專利名稱：改進向細菌細胞中導入dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進向細菌宿主細胞中導入DNA的方法。
背景技術(shù)：
II型限制性內(nèi)切核酸酶據(jù)報道是將DNA導入細菌的有效屏障(Briggs等，1994，Applied and Environmental Microbiology60:2006-2010;Accetto等，2005，F(xiàn)EMS Microbiology Letters247:177-183)。已經(jīng)在芽抱桿菌屬中表征了很多 II型限制性內(nèi)切核酸酶，并且已從芽孢桿菌屬菌種分離出很多商業(yè)上可得到的限制性內(nèi)切核酸酶(Roberts,等，2005，Nucleic Acids Research33:230-232)。由于宿主DNA受到相應(yīng)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的修飾，所以宿主DNA受到保護，免受其天然限制性內(nèi)切核酸酶的切割。限制性內(nèi)切核酸酶和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶通常在基因組中彼此相鄰，構(gòu)成限制-修飾(R-M)系統(tǒng)。這些基因在轉(zhuǎn)錄上可以會聚(convergent)、發(fā)散(divergent)或順序方式定向`。雖然限制性內(nèi)切核酸酶彼此之間只有很小的序列相似性(即使有的話)，但已經(jīng)在很多限制性內(nèi)切核酸酶中發(fā)現(xiàn)了有限的氨基酸基序，PD…D/EXK(Pingoud 和 Jeltsch, 2001，Nucleic Acids Research29:3705-3727)。相反，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的幾個通常的基序(Kumar等，1994，Nucleic AcidsResearch22:1-10;Smith 等，1990，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA87:826-830),其允許通過首先鑒定限制性內(nèi)切核酸酶的更同源的相應(yīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶來鑒定限制性內(nèi)切核酸酶。將DNA導入細菌宿主細胞，例如地衣芽孢桿菌，可為低效率的方法，其產(chǎn)生很少的轉(zhuǎn)化體(即使有的話)。本領(lǐng)域中需要將DNA導入細菌宿主細胞的新方法，以改進獲得包含所述DNA的轉(zhuǎn)化體的效率。本發(fā)明涉及將DNA導入細菌宿主細胞的改進的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及選自下組的編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的分離的多核苷酸:(a)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)多核苷酸，其包含與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列；(c)多核苷酸，其在至少中嚴緊性條件下與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143或其全長互補鏈雜交；和(d)多核苷酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸I至381的變體。本發(fā)明還涉及選自下組的分離的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶:(a)多肽，其包含與SEQ IDNO:2的氨基酸I至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由包含與SEQID NO:1的核苷酸I至1143具有至少60%序列同一'丨生的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(c)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(d)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸I至381。本發(fā)明還涉及選自下組的編碼限制性內(nèi)切核酸酶的分離的多核苷酸:(a)多核苷酸，其編碼包含與SEQ ID NO: 4的氨基酸I至337具有至少60%序列同一性的多肽；(b)多核苷酸，其包含與SEQ ID N0:3的核苷酸I至1011具有至少60%序列同一性的核苷酸序列；
(c)多核苷酸，其在至少中嚴緊條件下與SEQ ID NO:3的核苷酸I至1011或其全長互補鏈雜交；和(d)多核苷酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID N0:4的氨基酸I至337的變體。本發(fā)明還涉及選自下組的分離的限制性內(nèi)切核酸酶:(a)多肽，其包含與SEQ IDNO:4的氨基酸I至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由包含與SEQID NO: 3的核苷酸I至1011具有至少60%序列同一'丨生的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(c)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與SEQ ID NO:3的核苷酸I至1011或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(d)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID NO:4的氨基酸I至337。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生細菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括:(a)將DNA導入第一細菌宿主細胞，所述細胞包含編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸，以將DNA甲基化；其中編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸選自下組:(i)多核苷酸，其編碼包含與SEQID N0:2的氨基酸I至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(ii)多核苷酸，其包含與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列；(iii)多核苷酸，其在至少中嚴緊條件下可與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143或其全長互補鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸I至381的變體；和其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有相同的特異性(specificity)。(b)將來自第一細菌宿主細胞的甲基化DNA轉(zhuǎn)移入第二細菌宿主細胞；其中第二細菌宿主細胞包含能降解DNA但不能降解甲基化DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；和(c)分離包含甲基化DNA的第二細菌宿主細胞的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生細菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括:(a)用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA體外甲基化，以產(chǎn)生甲基化DNA ；其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶選自下組:⑴多肽，其包含與SEQ ID N0:2的氨基酸I至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(ii)多肽，其由包含與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143具有至少60%序列 同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼多肽，其由在至少中嚴緊條件下與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(iv)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸I至381 ;和其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有相同的特異性。(b)將甲基化DNA導入細菌宿主細胞，其中細菌宿主細胞包含能降解DNA但不能降解甲基化DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；和(c)分離包含甲基化DNA的細菌宿主細胞轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生細菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括:(a)將DNA導入包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的細菌宿主細胞中，所述多核苷酸是失活的(inactivated)；其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸選自下組:(i)多核苷酸，其編碼包含與SEQ ID NO: 4的氨基酸I至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(ii)多核苷酸，其包含與SEQ ID NO:3的核苷酸I至1011具有至少60%序列同一性的核苷酸序列；(iii)多核苷酸，其在至少中嚴緊條件下與SEQ ID NO:3的核苷酸I至1011或其全長互補鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ IDNO:4的氨基酸I至337的變體。其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQ ID NO:4的氨基酸I至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性；和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多肽的失活防止導入的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導入細 菌宿主細胞前用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化；和(b)分離包含DNA的細菌宿主細胞的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有生物活性的多肽的方法，其包括:(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)包含導入的DNA的細菌宿主細胞，所述DNA編碼所述多肽或與所述多肽的表達有關(guān)；其中在將導入細菌宿主細胞之前，通過選自下組的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化:
