專利名稱：一種用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及一種用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是一種新型核酸擴(kuò)增方法，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)在恒溫條件下進(jìn)行特異、敏感和高效的核酸擴(kuò)增，LAMP反應(yīng)需要特異性設(shè)計(jì)2條內(nèi)引物(FIP和BIP)和2條外引物(F3和B3)，靶DNA在60°C 65°C恒溫條件下(如水浴箱內(nèi))保溫約60min，即可完成LAMP核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP最終產(chǎn)物包括大量莖環(huán)狀DNA混合物，由于LAMP擴(kuò)增產(chǎn)生了巨大數(shù)量的DNA產(chǎn)物及焦磷酸根離子，因此焦磷酸根離子與反應(yīng)體系中的鎂離子反應(yīng)會(huì)生成焦磷酸鎂沉淀，故可通過反應(yīng)管內(nèi)副產(chǎn)物的濁度或熒光來對產(chǎn)物進(jìn)行檢測。鈣黃綠素染色原理是:反應(yīng)之初鈣黃綠素與熒光猝滅劑錳離子結(jié)合而不發(fā)生熒光，反應(yīng)管呈橙色；反應(yīng)開始后，生成的焦磷酸根離子更易于與錳離子結(jié)合形成沉淀而釋放出游離的鈣黃綠素，鈣黃綠素與鎂離子結(jié)合發(fā)出綠色熒光，反應(yīng)管呈綠色。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種重要的食源性致病菌,發(fā)病率呈世界性分布。主要來自海產(chǎn)品或鹽腌潰品，常見者為蟹類、烏賊、海蜇、魚、黃泥螺等，其次為蛋品、肉類或蔬菜。臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀，重癥者還會(huì)脫水、休克昏迷，甚至死亡。因此，副溶血弧菌是進(jìn)出口水產(chǎn)品檢測的重要項(xiàng)目。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的 在于提供一種用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒。本發(fā)明目的還在于提供該試劑盒的使用方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:反應(yīng)混合液，所述反應(yīng)混合液包含:濃度為0.2μ M的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示；濃度為0.2μΜ的外引物Β3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；濃度為1.6μΜ的內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:3所示;濃度為1.6 μ M的內(nèi)引物ΒΙΡ，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；濃度為0.8 μ M的環(huán)引物L(fēng)oopF，其核苷酸序列如SEQID NO:5所示；濃度為0.8μ M的環(huán)引物L(fēng)oopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；20mMpH8.8 Tris bufferUOmM KClUOmM NH4S04、0.1 重量％ 的吐溫 20、4 至 8mM MgS04、0.8M 甜菜堿、1.2mM dNTP、0.04 至 0.08mM 的鈣黃綠素、0.4 至 1.6mM 的 MnCl2 和 0.32U/ μ I 的 BstDNA聚合酶；DNA提取試劑Α，所述DNA提取試劑A為25mM NaOH ；DNA提取試劑B，所述DNA提取試劑B為IM pH8.0 Tris-HCl ；陽性對照:副溶血弧菌DNA。
具體而言，本發(fā)明中使用的引物序列如下:外引物F3:5’ -AGCTACTCGAAAGATGATCC-3’B3:5’ -GGTTGTATGAGAAGCGATTG-3’內(nèi)引物FIP: 5’-ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT-3，BIP:5’-ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG-3’環(huán)引物L(fēng)oopF:ACCAGTAGCCGTCAATGLoopB:TTAGATTTGGCGAACGAGA上述引物例如可以由上海生工生物工程有限公司合成。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的試劑盒還包括保護(hù)液，所述保護(hù)液為液體石蠟。更優(yōu)選地，所述MgSO4的濃度為8mM。更優(yōu)選地，所述鈣黃綠素的濃度為0.08mM。更優(yōu)選地，所述MnCl2的濃度為0.4mM。本發(fā)明還提供一種用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒的使用方法，該方法包括下列步驟:1)待測樣品的DNA模版提取:當(dāng)所述待測樣品為食品時(shí)，將所述待測樣品加入用于副溶血弧菌增菌培養(yǎng)的APW培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng),從而得到增菌液；將200 u L的所述增菌液加入1.5mL的離心管中，在7000g下離心2min，吸棄上清液；然后加入100 y L的DNA提取試劑A，混勻，在98°C下加熱IOmin ;接著加入20 y L的DNA提取試劑B，混勻，在7000g下離心2min，上清液即為待檢DNA模版，其中所述DNA提取試劑A為25mM NaOH，所述DNA提取試劑B為IM pH8.0 Tris-HCl ;當(dāng)所述待測樣品為細(xì)菌純培養(yǎng)物時(shí)，挑取純培養(yǎng)加入到含200 ii L無菌去離子水的1.5mL離心管中，在98°C下加熱lOmin，在7000g下離心2min，上清液即為待檢DNA模版；2)提供23 y L的反應(yīng)混合液，所述反應(yīng)混合液包含:濃度為0.2 y M的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；濃度為0.2 ii M的外引物B3，其核苷酸序列如SEQ IDN0:2所示；濃度為1.6 ii M的內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；濃度為1.6 y M的內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；濃度為0.8iiM的環(huán)引物L(fēng)oopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；濃度為0.8 