸輔酶A連接酶的細胞在催化底物對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸為相應(yīng)硫酯化合物中的應(yīng)用。
【專利說明】-種來源于虎眼萬年青的4-香豆酸輔酶A連接酶，其核苷 酸序列及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種4-香豆酸輔酶A連接酶，其編碼基因及其在催化底物對香豆酸、 咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸為相應(yīng)硫酯化合物中的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。特別涉及虎眼萬 年青4-香豆酸輔酶A連接酶，其編碼基因及其在催化底物對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂 酸為相應(yīng)硫酯化合物中的應(yīng)用

【背景技術(shù)】
[0002] 黃酮類天然產(chǎn)物是一類種類繁多，活性顯著，結(jié)構(gòu)復雜的化合物，是許多臨床藥物 的直接或間接來源，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也有廣泛應(yīng)用。面臨資源緊張，化學合成環(huán)境污染嚴 重，產(chǎn)率低等問題，不利于社會醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展以及人們健康水平的提高，因此，建立 一種基于合成生物學理念的高效綠色合成黃酮類天然藥物的人工合成體系對創(chuàng)新藥物可 持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。
[0003] 天然藥物合成生物學是在基因組解析技術(shù)和化學合成技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技 術(shù)基礎(chǔ)上，將工程學和系統(tǒng)生物學相結(jié)合，綜合生物信息學、結(jié)構(gòu)生物學、藥學等學科，建立 起來的以規(guī)模化和程序化制備天然藥物為目的的集成學科，是一種采用綠色、可持續(xù)發(fā)展 方式規(guī)?；苽涮烊凰幬锏墓こ袒锖铣杉夹g(shù)。其研究內(nèi)容目前主要包括兩個方面，一 是天然藥物固有代謝途徑的解析，重構(gòu)與工程化；二是全新天然藥物合成途徑的設(shè)計、篩 選、組裝與程序化。不僅可以在微生物中從頭設(shè)計和構(gòu)建重要天然藥物的人工合成途徑，獲 得一些能夠生產(chǎn)合成生物技術(shù)藥物的"細胞工廠"，而且還可以通過對天然產(chǎn)物生物合成途 徑的遺傳操作來生產(chǎn)基于天然產(chǎn)物的創(chuàng)新藥物分子。
[0004] 合成生物學的物質(zhì)基礎(chǔ)是核酸，克隆途徑酶基因并對其進行功能鑒定是進行天然 產(chǎn)物合成物生物學研究的關(guān)鍵一步。作為黃酮類天然產(chǎn)物生物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶， 4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate:CoA-ligase, 4CL;EC6. 2. 1. 12)在苯丙烷類代謝途徑 中發(fā)揮重要作用，它可以催化肉桂酸以及多種肉桂酸衍生物生成相應(yīng)的硫酯化合物。而這 些輔酶A酯在植物苯丙烷類代謝途徑中再經(jīng)過短短幾個反應(yīng)即可得到有功能的次級代謝 產(chǎn)物，如香豆酰輔酶A可直接進入黃酮類化合物生物合成途徑。因此，克隆4-香豆酸輔酶A 連接酶基因并對其進行功能鑒定是黃酮類天然藥物合成生物學研究的基礎(chǔ)之一。本發(fā)明通 過對虎眼萬年青（Ornithogalum saundersiae)進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了虎眼萬年青4-香 豆酸輔酶A連接酶序列信息。通過提取虎眼萬年青RNA，利用RT-PCR，從虎眼萬年青無菌鱗 莖中克隆得到一個4-香豆酸輔酶A連接酶基因，命名為0sa4CL，并對其進行了功能鑒定，這 是首次從虎眼萬年青植物中克隆得到這個基因。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的是提供一種4-香豆酸輔酶A連接酶。
[0006] 本發(fā)明的第二目的是提供編碼該酶的核苷酸序列。
[0007] 本發(fā)明的第三目的是提供含有該核苷酸序列的表達載體。
[0008] 本發(fā)明的第四目的是提供含有該表達載體的宿主細胞。
[0009] 本發(fā)明的第五目的是提供4-香豆酸輔酶A連接酶的應(yīng)用。
[0010] 為了實現(xiàn)本發(fā)明之目的，采用的技術(shù)方案為：
[0011] 本發(fā)明提供一種來源于虎眼萬年青的4-香豆酸輔酶A連接酶，其特征在于：
[0012] a) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列；
[0013] b) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列經(jīng)替換，缺失或添加1-110個氨基酸形成的具有 同等功能的氨基酸序列。