(i)多肽，其包含與SEQ ID NO:2的氨基酸I至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(ii)多肽，其由包含與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(iii)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與SEQ ID N0:1的核苷酸I至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(iv)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸I至381 ;其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有相同的特異性；和其中甲基化防止導入的DNA被細菌宿主細胞的限制性內(nèi)切核酸酶消化；和(b)回收所述具有生物活性的多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有生物活性的多肽的方法，其包括:(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)包含導入的DNA的細菌宿主細胞，所述DNA編碼所述具有生物活性的多肽或與所述多肽表達有關(guān)；其中細菌宿主細胞包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸，所述多核苷酸是失活的；其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸選自下組:(i)多核苷酸，其編碼包含與SEQ ID NO:4的氨基酸I至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(ii)多核苷酸，其包含與SEQ ID NO:3的核苷酸I至1011具有至少60%序列同一性的核苷酸序列；(iii)多核苷酸，其在至少中嚴緊條件下與SEQ ID NO:3的核苷酸I至1011或其全長互補鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ IDNO:4的氨基酸I至337的變體。其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQ ID NO:4的氨基酸I至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性；和其中編碼限制性內(nèi)切核酸 酶的多核苷酸的失活防止導入的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導入細菌宿主細胞之前用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化；和(b)回收所述具有生物活性的多肽。本發(fā)明還涉及上述細菌宿主細胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生親本細菌細胞的突變體的方法，其包括:(a)向親本細菌細胞中導入包含核酸構(gòu)建體的DNA，以使親本細菌細胞中編碼多肽的基因失活，這產(chǎn)生與在相同條件下培養(yǎng)時的親本細胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽的突變體細胞；其中細菌宿主細胞包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸，所述多核苷酸是失活的；其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸選自下組:(i)多核苷酸，其編碼包含與SEQ ID NO:4的氨基酸I至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(ii)多核苷酸，其包含與SEQ ID NO:3的核苷酸I至1011具有至少60%序列同一性的核苷酸序列；
(iii)多核苷酸，其在至少中嚴緊條件下與SEQ ID NO:3的核苷酸I至1011或其全長互補鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ IDNO:4的氨基酸I至337的變體。其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQ ID NO:4的氨基酸I至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性；和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活防止導入的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導入親本細菌細胞之前用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化；和(b)分離突變體細胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生親本細菌細胞的突變體的方法，其包括:(a)向親本細菌細胞中導入包含核酸構(gòu)建體的DNA，以使親本細菌細胞中編碼所述多肽的基因失活，這產(chǎn)生與在相同條件下培養(yǎng)時的親本細胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽的突變體細胞；其中在導入細菌宿主細胞之前，用選自下組的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化:(i)多肽，其包含與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；
(ii)多肽，其由包含與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(iii)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(iv)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸I至381。其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有相同的特異性；和其中甲基化防止導入的DNA被親本細菌細胞的限制性內(nèi)切核酸酶消化；和(b)分離突變體細胞。具體地，本發(fā)明涉及以下各項:1.選自下組的分離的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶:(a)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其包含與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少97%序列同一'丨生的氨基酸序列；(b)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其由包含與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少97%序列同一'丨生的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(C)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其由在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴緊條件下，與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(d)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的變體，包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQID NO:2的氨基酸I至381。
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2.項I的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其包含如下或由如下組成:SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381，或其具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的片段。3.項I的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其由包含如下或由如下組成的多核苷酸編碼:SEQ IDN0:1的核苷酸I至1143，或其編碼具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的片段的亞序列。4.項I的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其由包含于大腸桿菌NRRL B-41967中的質(zhì)粒pMDT138所包含的多核苷酸編碼。5.編碼項1-4中任一項的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的分離的多核苷酸。6.包含項5的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或重組表達載體,所述多核苷酸與在表達宿主中指導多肽產(chǎn)生的一個或多個調(diào)控序列可操作連接。7.包含項5的多核苷酸的重組宿主細胞。8.產(chǎn)生DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的方法，其包括:(a)在有益于產(chǎn)生DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的條件下培養(yǎng)項7的重組宿主細胞；和(b)回收所述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。9.選自下組的分離的限制性內(nèi)切核酸酶:(a)多肽，其包含與SEQ ID NO: 4的氨基酸I至337具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少97%序列同一'丨生的氨基酸序列；(b)多肽，其由包含與SEQ ID NO: 3的核苷酸I至1011具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少97%序列同一'丨生的核苷酸序列的多核苷酸編碼；
(c)多肽，其由在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴緊條件下，與SEQ ID NO:3的核苷酸I至1011或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(d)變體，包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID NO:4的氨基酸I 至 337。10.項9的限制性內(nèi)切核酸酶，其包含如下或由如下組成:SEQ ID NO:2的氨基酸I至381，或其具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的片段。11.項9的限制性內(nèi)切核酸酶，其由包含如下或由如下組成的多核苷酸編碼:SEQID N0:1的核苷酸I至1143，或其編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的片段的亞序列。12.項9的限制性內(nèi)切核酸酶，其由包含于大腸桿菌NRRL B-41968中的質(zhì)粒PMDT156包含的多核苷酸編碼。13.編碼項9-12中任一項的限制性內(nèi)切核酸酶的分離的多核苷酸。14.包含項13的多核苷酸的核 酸構(gòu)建體或重組表達載體，其與在表達宿主中指導多肽產(chǎn)生的一個或多個調(diào)控序列可操作連接。15.包含項13的多核苷酸的重組宿主細胞。16.產(chǎn)生限制性內(nèi)切核酸酶的方法，其包括:(a)在有益于產(chǎn)生限制性內(nèi)切核酸酶的條件下培養(yǎng)包含項13的多核苷酸的重組宿主細胞；和(b)回收所述限制性內(nèi)切核酸酶。17.產(chǎn)生細菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括:(a)將DNA導入第一細菌宿主細胞，所述細胞包含項5的編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸，以產(chǎn)生甲基化的DNA ；其中所述DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有相同的特異性；和(b)將來自第一細菌宿主細胞的甲基化DNA轉(zhuǎn)移入第二細菌宿主細胞，其中所述第二細菌宿主細胞包含能降解DNA但不能降解甲基化DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；和(c)分離包含甲基化DNA的第二細菌宿主細胞的轉(zhuǎn)化體。18.通過項17的方法獲得的轉(zhuǎn)化體。19.產(chǎn)生細菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括:(a)用項1-4中任一項的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA體外甲基化，以產(chǎn)生甲基化DNA ；其中所述DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有相同的特異性；(b)將甲基化DNA導入細菌宿主細胞，其中細菌宿主細胞包含能降解DNA但不能降解甲基化DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；和(c)分離包含甲基化DNA的細菌宿主細胞的轉(zhuǎn)化體。20.通過項19的方法獲得的轉(zhuǎn)化體。21.產(chǎn)生細菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括:(a)將DNA導入細菌宿主細胞中，所述細胞包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的項13的多核苷酸，所述多核苷酸是失活的；其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQ ID NO:4的氨基酸I至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性；和