ii M的環(huán)引物L(fēng)oopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6 所示；20mM pH8.8 Tris bufferUOmM KClUOmM NH4S04、0.1 重量％ 的吐溫 20、4 至 8mMMgSO4、0.8M甜菜堿、1.2mM dNTP、0.04 至 0.08mM 的鈣黃綠素、0.4 至 1.6mM 的 MnClJP0.32U/U I的Bst DNA聚合酶；3)使2 y L的所述待檢DNA模版、陽性對照、陰性對照分別和23 y L的所述反應(yīng)混合液在64°C恒溫反應(yīng)60min，其中所述陽性對照為副溶血弧菌DNA，陰性對照為制備DNA模版的空白試劑；以及4)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果:綠色渾濁表示結(jié)果為陽性，橙色澄清表示結(jié)果為陰性。優(yōu)選地，在所述步驟3)的恒溫反應(yīng)之前加入保護(hù)液，所述保護(hù)液為液體石蠟。液體石蠟浮在反應(yīng)液的上面，從而避免反應(yīng)產(chǎn)物從反應(yīng)容器中溢出以造成相互干擾。更優(yōu)選地，所述MgSO4的濃度為8mM。更優(yōu)選地，所述鈣黃綠素的濃度為0.08mM。更優(yōu)選地，所述MnCl2的濃度為0.4mM。常規(guī)的LAMP方法，需要在反應(yīng)結(jié)束后開蓋加入1000 X SYBR Green I熒光染料或Gene Finder染料來顯色，反應(yīng)產(chǎn)物易形成氣溶膠而污染周圍環(huán)境，容易污染環(huán)境而造成假陽性，同時(shí)SYBR Green I熒光染料或Gene Finder染料還會(huì)因?yàn)橐锒垠w而引起假陽性。因此本發(fā)明使用鈣黃綠素染色技術(shù)替代了 SYBR Green I熒光染料和Gene Finder這些染料，在配置LAMP反應(yīng)液時(shí)就可以加入反應(yīng)液中，無需LAMP反應(yīng)后開蓋，并且鈣黃綠素僅在發(fā)生LAMP反應(yīng)時(shí)才顯色，避免了 SYBR Green I熒光染料和Gene Finder染料造成的假陽性問題，具有更好的特異性。與傳統(tǒng)檢測方法相比，本發(fā)明所述的方法檢測用時(shí)短、成本低，結(jié)果可直接判定，不需儀器。本發(fā)明的試劑盒將所有反應(yīng)試劑都合并到同一反應(yīng)液中，使得反應(yīng)步驟更加簡便，試劑盒的結(jié)構(gòu)更為簡單。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施方式
的描述對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在本發(fā)明中，除非特別指明，否則使用的菌株如下:副溶血弧菌(ATCC5421，源自中國⑶C營養(yǎng)與食品安全所)實(shí)施例1本發(fā)明的試劑盒所述試劑盒:包括24個(gè)反應(yīng)管，每管中含有23 y L的反應(yīng)混合液和30 y L的液體石蠟；I管陽性對照(50iiL) ;2管DNA提取試劑A(1300iiL/管)；1管DNA提取試劑B (600 ii L)。所述反應(yīng)混合液包含:濃度為0.2 ii M的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:I所示；濃度為0.2 ii M的外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；濃度為1.6 y M的內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；濃度為1.6 y M的內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；濃度為0.8 ii M的環(huán)引物L(fēng)oopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；濃度為0.8 ii M的環(huán)引物L(fēng)oopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；20mM pH8.8 TrisbufferUOmM KClUOmM NH4S04、0.1 重量％ 的吐溫20、8mM MgS04、0.8M甜菜堿、1.2mM dNTP、
0.08mM的鈣黃綠素、0.4mM的MnCl2和0.32U/ U I的Bst DNA聚合酶。所述DNA提取試劑A為25mM NaOH。所述DNA提取試劑B為IM pH8.0 Tris-HCl。陽性對照:副溶血弧菌DNA。實(shí)施例2本發(fā)明的方法的靈敏度測試APff培養(yǎng)基配制:稱取CM401B 3重量％氯化鈉堿性蛋白胨水培養(yǎng)基(購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司的增菌培養(yǎng)基)9.0g，配置225mL增菌培養(yǎng)基。pH值8.5 ±0.2，121 °C滅菌IOmin,備用。將副溶血弧菌接種到4mL的APW培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)。將40 ii L的過夜培養(yǎng)菌液接種到另外的新的4mL的APW培養(yǎng)基中，在35°C 150rpm下培養(yǎng)4h，獲得中期細(xì)胞。然后用生理鹽水10倍梯度稀釋 法進(jìn)行稀釋，每個(gè)濃度的處理都進(jìn)行三次。選取10_2、10'10_4、10_5、10_6、10_76個(gè)稀釋度的溶液100 u L，涂布在補(bǔ)充2.5重量％氯化鈉的TSA平板(購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)上，在37°C孵化過夜。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果下表1，10_5菌液中副溶血性弧菌濃度平均值為203cfu/100 u L0表I
權(quán)利要求