[0014] 本發(fā)明還提供一種編碼所述4-香豆酸輔酶A連接酶的基因序列，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
[0015] 本發(fā)明還提供一種含有所述核苷酸序列的表達載體。
[0016] 本發(fā)明還提供一種所述表達載體的宿主細胞。其中所選宿主細胞優(yōu)選大腸桿菌， 釀酒酵母，畢赤酵母，鏈霉菌和植物細胞，更優(yōu)選的宿主細胞選自大腸桿菌。
[0017] 本發(fā)明還提供了 4-香豆酸輔酶A連接酶或含有4香豆酸輔酶A連接酶的細胞在 催化底物對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸為相應(yīng)硫酯化合物中的應(yīng)用。其中4-香豆酸 輔酶A連接酶的底物包括對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸，形成的產(chǎn)物分別為對香豆酰 輔酶A，咖啡酰輔酶A、阿魏酰輔酶A和肉桂酰輔酶A。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖I :0sa4CL基因的PCR分析結(jié)果，其中M是DNA分子量標準；1是0sa4CL基因 PCR結(jié)果。
[0019] 圖2 :重組質(zhì)粒pET28a0sa4CL示意圖
[0020] 圖3 :重組0sa4CL蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果，其中1是空載體對照；2是重組 0sa4CL蛋白；M是蛋白質(zhì)分子量標準。
[0021] 圖4 :重組0sa4CL蛋白的Western blotting分析結(jié)果，其中1是0sa4CL蛋白；2 是對照。
[0022] 圖5 :底物的結(jié)構(gòu)式，其中R1, R2, R3=H為肉桂酸J1=OH, R2, R3=H為對香豆酸； R1, R2=OH, R3=H 為咖啡酸 J1=OH, R2=OCH3, R3=H 為阿魏酸 J1=OH, R2, R3=OCH3 為芥子酸。
[0023] 圖6 :硫酯類產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式，其中R1, R2, R3=H為肉桂酰輔酶A J1=OH, R2, R3=H為 對香豆酰輔酶A成，R2=OH, R3=H為咖啡酰輔酶A J1=OH, R2=OCH3, R3=H為阿魏酰輔酶A ; R1=OH, R2, R3=OCH3為芥子酰輔酶A。
[0024] 圖7 :0sa4CL粗蛋白以對香豆酸為底物的HPLC結(jié)果，其中1是對照組1 (空載體 組）；2是對照組2 (滅活蛋白組）；3是實驗組。
[0025] 圖8 :0sa4CL粗蛋白以阿魏酸為底物的HPLC結(jié)果，其中1是對照組1 (空載體組)； 2是對照組2 (滅活蛋白組）；3是實驗組。
[0026] 圖9 :0sa4CL粗蛋白以咖啡酸為底物的HPLC結(jié)果，其中1是照組1 (空載體組）；2 是對照組2 (滅活蛋白組）；3是實驗組。
[0027] 圖10 :0sa4CL粗蛋白以肉桂酸為底物的HPLC結(jié)果，其中1是對照組1(空載體組)； 2是對照組2 (滅活蛋白組）；3是實驗組。
[0028] 圖11 :化合物Xl的HPLC-MS結(jié)果。
[0029] 圖12 :化合物X2的HPLC-MS結(jié)果。
[0030] 圖13 :化合物Al的HPLC-MS結(jié)果。
[0031] 圖14 :化合物A2的HPLC-MS結(jié)果。
[0032] 圖15 :化合物Cl的HPLC-MS結(jié)果。
[0033] 圖16 :化合物C2的HPLC-MS結(jié)果。
[0034] 圖17 :化合物Rl的HPLC-MS結(jié)果。
[0035] 圖18 :化合物R2的HPLC-MS結(jié)果。
[0036] 圖19 :化合物Xl1H NMR結(jié)果。
[0037] 圖20 :化合物Xl13C NMR結(jié)果。
[0038] 圖21 :化合物Al1H NMR結(jié)果。
[0039] 圖22 :化合物Al13C NMR結(jié)果。
[0040] 圖23 :化合物Cl1H NMR結(jié)果。
[0041] 圖24 :化合物Cl13C NMR結(jié)果。
[0042] 圖25 :化合物Rl1H NMR結(jié)果。
[0043] 圖26 :化合物Rl13C NMR結(jié)果。
[0044] 圖27 :0sa4CL咪唑洗脫組分的SDS-PAGE電泳結(jié)果，其中M是蛋白分子量標準；1是 菌體破碎的粗蛋白；2是含25mM咪唑elution buffer洗脫組分；3是含50mM咪唑elution buffer洗脫組分；4是含IOOmM咪唑elution buffer洗脫組分；5是含150mM咪唑elution buffer洗脫組分。
[0045] 圖28 :溫度對0sa4CL酶酶活力的影響（以對香豆酸為底物)。
[0046] 圖29 :pH對0sa4CL酶酶活力的影響（以對香豆酸為底物)。
[0047] 圖30 :0sa4CLl和其他4CLs氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹分析。

【具體實施方式】