其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活使導入的DNA不被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導入細菌宿主細胞前用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化；和(b)分離包含所述DNA的細菌宿主細胞的轉(zhuǎn)化體。22.通過項21的方法獲得的轉(zhuǎn)化體。23.產(chǎn)生具有生物活性的多肽的方法，其包括:(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細菌宿主細胞，所述細胞包含導入的編碼具有生物活性的多肽或與該多肽表達有關(guān)的DNA ；其中在將DNA導入細菌宿主細胞之前通過項1-4中任一項的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化；其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有相同的特異性，而且對于細菌宿主細胞是天然的或外源的；和其中甲基化防止導入的DNA被所述細菌宿主細胞的限制性內(nèi)切核酸酶消化；和(b)回收所述具有生物活性的多肽。24.產(chǎn)生有生物活性的多肽的方法，其包括:(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細菌宿主細胞，所述細胞包含導入的編碼具有生物活性的多肽或與該多肽表達有關(guān)的DNA ；其中細菌宿主細胞包含項13的編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多肽，所述多肽是失活的； 其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQ ID NO:4的氨基酸I至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性，和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多肽的失活防止導入的DNA被所述限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導入細菌宿主細胞前用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化；和(b)回收所述具有生物活性的多肽。25.產(chǎn)生親本細菌細胞的突變體的方法，其包括:(a)向親本細菌細胞中導入包含核酸構(gòu)建體的DNA，以使親本細菌細胞中編碼多肽的基因失活，這產(chǎn)生與在相同條件下培養(yǎng)時的親本細胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽的突變體細胞；其中在將DNA導入細菌宿主細胞前，通過項1-4中任一項的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化；其中所述DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有相同的特異性；和其中甲基化防止導入的DNA被親本細菌細胞的限制性內(nèi)切核酸酶消化；和(b)分離所述突變體細胞。26.通過項25的方法獲得的突變體細菌細胞。27.項26的突變體細胞，其進一步包含編碼天然或異源蛋白質(zhì)的基因。28.產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括:(a)在有益于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)項27的突變體細胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。29.產(chǎn)生親本細菌細胞的突變體的方法，其包括:(a)向親本細菌細胞中導入包含核酸構(gòu)建體的DNA，以使親本細菌細胞中編碼多肽的基因失活，這產(chǎn)生與在相同條件下培養(yǎng)時的親本細胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽的突變體細胞；其中親本細菌宿主細胞包含項13的編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸，所述多核苷酸是失活的；其中所述限制性內(nèi)切核酸酶與SEQ ID N0:4的氨基酸I至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性；和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活防止導入的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導入親本細菌細胞前用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化；和(b)分離所述突變體細胞。30.通過項29的方法獲得的突變體細菌細胞。31.項30的突變體細胞，其還包含編碼天然或異源蛋白質(zhì)的基因。32.產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括:(a)在有益于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)項31的突變體細胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。
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附圖簡述

圖1A和IB顯示地衣芽孢桿菌M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因組DNA序列和推導的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO:1和2)。圖2A-2B顯示地衣芽孢桿菌Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶的基因組DNA序列和推導的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO:3和4)。圖3A-3C顯示地衣芽孢桿菌Blil904II限制-修飾系統(tǒng)的基因組DNA序列(SEQID N0:5)，其包含編碼Β1Π904ΙΙ限制性內(nèi)切核酸酶和Μ.Β1Π904ΙΙ DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因。Β1 1904ΙΙ限制性內(nèi)切核酸酶編碼區(qū)的反向互補體(reverse complement)用雙下劃線表示，而M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼區(qū)的反向互補體用單下劃線表示。圖4顯示pMDT138的限制圖譜。圖5顯示pKK223-3的限制圖譜。圖6顯示pNBT51的限制圖譜。圖7顯示pNBT52的限制圖譜。圖8顯示pNBT53的限制圖譜。圖9顯示pNBT54的限制圖譜。圖10顯示pNBT35的限制圖譜。圖11顯示pNBT30的限制圖譜。圖12顯示pNBT31的限制圖譜。圖13顯示pNBT36的限制圖譜。圖14顯示pMDTlOO的限制圖譜。圖15顯示pMDT156的限制圖譜。圖16顯示pMDT134的限制圖譜。圖17顯示pMDT131的限制圖譜。圖18顯示pMDT139的限制圖譜。定義Μ.Β1 1904ΙΙ DNA甲基轉(zhuǎn)移酶:術(shù)語“M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)移酶”在本文中定義為DNA (胞卩密卩定-5)-甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA (cytosine-5)-methyltransferase)(E.C.2.1.1.37)，其催化甲基從S-腺苷-L-蛋氨酸轉(zhuǎn)移至序列GCNGC中的DNA上，得到s-腺苷-L-高半胱氨酸和包含5-甲基胞嘧啶的DNA。就本發(fā)明而言，根據(jù)Pfeifer等，1983，Biochim.Biophys.Acta740:323-30所述的步驟測定DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性。一個單位的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性是:在20 μ I的總反應(yīng)體積中在I小時內(nèi)針對相應(yīng)限制性內(nèi)切核酸酶的切割保護I μ g λ DNA所需的量。本發(fā)明的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有下述多肽的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少100%，所述多肽包含如下或由如下組成:如SEQ IDNO:2的氨基酸I至381所示的氨基酸序列。Β1 1904ΙΙ限制性內(nèi)切核酸酶:術(shù)語“Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶”在本文中定義為II型限制性內(nèi)切核酸酶，其催化DNA的位點特異性內(nèi)溶核切割(endonucleolyticcleavage)，以得到特定的雙鏈DNA片段(EC3.1.21.4)。就本發(fā)明而言，根據(jù)已建立的用于II型限制性內(nèi)切核酸酶的步驟(例如，Jeltsch和Pingoud, 2001, Methods Mol.Biol.160:287-308)測定Blil904II限制性內(nèi) 切核酸酶活性。根據(jù)定義，一個單位的限制性內(nèi)切核酸酶活性將在37°C在60分鐘內(nèi)完全消化50 μ I反應(yīng)液中的一 μ g底物DNA。本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶具有下述多肽的限制性內(nèi)切核酸酶活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少100%，所述多肽包含如下或由如下組成:如SEQ ID NO:4的氨基酸I至337所示的氨基酸序列。限制-修飾系統(tǒng):術(shù)語“限制-修飾系統(tǒng)”在本文中定義為限制性內(nèi)切核酸酶，保護DNA免受限制性內(nèi)切核酸酶切割的相應(yīng)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，和編碼這兩個酶的基因。分離的多肽:術(shù)語“分離的多肽”用于本文中指由其來源分離的多肽。在優(yōu)選的方面，所述多肽為至少1%純，至少5%純，更優(yōu)選至少10%，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，和最優(yōu)選至少90%純的，如通過SDS-PAGE測定的?；旧霞兊亩嚯?術(shù)語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物按重量計含有至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純的。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。這能夠通過以下方式實現(xiàn)，例如，通過公知的重組方法或通過經(jīng)典純化方法來制備多肽。同一性:參數(shù)“同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一'I"生程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman 和 Wunsch, 1970，J.Mol.Biol.48:443-453)來測定，如在 EMBOSS 軟件包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，Trendsin Geneticsl6:276-277)的Needle程序中所執(zhí)行的，優(yōu)選使用3.0.0版或以后的版本。使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分(gap open penalty) 10,缺口延伸罰分(gap extensionpenalty) 0.5，和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版)取代矩陣。使用 Needle 標記為“最長同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下:(相同殘基X 100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核苷酸序列之間的序列同一性程度使用Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970,見上文)測定，如 EMBOSS 軟件包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，見上文)的Needle程序所執(zhí)行的，優(yōu)選使用3.0.0版或以后的版本。使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最長同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下:(相同脫氧核糖核苷酸X 100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))多肽片段:術(shù)語“多肽片段”在本文中定義為從SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個氨基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段分別具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶或限制性內(nèi)切核酸酶活性。在優(yōu)選的方面，SEQ ID N0:2或其同源物的片段含有至少320個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少340個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少360個氨基酸殘基。