1.一種用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: 反應(yīng)混合液，所述反應(yīng)混合液包含:濃度為0.2μ M的外引物F3，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示；濃度為0.2μ M的外引物Β3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；濃度為1.6μ M的內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；濃度為1.6 μ M的內(nèi)引物ΒΙΡ，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；濃度為0.8 μ M的環(huán)引物L(fēng)oopF，其核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示；濃度為0.8 μ M的環(huán)引物L(fēng)oopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；20mM ρΗ8.8Tris bufferUOmM KClUOmM NH4S04、0.1 重量％ 的吐溫 20、4 至 8mM MgSO4、0.8M 甜菜堿、1.2mM dNTP、0.04 至 0.08mM 的鈣黃綠素、0.4 至 1.6mM 的 MnCl2 和 0.32U/ μ L 的 Bst DNA 聚合酶； DNA提取試劑Α，所述DNA提取試劑A為25mM NaOH ； DNA提取試劑B，所述DNA提取試劑B為IM pH8.0 Tris-HCl ； 陽性對照:副溶血弧菌DNA。
2.根據(jù)權(quán) 利要求1所述的用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于，還包括保護(hù)液，所述保 護(hù)液為液體石蠟。
3.根據(jù)權(quán) 利要求1或2所述的用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于，所述MgSO4的濃度為8mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于，所述鈣黃綠素的濃度為0.08mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于，所述MnCl2的濃度為0.4mM。
6.一種用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒的使用方法，該方法包括下列步驟: 1)待測樣品的DNA模版提取:當(dāng)所述待測樣品為食品時(shí)，將所述待測樣品加入用于副溶血弧菌增菌培養(yǎng)的APW培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，從而得到增菌液；將200 μ L的所述增菌液加入1.5mL的離心管中，在7000g下離心2min，吸棄上清液；然后加入100 μ L的DNA提取試劑Α，混勻，在98°C下加熱IOmin ;接著加入20 μ L的DNA提取試劑B，混勻，在7000g下離心2min，上清液即為待檢DNA模版，其中所述DNA提取試劑A為25mM NaOH,所述DNA提取試劑B為IM pH8.0 Tris-HCl ;當(dāng)所述待測樣品為細(xì)菌純培養(yǎng)物時(shí)，挑取純培養(yǎng)加入到含.200 μ L無菌去離子水的1.5mL離心管中，在98°C下加熱lOmin，在7000g下離心2min，上清液即為待檢DNA模版； 2)提供23μ L的反應(yīng)混合液，所述反應(yīng)混合液包含:濃度為0.2 μ M的外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；濃度為0.2 μ M的外引物Β3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；濃度為1.6 μ M的內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；濃度為1.6 μ M的內(nèi)引物ΒΙΡ，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；濃度為0.8μ M的環(huán)引物L(fēng)oopF，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；濃度為0.8 μ M的環(huán)引物L(fēng)oopB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；20mM pH8.8 Tris bufferUOmM KClUOmM NH4S04、0.1 重量％ 的吐溫20、4至8mM MgSO4,.0.8M 甜菜堿、1.2mM dNTP、0.04 至 0.08mM 的鈣黃綠素、0.4 至 1.6mM 的 MnCl2 和 0.32U/ μ L的Bst DNA聚合酶； 3)使2μ L的所述待檢DNA模版、陽性對照、陰性對照分別和23 μ L的所述反應(yīng)混合液在64°C恒溫反應(yīng)60min，其中所述陽性對照為副溶血弧菌DNA，陰性對照為制備DNA模版的空白試劑；以及 4)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果:綠色渾濁表示結(jié)果為陽性，橙色澄清表示結(jié)果為陰性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒的使用方法，其特征在于，在所述步驟3)的恒溫反應(yīng)之前加入保護(hù)液，所述保護(hù)液為液體石蠟。
8.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述MgSO4的濃度為8mM。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述鈣黃綠素的濃度為0.08mM。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述MnCl2的濃·度為0.4mM。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測食品中的副溶血弧菌的試劑盒，所述試劑盒包括反應(yīng)混合液，所述反應(yīng)混合液包含濃度均為0.2μM的外引物F3和外引物B3；濃度均為1.6μM的內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP；濃度均為0.8μM的環(huán)引物L(fēng)oopF和環(huán)引物L(fēng)oopB；20mM pH8.8 Tris buffer、10mM KCl、10mM NH4SO4、0.1重量％的吐溫20、4至8mM MgSO4、0.8M甜菜堿、1.2mM dNTP、0.04至0.08mM的鈣黃綠素、0.4至1.6mM的MnCl2和0.32U/μL的Bst DNA聚合酶；DNA提取試劑A；DNA提取試劑B；陽性對照。本發(fā)明還涉及該試劑盒的使用方法。與傳統(tǒng)檢測方法相比，本發(fā)明所述的方法檢測用時(shí)短、成本低，結(jié)果可直接判定，不需儀器。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103243168SQ20131018045
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月16日
發(fā)明者劉鴻君, 王倩, 李力 申請人:匯智泰康生物技術(shù)(北京)有限公司