[0048] 本發(fā)明通過如下實施例進行進一步的說明，這些實施例僅用于說明性的，而不是 以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。
[0049] 實施例1虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組測序及序列分析
[0050] 提取虎眼萬年青無菌鱗莖總RNA后，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers)合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合 成第二條cDNA鏈，在經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復、 加poly (A)并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇，最后進行PCR擴 增，建好的測序文庫用Illumina HiSeqTM2000進行測序。
[0051] 測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，即raw data或raw reads。對raw reads進行數(shù)據(jù)過濾，去掉帶接頭的，重復的，測序質(zhì)量很低的reads,得到 clean reads。使用短reads組裝軟件Trinity將具有一定長度overlap的clean reads連 成更長的片段，即Contig。然后，將clean reads比對回Contig，通過paired-end reads能 確定來自同一轉(zhuǎn)錄本的不同Contig以及這些Contig之間的距離，Trinity將這些Contig 連在一起，得到兩端不能再延長的序列，這些序列稱之為Unigene。通過blastx將Unigene 序列比對到蛋白數(shù)據(jù)庫nr、Swiss_Prot、KEGG和COG (evalue〈0. 00001)，并通過blastn將 Unigene比對到核酸數(shù)據(jù)庫nt(evalue〈0. 00001)，得到跟給定Unigene具有最高序列相似 性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。
[0052] 通過功能注釋，從虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組序列中發(fā)現(xiàn)一個具有4-香豆酸輔酶A連接酶 保守序列的 Unigene (SEQ ID NO. 3)。
[0053] 實施例20sa4CL生物信息學分析
[0054] 利用 NCBI 的 ORF Finder (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/orfig. cgi)軟件 對SEQ ID NO. 3進行ORF分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中含有1個長為1638bp的4-香豆酸輔酶A連接 酶 0RF，命名為 0sa4CL，序列如 SEQ ID NO. 2 所示。用 Expasy 中的工具 ProtParanKhttp:// web. expasy. org/protparam/)預測0sa4CL編碼蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，0sa4CL蛋白 編碼545個氨基酸，分子質(zhì)量為59. 5332kDa，理論的等電點為5. 37。通過TMpred(http:// www. ch. embnet. org/software/TMPRED_form. html)分析，結(jié)果顯不該蛋白具有 2 個跨膜結(jié) 構(gòu)域，分別是由82位?107位的26個氨基酸組成的膜內(nèi)到膜外的結(jié)構(gòu)域和232位?257 位組成的由膜外到膜內(nèi)的結(jié)構(gòu)域。由此認為該編碼蛋白很可能是一個跨膜蛋白，提示它可 能為膜受體，也可能是定位于膜的錨定蛋白或者離子通道蛋白等。
[0055] 通過 Signal P4. I (http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)對蛋白信號膚 預測，結(jié)果顯示（圖3)，該蛋白沒有信號肽，因此該蛋白不是一種分泌蛋白，綜合TMpred分 析，該蛋白應(yīng)為膜結(jié)合蛋白。
[0056] 米用 TargetPL I (http://www. cbs. dtu. dk/services/TargetP/)預測 0sa4CL 的 細胞定位，結(jié)果顯示，該蛋白定位于線粒體或分泌途徑的可能性很少(得分分別為〇. 126和 0. 068)，可能定位在其他的細胞位置(得分為0. 865)，這和前面預測該蛋白為膜結(jié)合蛋白的 結(jié)論一致。
[0057] 實施例30sa4CL基因克隆