在另一個優(yōu)選的方面，SEQ ID N0:4或其同源物的片段含有至少290個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少305個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少320個氨基酸殘基。亞序列:術(shù)語“亞序列(subsequence) ”在本文中定義為從SEQ ID NO:1或SEQ IDNO: 3的5’和/或3’端缺失一個或多個核苷酸的核苷酸序列，或其同源序列；其中所述亞序列分別編碼具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性或限制性內(nèi)切核酸酶的多肽片段。在優(yōu)選的方面，SEQ ID NO:1或其同源物的亞序列含有至少960個核苷酸，更優(yōu)選至少1020個核苷酸，并且最優(yōu)選至少1080個核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，SEQ ID NO: 3或其同源物的亞序列含有至少870個核苷酸，更優(yōu)選至少915個核苷酸，并且最優(yōu)選至少960個核苷酸。等位變體(allelic vari`ant):術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸:術(shù)語“分離的多核苷酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。在優(yōu)選的方面，所述多核苷酸為至少1%純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純的，如通過瓊脂糖電泳測定的?；旧霞兊亩嗪塑账?術(shù)語“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸按重量計含有至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。核酸構(gòu)建體:術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或?qū)⑵湫揎椧员緛聿淮嬖谟?not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段。當所述核酸構(gòu)建體含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達盒”同義。調(diào)控序列(control sequence):術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為包括表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸所必需的所有組分。各種調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各種調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可具有用于導入特異性限制位點的接頭，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接:術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的合適位置，使得調(diào)控序列指導多肽的編碼序列的表達。編碼序列:當用于本文時術(shù)語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框確定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。表達:術(shù)語“表達”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。

表達載體:術(shù)語“表達載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞:如本文中所使用的術(shù)語“宿主細胞”包括任何細胞類型，所述細胞類型對于使用核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導、接合(conjugation)等是易感的(susceptible)。導入:術(shù)語“導入”及其變化形式在本文定義為將DNA轉(zhuǎn)入細菌細胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域任何已知方法完成向細菌細胞中導入DNA，所述方法包括，但不限于，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導、
接合等。轉(zhuǎn)化:術(shù)語“轉(zhuǎn)化”在本文定義為將純化的DNA導入細菌細胞，使DNA作為染色體整合體或作為自復制的染色體外載體保留。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”通常應(yīng)該理解為包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導、接合等。轉(zhuǎn)染:術(shù)語“轉(zhuǎn)染”在本文定義為用病毒核酸轉(zhuǎn)化細菌細胞。轉(zhuǎn)導:術(shù)語“轉(zhuǎn)導”在本文定義為將來自第一細菌細胞的DNA包裝入病毒顆粒，并通過用病毒顆粒感染第二細胞，將細菌DNA轉(zhuǎn)入第二細菌細胞。接合:術(shù)語“接合”在本文定義為通過細胞與細胞的接觸，將DNA直接從一個細菌細胞轉(zhuǎn)移至另一個細菌細胞。轉(zhuǎn)化體:術(shù)語“轉(zhuǎn)化體”在本文定義為通常涵蓋任何已經(jīng)向其中導入DNA的細菌宿主細胞。因此，術(shù)語“轉(zhuǎn)化體”包括轉(zhuǎn)染體、接合體等。供體細胞:術(shù)語“供體細胞”在本文定義為通過任何方法導入另一個細胞的DNA的來源細胞。受體細胞:術(shù)語“受體細胞”在本文定義為DNA導入的細胞。修飾:術(shù)語“修飾”在本文的意思是，對由SEQ ID NO:2的氨基酸I至381或SEQID N0:4的氨基酸I至337組成的多肽或其同源序列的任何化學修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個)氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體:當用在本文時，術(shù)語“人工變體”的意思是具有限制性內(nèi)切核酸酶或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，所述多肽分別由表達SEQ ID NO:1的核苷酸I至1043或SEQID N0:3的核苷酸I至1011或其同源序列的修飾的多核苷酸序列的生物體產(chǎn)生。所述修飾的多核苷酸序列通過人為干預(yù)(human intervention),通過修飾SEQ ID NO:1或SEQ IDN0:3或其同源序列中公開的核苷酸序列來獲得。發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及產(chǎn)生細菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括:(a)將DNA導入包含編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸的第一細菌宿主細胞，以將DNA甲基化；其中編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸選自下組:(i)多核苷酸，其編碼包含與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(ii)多核苷酸，其包含與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列多核苷酸，其在至少中嚴緊條件下與SEQ IDNO:1的核苷酸I至1143或其全長互補鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸I至381的變體；并且其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO:2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有相同的特異性；(b)將甲基化的DNA從第一細菌宿主細胞轉(zhuǎn)移進第二細菌宿主細胞；其中第二細菌宿主細胞包含能降解DNA但不能降解甲基化DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；和(c)分離包含甲基化DNA的第二細菌宿主細胞的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生細菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括:(a)在體外用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化，以產(chǎn)生甲基化的DNA;其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶選自下組:(i)多肽，其包含與SEQID NO:2的氨基酸I至381具有至少60%序列同一性的氨基酸序列；(ii)多肽，其由包含與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143具有至少60%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；
(iii)多肽，其由在至少中嚴緊條件下與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(iv)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQID NO:2的氨基酸I至381 ;并且其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO:2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有相同的特異性；(b)將甲基化的DNA導入細菌宿主細胞；其中細菌宿主細胞包含能降解DNA但不能降解甲基化DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；和(c)分離包含甲基化DNA的細菌宿主細胞的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生細菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括:(a)將DNA導入包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的細菌宿主細胞，所述多核苷酸是失活的；其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸選自下組:(i)多核苷酸，其編碼包含與SEQ ID NO: 4的氨基酸I至337具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(ii)多核苷酸，其包含與SEQ ID NO:3的核苷酸I至1011具有至少60%序列同一性的核苷酸序列多核苷酸，其在至少中嚴緊條件下與SEQ ID NO:3的核苷酸I至1011或其全長互補鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID NO:4的氨基酸I至337的變體；其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQ ID NO:4的氨基酸I至337的限制性內(nèi)切核酸酶具有相同的特異性，并且其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活防止導入的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導入細菌宿主細胞之前用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化，和(b)分離包含DNA的細菌宿主細胞的轉(zhuǎn)化體。在本發(fā)明的方法中，將DNA導入細菌宿主細胞可以通過下述方式完成:(1)將編碼細菌宿主細胞的限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸失活，使導入的DNA不被限制性內(nèi)切核酸酶降解或(2)在導入細菌宿主細胞之前用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化，使導入的甲基化DNA不被細菌宿主細胞的限制性內(nèi)切核酸酶降解。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶或限制性內(nèi)切核酸酶對于細菌宿主細胞可以是天然的或外源的。在一個方面，可以在體外完成DNA的甲基化。例如，可以回收本發(fā)明的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶并將其用于在S-腺苷-L-甲硫氨酸存在的情況下將DNA甲基化，得到S-腺苷-L-高半胱氨酸和含5-甲基胞嘧啶的DNA。在另一個方面，DNA的甲基化可以在體內(nèi)完成。例如，可通過下述方式完成DNA的甲基化:從細菌宿主細胞(受體細胞)克隆編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸，并在另一個細菌細胞(供體細胞)中表達DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼序列，其中將DNA導入并甲基化，然后將甲基化DNA轉(zhuǎn)移或?qū)霃闹蟹蛛x出DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼序列的細菌宿主細胞(受體細胞)。在另一個方面，編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸可以獲得自不是受體細胞的另一種生物體。在又一個方面，供體宿主細胞可以已經(jīng)包含本發(fā)明編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸或其同源物。將甲基化DNA導入細菌宿主細胞可以通過下述方式完成:由第一細菌細胞轉(zhuǎn)移入第二細菌細胞，即，通過接合，或者從第一細菌細胞分離甲基化DNA，然后將分離的甲基化DNA導入第二細菌細胞，例如，通過轉(zhuǎn)化。與常規(guī)方法相比，本發(fā)明的方法將獲得的轉(zhuǎn)化體數(shù)目增加至至少10倍，優(yōu)選至少100倍，更優(yōu)選至少1000倍，甚至更優(yōu)選至少10，000倍，并且最優(yōu)選至少100，000倍，所述常規(guī)方法不將本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶失活或不用本發(fā)明的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化。限制性內(nèi)切核酸酶基因和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因及它們的酶在第一個方面，本發(fā)明涉及編碼具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多肽包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ ID NO:2的氨基酸I至381具有至少60%，優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性程度，所述多肽具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性(下文中的“同源多肽”或“同源物”)。在優(yōu)選的方面，所述具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ ID NO:2的 氨基酸I至381相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。本發(fā)明的分離的多核苷酸優(yōu)選編碼具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位變體；或其具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQ IDNO: 2的氨基酸I至381，或其等位變體；或其具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的片段。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸I至381。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或其等位變體；或其具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQ ID N0:2的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQ ID N0:2的氨基酸I至381，或其等位變體；或其具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381組成。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的核苷酸序列。在優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列列于SEQ ID N0:1中。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列為包含于大腸桿菌NRRL B-41967中的質(zhì)粒pMDT138所包含的序列。在另一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列是SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143。在另一個更優(yōu)選的方面,核苷酸序列是包含于大腸桿菌NRRL B-41967中的質(zhì)粒pMDT138所包含的SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143。本發(fā)明還包括編碼具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQ ID NO:1。本發(fā)明還涉及SEQ ID NO:1的亞序列，其編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的SEQ ID NO:2的片段。在另一個第一方面，本發(fā)明涉及編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多肽包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ ID N0:4的氨基酸I至337具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更 優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性程度，所述多肽具有限制性內(nèi)切核酸酶活性(在下文中“同源多肽”或“同源物”)。在優(yōu)選的方面，所述具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的同源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ ID N0:4的氨基酸I至337相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。本發(fā)明的分離的多核苷酸優(yōu)選編碼包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列的具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽或其等位變體；或其具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸I至337，或其等位變體；或其具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的片段。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸I至337。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或其等位變體；或其具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQ ID N0:4的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQ ID N0:4的氨基酸I至337，或其等位變體；或其具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQ ID NO:4的氨基酸I至337組成。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽的核苷酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列列于SEQ ID N0:3中。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列為包含于大腸桿菌NRRL B-41968中的質(zhì)粒pMDT156所包含的序列。在另一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列是SEQ ID N0:3的核苷酸I至1011。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列是包含于大腸桿菌NRRL B-41968中的質(zhì)粒pMDT156所包含的SEQ ID NO: 3的核苷酸I至1011。本發(fā)明還包括編碼具有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQ ID NO:3。本發(fā)明還涉及SEQ ID NO:3的亞序列，其編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的SEQ ID N0:4的片段。在第二方面，本發(fā)明涉及編碼具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸在非常低嚴緊條件下，優(yōu)選低嚴緊條件下，更優(yōu)選中嚴緊條件下，更優(yōu)選中-高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選非常高嚴緊條件下，與以下序列雜交:(i)SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143，(ii)⑴的亞序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈(J.Sambrook, E.F.Fritsch,和 T.Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A LaboratoryManual,第 2 版，Cold Spring Harbor, New York)。SEQ ID NO:1 的亞序列含有至少 100 個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽片段。在另一個第二方面，本發(fā)明涉及編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸在非常低嚴緊條件下，優(yōu)選低嚴緊條件下，更優(yōu)選中嚴緊條件下，更優(yōu)選中-高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選非常高嚴緊條件下，與以下序列雜交:(i)SEQ ID NO: 3的核苷酸I至1011, (ii)⑴的亞序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈(J.Sambrook, E.F.Fritsch,和 T.Maniatis, 1989，見上文)。SEQ ID NO: 3的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽片段。SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQ ID NO: 2或SEQID N0:4的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組DNA雜交，以鑒定·和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應(yīng)為至少14，優(yōu)選至少25，更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針長度為至少100個核苷酸。例如，所述核酸探針長度上可以是至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸。甚至可以使用更長的探針，例如，長度是至少600個核苷酸，至少優(yōu)選至少700個核苷酸，更優(yōu)選至少800個核苷酸，或最優(yōu)選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。這些探針包含于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它生物體制備的基因組DNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其它分離技術(shù)分離來自這些其它生物體的基因組DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料用在Sounthern印跡中。