[0058] 取IOOmg虎眼萬年青無菌鱗莖于液氮中速凍，研缽研成細粉狀，按RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)使用說明，提取虎眼萬年青愈傷組織總RNA。使用RT-PCR Kit (ReverTra-Plus-，Τ0Υ0Β0)將虎眼萬年青愈傷組織總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系和 程序如下：在 20 μ L 體系中加入總 RNAl μ g，RNase Free H2CM μ L，01ig(dT)2(lly L，65 °C 保溫5min后，立刻置于冰上冷卻，然后在上述管中再依次加入5XRT buffer4yL，RNase Inhibitor (10U/μι) 1 μ L，dNTP Mixture (IOmM)和 ReverTra Acel μ L，3CTC 保溫 10min， 42°C溫育60min，85°C變性5min，冰上5min，完成cDNA的合成。cDNA置于-20°C備用。
[0059] 以虎眼萬年青愈傷組織cDNA為模板，設(shè)計兩對0sa4CL特異引物，通過巢式PCR的 方法擴增0sa4CL基因。
[0060] 第一輪 PCR，50y L 體系中含 10XPCR buffer5y L，2mM dNTPs5y L， 25mMMgS043 μ L，10 μ M 的引物 FCLl-I (5, -TTAATTAGAAGCAAGCAAGC-3'）和 RCLl-I (5, -CTTT TCGACGGTCAGATCGAG-3,）各 I. 5 μ L，KOD-Plus-Neol μ L，cDNA2 μ L，ddH20
[0061] 補足。PCR 程序：94°C預變性 5min ;98°C變性 30s，36°C復性 45s，68°C延伸 90s，共 30 個循環(huán)；68°C 延伸 7min，4°C 保溫。第二輪 PCR，50y L 體系中含 10XPCR buffer5y L，2mM dNTPs5 μ L，25mM MgS043 μ L，10 μ M 的引物 FCL1-2 (5, -ATGGGCTCCATCCCGTCGG-3'）和 RCL l-2(5，-TCACTGCTGAGGGCCGTTAG-3，）各 I. 5μ L，K0D-Plus-Neol μ L，第一輪 PCR 產(chǎn)物 2μ L， ddH20 補足。PCR 程序：94°C預變性 5min ;98°C變性 30s，47°C復性 45s，68°C延伸 90s，共 30 個循環(huán)；68°C延伸7min，4°C保溫。0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，結(jié)果表明，擴增得到 了一條長約為I. 7kb的條帶（圖1)。
[0062] PCR 產(chǎn)物與 pEASY-Blunt (Transgen)載體連接，轉(zhuǎn)化到 Transl-Tl (Transgen)菌 株，在含有100 μ g/mL羧芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)，挑取單克隆進行菌落PCR，篩選陽性克 隆送樣測序。結(jié)果表明，擴增得到的PCR產(chǎn)物與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果完全一樣，長為1638bp，含 有該基因的載體命名為pEASY-0sa4CL。
[0063] 實施例40sa4CL表達載體的構(gòu)建
[0064] 根據(jù)In-Fusion(Clontech)同源重組的原理，以測序正確的質(zhì)粒pEASY_0sa4CL為 模板，F(xiàn)ET28aCLl (5, -TCGCGGATCCGAATTCATGGGCTCCATCCCGTCGG-3，）和 RET28aCLl(5, -GT GCGGCCGCAAGCTTTCACTGCTGAGGGCCGTTAG-3'）為引物，通過如下程序和體系進行 PCR，50 μ L 體系中含 IOXPCR buffer5yL，2mMdNTPs5yL，25mM MgS043 yL，10y]\^3$*FET28aCLl (5, -TCGCGGATCCGAATTCATGGGCTCCATCCCGTCGG-3'）和 RET28aCLl (5, -GTGCGGCCGCAAGCTTTC ACTGCTGAGGGCCGTTAG-3'）各 I. 5 μ L，KOD-Plus-Neol μ L，cDNA2 μ L，ddH20 補足。PCR 程序： 94°C預變性5min ;98°C變性30s，74°C延伸90s，共5個循環(huán)；98°C變性30s，72°C延伸90s， 共5個循環(huán)；98°C變性90s，70°C延伸90s，共5個循環(huán)；98°C變性30s，68°C延伸90s，共20 個循環(huán)；68°C延伸7min，4°C保溫。擴增得到長為1638bp的OsaCLl基因。將該基因通過 In-Fusion的方法克隆到EcoR I和Hind III雙酶切處理的pET-28a(+)中，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 到Transl-Tl菌株，在含有100 μ g/mL的卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)，挑取單克隆進行菌落 PCR，篩選陽性克隆進行測序。結(jié)果表明載體構(gòu)建正確，命名為PET28a0sa4CL (圖2)。
[0065] 實施例50sa4CL蛋白表達及免疫印跡