就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列、它的全長互補鏈或其亞序列?？墒褂肵射線片(X-ray film)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其包含編碼SEQ ID NO: 2的多肽的核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQ ID N0:1或其全長互補鏈。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRL B-41967中的質(zhì)粒pMDT138所包含的多核苷酸，其中所述其核苷酸序列編碼具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRL B-41967中的質(zhì)粒pMDT138所包含的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其包含編碼SEQ ID NO: 4的多肽的核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQ ID NO: 3或其全長互補鏈。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRL B-41968中的質(zhì)粒pMDT156所包含的多核苷酸，其中所述其核苷酸序列編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRL B-41968中的質(zhì)粒pMDT156所包含的成熟多肽編碼區(qū)。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴緊條件定義為在42°C，在5X SSPE、0.3%SDS、200 μ g/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴緊性為25%的甲·酰胺、對于中和中-高嚴緊性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍谰o性為50%的甲酰胺,根據(jù)標準的Southern印跡法進行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2X SSC、0.2%SDS優(yōu)選至少在450C (非常低嚴緊性)，更優(yōu)選至少在50°C (低嚴緊性)，更優(yōu)選至少在55°C (中嚴緊性)，更優(yōu)選至少在60°C (中-高嚴緊性)，甚至更優(yōu)選至少在65°C (高嚴緊性)，并且最優(yōu)選至少在70°C (非常高嚴緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴緊條件定義為在比根據(jù) Bolton 和 McCarthy 計算法(1962，Proceedings of the National Academy ofSciences USA48:1390)得出的 T111 低大約 5°C至大約 10°C，在 0.9M NaCl，0.09M Tris-HClpH7.6,6mM EDTA, 0.5%NP_40,1 XDenhardt 溶液，ImM 焦憐酸鈉(sodium pyrophosphate),ImM 憐酸二氧納(sodium monobasic phosphate), 0.1mM ATP 和 0.2mg 每 ml 的酵母 RNA 中，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在
6X SSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6 X SSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度下洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個方面，本發(fā)明涉及編碼人工變體的分離的多核苷酸，所述人工變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4或其同源序列；或其成熟多肽。優(yōu)選氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(of a minor nature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；小缺失，通常缺失I至大約30個氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸(例如多組氨酸區(qū)(polyhistidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或結(jié)合域(binding domain))。保守取代的實例是在以下組之內(nèi):堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specific activity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York 描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。除了 20個基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。“非天然氨基酸”在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上可獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑燒羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脫氫腦氨酸、3_和4_ 甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。可選地，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法,例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells, 1989，Science244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變導入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，限制性內(nèi)切核酸酶或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性 )以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù):如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVos 等，1992，Science255:306-312 ；Smith 等，1992，J.Mol.Biol.224:899-904 ；fflodaver等，1992，F(xiàn)EBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由 Reidhaar-Olson 和 Sauer, 1988，Science241:53-57 ；Bowie 和Sauer, 1989, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2152-2156 ；W095/17413 ;或 W095/22625 公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991, Biochem.30:10832-10837 ;美國專利號 5，223，409 ；W092/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire 等，1986，Gene46:145 ；Ner等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999, Nature Biotechnologyl7:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標準方法快速測序。這些方法允許快速確定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選I。SEQ ID N0:4的氨基酸I至337的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選I。本發(fā)明還涉及選自下組的分離 的甲基轉(zhuǎn)移酶:(a)多肽，其包含與SEQ ID N0:2的氨基酸I至381具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由包含與SEQ IDNO:1的核苷酸I至1143具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(c)多肽，其由在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴緊條件下，與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(d)變體，包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸I至381。本發(fā)明還涉及選自下組的分離的限制性內(nèi)切核酸酶:(a)多肽，其包含與SEQ IDNO:4的氨基酸I至337具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由包含與SEQ ID NO: 3的核苷酸I至1011具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(c)多肽，其由在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴緊條件下，與SEQ ID NO:3的核苷酸I至1011或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(d)變體，包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID NO:4的氨基酸I 至 337。 限制性內(nèi)切核酸酶基因的失活在本發(fā)明的方法中，可以通過將限制性內(nèi)切核酸酶編碼多肽失活而完成DNA向細菌宿主細胞的導入，所述多肽對于細菌宿主細胞是天然或外源的，從而導入的DNA不被限制性內(nèi)切核酸酶降解。多核苷酸可以是限制-修飾系統(tǒng)的組分?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的方法，例如基因的插入、破壞、置換或缺失，完成細菌宿主細胞中本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶基因或其同源物的失活。待失活的基因部分可以是，例如，編碼區(qū)或表達編碼區(qū)所需的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實例可以是啟動子序列或其功能部分，即，足以影響核苷酸序列表達的部分。用于可能的修飾的其他調(diào)控序列包括，但不限于，前導序列、前肽序列、信號序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子。通過基因缺失技術(shù)消除或減少基因的表達，可以實現(xiàn)將本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶基因的失活?；蛉笔Ъ夹g(shù)能部分或全部去除基因，從而消除其表達。在這樣的方法中，可以使用經(jīng)過構(gòu)建連續(xù)包含基因側(cè)翼的5’和3’區(qū)的質(zhì)粒，通過同源重組完成基因的缺失?？梢詫⑦B續(xù)的5’和3’區(qū)導入細菌細胞，例如，在溫度敏感質(zhì)粒上，如pE194，其在許可的溫度與選擇性標記結(jié)合以允許質(zhì)粒在細胞中建立。然后將細胞轉(zhuǎn)移至不許可的溫度，以選擇質(zhì)粒整合入染色體在同源側(cè)翼區(qū)之一的細胞。通過選擇選擇性標記而選擇質(zhì)粒的整合。整合后，通過將細胞轉(zhuǎn)移至許可溫度培養(yǎng)幾代而不進行選擇來刺激在第二同源側(cè)翼區(qū)的重組事件。涂布細胞以獲得單菌落，檢查菌落中選擇性標記的丟失(參見，例如，Perego, 1993，于 A.L.Sonneshein,J.A.Hoch,和 R.Losick 編,Bacillus subtilis and OtherGram-Positive Bacteria,第 42 章，American Society of Microbiology, Washington, D.C.)。也可通過在本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶基因或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所必需的調(diào)控元件中導入、取代，或去除一個或多個核苷酸來完成所述基因的失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導致終止密碼子的導入，起始密碼子的去除，或開放閱讀框的移碼(frame-shift)?？砂凑毡绢I(lǐng)域已知的方法通過定位誘變或PCR產(chǎn)生的誘變來完成這種修飾或失活。參見，例如，Botstein和Shortle, 1985, Science229:1193-1201;Lo 等,1984, Proceedings of the National Academy of SciencesUSA81:2285-2289;Higuchi 等，1988，Nucleic Acids Researchl6:7351-7367 ; Shimada, 1996，Meth.Mo 1.Biol.57:157-165;Ho 等，1989，Gene77:51-59;Horton等,1989, Gene77:61-68;及 Sarkar 和 Sommer, 1990, BioTechniques8:404-407。也可通過將本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶基因插入包含與該基因同源的核酸片段的整合型質(zhì)粒，產(chǎn)生同源區(qū)的復制序列并且在復制區(qū)之間并入載體DNA，從而通過基因破壞技術(shù)來完成所述基因的失活。如果插入載體將基因的啟動子與編碼區(qū)相分開或者阻斷編碼序列從而得到無功能基因產(chǎn)物，這樣的基因破壞就能夠消除基因表達。破壞構(gòu)建體可以僅為伴有與基因同源的5’和3’區(qū)的選擇性標記基因。選擇性標記使得能夠鑒定包含破壞基因的轉(zhuǎn)化體。也可通過基因轉(zhuǎn)換(gene conversion)的方法，完成本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶的失活(參見，例如，Iglesias 和 Trautner, 1983, Molecular GeneralGeneticsl89:73-76)。例如， 在基因轉(zhuǎn)換方法中，將相應(yīng)于基因的核苷酸序列在體外誘變以產(chǎn)生缺陷性核苷酸序列，隨后將其轉(zhuǎn)化入親本細菌細胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核苷酸序列替代了所述基因。理想的是所述缺陷基因或基因片段還編碼標記，其可用于選擇包含缺陷基因的轉(zhuǎn)化體。例如，可以將缺陷基因?qū)肱c選擇性標記有關(guān)的非復制的或溫度敏感型質(zhì)粒。通過在不允許質(zhì)粒復制的條件下對標記進行選擇而選擇質(zhì)粒的整合。通過檢查菌落中選擇性標記的丟失和突變基因的獲得，來選擇導致基因替換的第二次重組事件(參見，例如，Perego，1993，見上文)?；蛘?，缺陷性核酸序列可以包含基因的一個或多個核苷酸的插入、取代或缺失，如下所述。也可以使用與本發(fā)明限制性內(nèi)切核酸酶基因的核苷酸序列互補的核苷酸序列通過確定的反義技術(shù)來完成所述基因的失活(Parish和Stoker, 1997，F(xiàn)EMS MicrobiologyLettersl54:151-157)。更具體地,可通過導入與所述基因的核苷酸序列互補的核苷酸序列來減少或消除細菌細胞的基因表達，所述互補的核苷酸序列可以在細胞中轉(zhuǎn)錄并且能夠與細胞中產(chǎn)生的mRNA雜交。在允許所述互補反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，由此減少或消除翻譯的蛋白質(zhì)的量。也可以通過RNA干擾技術(shù)完成失活(參見，例如，美國專利6，506，559)。可以使用本領(lǐng)域公知的方法，通過隨機或特異性誘變，進一步完成本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶基因的失活，所述方法包括，但不限于，化學誘變(參見，例如，Hopwood, TheIsolation of Mutants in Methods in Microbiology(J.R.Norris 和 D.W.Ribbons編)363-433 頁,Academic Press, New York, 1970)和轉(zhuǎn)座(參見，例如，Youngman等，1983，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:2305-2309)。可以通過向親本細胞施以誘變，并且選擇其中已將所述基因的表達減少或消除的突變體細胞來進行基因的修飾。誘變可為特異性的或隨機的，可以例如通過如下方式進行:使用合適的物理或化學誘變劑，使用合適的寡核苷酸，或?qū)⑺鯠NA序列進行PCR產(chǎn)生的誘變。此外,可以通過使用這些誘變方法的任何組合來進行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、N-甲基-N’ -亞硝基胍(NTG)、0_甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲燒磺酸酯(ethyl methane sulphonate) (EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當使用這些試劑時，通常通過如下方式來進行所述誘變:在合適條件下存在優(yōu)選的誘變劑時溫育待誘變的親本細胞，并選擇顯示基因表達減少的或無基因表達的突變體細胞。在優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞中限制性內(nèi)切核酸酶的失活未用選擇性標記進行標記。可通過在反-選擇(counter-selection)培養(yǎng)基中培育突變體,來去除選擇性標記基因。其中選擇性標記包含其5’和3’末端側(cè)翼的重復序列，所述重復序列將在對突變體細胞進行反-選擇時，通過同源重組促進選擇性標記基因的出環(huán)(loop out)。通過向突變體細胞導入包含缺陷基因的5’和3’區(qū)但缺少選擇性標記基因的核酸片段，然后在反-選擇培養(yǎng)基上選擇，從而通過同源重組去除選擇性標記基因。通過同源重組，用缺少選擇性標記基因的核酸片段替代包含選擇性標記基因的缺陷基因。也可以使用本領(lǐng)域其他已知方法。核酸構(gòu)建體 可以用許多方式操作編碼本發(fā)明目的多肽，例如具有生物活性的多肽，或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶或限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸以用于多核苷酸在合適的細菌宿主細胞中的表達，例如使目的DNA甲基化或用于產(chǎn)生和回收DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，使其能用于體外甲基化。依賴于核酸構(gòu)建體或載體或細菌宿主細胞，在將多核苷酸的核苷酸序列插入核酸構(gòu)建體或載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用克隆方法修飾核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。包含編碼目的多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體與一個或多個調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在細菌宿主細胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導編碼序列的表達。每個調(diào)控序列對于編碼目的多肽的核苷酸序列可以是天然或外源的。這樣的調(diào)控序列包括，但不限于，前導序列、啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以提供有用于導入特異性限制位點的接頭，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接。調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列，其是由用于表達核苷酸序列的細菌宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導目的多肽表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選細菌宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，并可獲得自指導與細菌宿主細胞同源或異源的具有生物活性的胞外或胞內(nèi)多肽的合成的基因。用于指導本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在細菌細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子:大腸桿菌Iac操縱子、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α -淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α -淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β_ 內(nèi)酸胺酶基因(Villa-Kamaroff 等，1978，Proceedings of the National Academyof Sciences USA75:3727-3731),以及 tac 啟動子(DeBoer 等，1983，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA80:21-25)。另外的啟動子在〃Useful proteins fromrecombinant bacteria"于 Scientific American, 1980, 242:74-94 中；和 J.Sambrook, E.F.Fritsch,和 T.Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2版，ColdSpring Harbor, New York 中描述。調(diào)控序列也 可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列的3’末端可操作地連接。在所選細菌宿主細胞中有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明中。調(diào)控序列還可以是合適的前導序列，其是對于細菌細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列可操作地連接于指導具有生物活性的多肽合成的核苷酸序列的5’ -末端。在所選細菌宿主細胞中有功能的任何前導序列都可用于本發(fā)明中。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，其可指導表達的多肽進入細胞的分泌途徑。信號肽編碼區(qū)對于所述多肽可為天然的或可從外部來源獲得。核苷酸序列的編碼序列的5’端可固有地包含信號肽編碼區(qū)，其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。可選地，編碼序列5’端可含有信號肽編碼區(qū)，其對于所述編碼序列的部分來說是外源的且編碼分泌的多肽。外源信號肽編碼區(qū)在編碼序列不通常地含有信號肽編碼區(qū)時可能是必需的?；蛘?，相對于與編碼序列正常結(jié)合的天然信號肽編碼區(qū)，外源信號肽編碼區(qū)可以簡單地取代天然信號肽編碼區(qū)以獲得增強的多肽分泌。信號肽編碼去可以獲得自芽孢桿菌菌屬菌種的淀粉酶或蛋白酶基因。然而，指導表達的多肽進入所選細菌宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)可用于本發(fā)明中。對于細菌細胞例如芽孢桿菌屬細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下獲得的信號肽編碼區(qū):芽孢桿菌屬NCIBl 1837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶(subtilisin)基因、地衣芽孢桿菌內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT, nprS, nprM)和枯草芽孢桿菌prsA基因。另外的信號肽由Simonen 和 Palva, 1993, Microbiological Reviews57:109-137 描述。調(diào)控序列還可以是mRNA穩(wěn)定序列。術(shù)語“mRNA穩(wěn)定序列”在本文中定義為位于啟動子區(qū)下游和多核苷酸的編碼序列上游的序列，啟動子區(qū)與其可操作地連接，使由啟動子區(qū)合成的所有mRNA可以被加工以產(chǎn)生mRNA轉(zhuǎn)錄子，其5’末端具有穩(wěn)定子序列。在mRNA轉(zhuǎn)錄子的5’末端存在這樣的穩(wěn)定子序列增加了它們的半衰期(Agaisse和Lereclus, 1994，見上文，Hue 等，1995，Journal of Bacteriologyl77:3465-3471)。mRNA 加工 / 穩(wěn)定序列與細菌16S核糖體RNA的3’末端互補。在優(yōu)選的方面，mRNA加工/穩(wěn)定序列產(chǎn)生基本單一長度的轉(zhuǎn)錄子，其5’末端有穩(wěn)定序列。mRNA加工/穩(wěn)定序列優(yōu)選為與細菌16S核糖體RNA的3’末端互補的序列。參見美國專利6，255，076和5，955，310。對于細菌細胞有效的mRNA加工/穩(wěn)定序列是W094/25612中公開的蘇云金芽孢桿菌cryIIIA mRNA加工/穩(wěn)定序列，或其部分，所述序列保持mRNA加工/穩(wěn)定功能，或Hue等，1995, Journal of Bacteriologyl77:3465-3471 中公開的枯草芽抱桿菌 SP82mRNA 加工/穩(wěn)定序列，或其部分，所述序列保持mRNA加工/穩(wěn)定功能。然后可以使用本領(lǐng)域已知的方法或本文所述用于表達目的多肽的那些方法將核酸構(gòu)建體導入細菌宿主細胞。重組表達載體在本發(fā)明的方法中，可以使用重組表達載體來重組產(chǎn)生多肽，所述重組表達載體包含編碼目的多肽(例如，具有生物活性的多肽，或本發(fā)明的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶或限制性內(nèi)切核酸酶)的多核苷酸，啟動子，和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。上述各種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達載體，所述載體可以包括一個或多個方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代指導目的多肽合成的核苷酸序列?？蛇x地，可通過將包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體插入合適的用于表達的載體中來表達核苷酸序列。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，使得該編碼序列與用于表達和可能的分泌的合適的調(diào)控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將導入該載體的細菌細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的手段(means)?