[0066] 將測序正確的重組質(zhì)粒pET28a0sa4CL轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta (DE3)感受態(tài)細 胞，涂于100 μ g/mL卡那霉素和氯霉素的LB固體平板上篩選，獲得的陽性重組克隆命名為 E. coli [pET28a0sa4CL]。挑取單克隆于含100 μ g/mL卡那霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基 37°C /250rpm，培養(yǎng)至OD值為L 0。取ImL至IOOmL含100 μ g/mL卡那霉素和氯霉素的LB 液體培養(yǎng)基37°C /250rmp擴大培養(yǎng)，至OD值為0. 6時，加入IPTG使其終濃度為0. 3mM，27°C 誘導8h。
[0067] IPTG誘導8h后，取I. 5mL菌體，12, 000rpm/min，離心2min。棄上清，加入裂解液 A(50mM Tris-HCl pH8.0,50mM EDTA，50mM NaCl，5% 甘油，0· ImM DTT)300yL，置冰上超聲 破碎至澄清，于4°C離心機13, OOOg離心15min，即得到粗蛋白。取上清15 μ L，SDS-PAGE電 泳，銀染法檢測蛋白表達。結(jié)果表明，和對照相比，經(jīng)過誘導的重組菌株中產(chǎn)生了一條大小 為59kDa的特異條帶，與理論值符合（圖3)。
[0068] 為進一步確證0sa4CL基因的表達，進行了免疫印跡分析。離心收集 E. coli [pET28a0sa4CL]的菌體，用超聲破碎液進行SDS-PAGE電泳，采用Western blot進 行檢測。所用一抗為抗His-Tag的小鼠（1:5000)單克隆抗體，二抗為山羊抗小鼠IgG (1 : 5000)單克隆抗體。結(jié)果表明，與對照相比，E. coli[pET28a0sa4CL]經(jīng)免疫印跡后，在相應(yīng) 的位置上出現(xiàn)了一條相應(yīng)的雜交帶（圖4)。因此，確認重組的0sa4CL蛋白具有特異的免疫 活性，表明0sa4CL基因在E. coli中得到了表達。
[0069] 實施例60sa4CL的功能鑒定
[0070] 目前文獻報道的不同植物來源的4-香豆酸輔酶A連接酶具有催化對香豆酸、肉桂 酸、阿魏酸、咖啡酸為相應(yīng)硫酯化合物的能力，也有少部分具有催化芥子酸形成芥子酰輔酶 A的能力。本實驗同樣選擇了對香豆酸、肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸以及芥子酸（圖5)5個底物， 按如下體系進行酶促反應(yīng)。酶促體系如下：Tris-HCl (200mM，pH7. 90)1000yL中含20μΜ 底物，2. 5mM ATP，2. 5mM MgCl2,0. 2mM CoA，100μ L粗蛋白（菌體裂解液，約Iml菌液所得)。 30°C孵育15min后（加入CoA開始計時)，加入40 μ L乙酸終止反應(yīng)。12, 000rpm/min離心 2min，取上清過0. 22 μ m的濾膜即為樣品。進25 μ L樣品通過反相HPLC分析，硫酯酶和底 物通過如下液相條件分離(表1 )，香豆酰輔酶Α、阿魏酰輔酶Α、咖啡酰輔酶Α、芥子酰輔酶A 均在320nm處檢測，肉桂酰輔酶A在270nm處檢測（圖6)。
[0071] 表 1
[0072]

【權(quán)利要求】
1. 一種來源于虎眼萬年青的4-香豆酸輔酶A連接酶，其特征在于： a) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列； b) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列經(jīng)替換，缺失或添加1-110個氨基酸形成的具有同等 功能的氨基酸序列。
2. -種編碼權(quán)利要求1所述4-香豆酸輔酶A連接酶的基因序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 一種含有權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述核苷酸序列的表達載體。
5. -種含有權(quán)利要求4所述表達載體的宿主細胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，其宿主細胞包括但不限于大腸桿菌， 釀酒酵母，畢赤酵母，鏈霉菌，植物細胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的4-香豆酸輔酶A連接酶或含有4-香豆酸輔酶A連接酶的細 胞在催化底物對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸為相應(yīng)硫酯化合物中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述4-香豆酸輔酶A連接酶的底物包括 對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述4-香豆酸輔酶A連接酶在催化底物 對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸后，形成的產(chǎn)物分別為對香豆酰輔酶A，咖啡酰輔酶A、 阿魏酰輔酶A和肉桂酰輔酶A。
【文檔編號】C12N15/63GK104212772SQ201310207333
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月29日
【發(fā)明者】孔建強, 陳茜, 王志標, 李麗娜, 王偉, 郭嘉, 程克様 申請人:中國醫(yī)學科學院藥物研究所