；蛘?，載體可以是一種當被導入細菌細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。載體系統(tǒng)可以是單獨的載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多的載體或質(zhì)粒，其共同含有待導入芽孢桿菌屬細胞基因組的完整DNA (total DNA)，或者轉(zhuǎn)座子(transposon)。當導入細菌細胞時，載體可以整合入細菌細胞基因組。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴于編碼目的多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)該優(yōu)選含有足夠數(shù)目的核酸，如100至10，000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對，其與相應(yīng)的目標序列具有高度序列同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可通過非同源重組將載體整合入宿主細胞基因組中。為了自主復制，載體可以進一步包含復制起點，其使載體能夠在所述的細菌細胞中自主地復制。細菌復制起點的實例是允許在大腸桿菌中復制的質(zhì)粒PBR322、pUC19、PACYC17 7和pACYC 184的復制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復制的質(zhì)粒pUB 110、pE 194、PTA1060和ρΑΜβ I的復制起點。復制起點可以是具有突變使其在細菌細胞中的功能對溫度敏感的復制起點(參見，例如 ，Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy ofSciences USA75:1433-1436)?？梢詫⒍嘤谝粋€拷貝的指導目的多肽合成的核苷酸序列導入細菌細胞以增強核苷酸序列的表達。核苷酸序列的穩(wěn)定擴增可通過如下方式獲得:使用本領(lǐng)域公知的方法將至少一個額外拷貝的序列整合入細菌細胞基因組并選擇轉(zhuǎn)化體。W094/14968中描述了用于實現(xiàn)基因組DNA序列擴增的方便的方法。載體優(yōu)選地含有一個或多個選擇性標記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞。選擇性標記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophy to auxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。此外，可以通過共轉(zhuǎn)化完成選擇，例如，如W091/09129中所述，其中選擇性標記在單獨的載體上。用于連接上述元件以構(gòu)建重組表達載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。將DNA導入芽孢桿菌屬細胞可，例如，通過如下實現(xiàn):原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang 和 Cohen, 1979，Molecular General Geneticsl68:111-115),使用感受態(tài)細胞(參見，例如，Young 和 Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology81:823-829 或 Dubnau 和Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology56:209-221),電穿孔(參見,例如，Shigekawa 和 Dowe r, 1988，Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler 和Thorne, 1987, Journal of Bacteriologyl69:5771-5278)。將 DNA 導入大腸桿菌細胞可，例如，通過如下實現(xiàn):原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan, 1983, J.Mol.Biol.166:557-580)，或電穿孔(參見，例如，Dower 等,1988, Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。將 DNA導入鏈霉菌屬細胞可，例如，通過如下實現(xiàn):原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004, Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見,例如,Mazodier 等，1989, J.Bacteriol.171:3583-3585),或轉(zhuǎn)導(參見，例如，Burke 等,2001, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98:6289-6294)。將DNA導入假單胞菌屬細胞可，例如，通過如下實現(xiàn):電穿孔(參見，例如，Choi 等，2006, J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo 和 Smets, 2005, Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。將 DNA 導入鏈球菌屬細胞可，例如，通過如下實現(xiàn):天然感受態(tài)(參見，例如，Perry和Kuramitsu, 1981, Infect.1mmun.32:1295-1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt 和 Jollick, 1991，Microbios.68:189-207)，電穿孑L (參見，例如，Buckley 等,1999, Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell, 1981，Microbiol.Rev.45:409-436)。然而,可以使用已知用于將DNA導入宿主細胞的任何方法。細菌宿主細胞本發(fā)明還涉及包含核酸構(gòu)建體或重組表達載體的細菌宿主細胞，所述核酸構(gòu)建體或重組表達載體包含編碼目的多肽的多核苷酸，所述目的多肽為，例如，具有生物活性的多肽，或本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明還涉及包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的細菌宿主細胞，所述多核苷酸是失活的；其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸選自下組:(a)多核苷酸，其編碼包含與SEQ ID NO: 4的氨基酸I至337具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(b)多核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 3的核苷酸I至1011具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性的核苷酸序列；和(c)多核苷酸，其在至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴緊條件下，與SEQ ID NO: 3的核苷酸I至1011或其全長互補鏈雜交；其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQ ID NO:4的氨基酸I至337的限制性內(nèi)切核酸酶具有相同的特異性；和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活防止導入細菌宿主細胞的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在導入宿主細胞之前用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化。本發(fā)明還涉及包含核酸構(gòu)建體或重組表達載體的細菌宿主細胞，所述核酸構(gòu)建體或重組表達載體包含編碼具有生物活性的多肽或與所述多肽表達有關(guān)的DNA，其中包含DNA的細菌宿主細胞通過本文所述的用于將DNA導入這種宿主細胞的方法之一獲得。細菌宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌，所述細菌包含限制-修飾系統(tǒng)，如本文所述。革蘭氏陽性細菌包括，但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽抱桿菌屬(Geobacillus)和Oceanobacillus屬。革蘭氏陰性細菌包括，但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)和服原體屬(Ureaplasma)。在本發(fā)明的方法 中，細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本發(fā)明的應(yīng)用中有用的芽孢桿菌屬細胞包括，但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。在優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌細胞。在另外的更優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另外的更優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另外的更優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。在本發(fā)明的方法中，細菌宿主細胞可以是任何鏈球菌屬細胞。在本發(fā)明的實踐中有用的鏈球菌屬細胞包括，但不限于，似馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcus uberi)和馬鏈球菌獸痕亞種(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)。在優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。在本發(fā)明的方法中，細菌宿主細胞可以是任何鏈霉菌屬細胞。在本發(fā)明的實踐中有用的鏈球菌屬細胞包括，但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)和淺青紫鏈霉菌(Streptomyces Iividans)。在優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是除蟲鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是天藍色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是灰色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選方面，細菌宿主細胞是淺青紫鏈霉菌細胞。在本發(fā)明涉及用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將目的DNA甲基化的方法中，用于甲基化的細菌細胞將可能與最終的宿主細菌細胞不同。用于甲基化的細菌細胞可以是細菌細胞，其中已導入對細胞是外源的本發(fā)明的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因，或是細菌細胞，其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)毎翘烊坏?。在本發(fā)明另外的方面，細菌宿主細胞可以額外包含修飾，例如，其他基因的缺失或破壞，所述基因可能對目的多肽的生產(chǎn)、回收或應(yīng)用有害。在優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是蛋白酶缺陷型細胞。在更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞，例如芽孢桿菌屬細胞，包含aprE和nprE的破壞或缺失。在另一個優(yōu)選方面，細菌宿主細胞不產(chǎn)生孢子。在另一個更優(yōu)選方面，細菌宿主細胞，例如，芽孢桿菌屬細胞，包含spoIIAC的破壞或缺失。在另一個優(yōu)選方面，細菌宿主細胞，例如，芽孢桿菌屬細胞，包含與表面活性素(surfactin)的生物合成有關(guān)的基因之一的破壞或缺失，例如srfA、srfB、srfC和srfD。參見，例如，美國專利N0.5，958，728。其他基因，例如，amyE基因，其對目的多肽的產(chǎn)生、回收或應(yīng)用有害，也可以破壞或缺失。DNA在本發(fā)明的方法中，導入細菌宿主細胞的DNA可以是任何目的DNA。DNA對于目的細菌宿主細胞可以是天然的或異源(外源)的。DNA可以編碼具有目的生物活性的任何多肽。多肽對于目的細菌宿主細胞可以是天然的或異源(外源)的。術(shù)語“異源多肽”在本文中定義為對宿主細胞不是天然的多肽；天然多肽，其中進行了結(jié)構(gòu)修飾，例如，缺失、取代和/或插入，以使天然多肽改變；或作為通過重組DNA技術(shù)對編碼多肽的DNA操作的結(jié)果，例如更強的啟動子，而其表達在量上改變的天然多肽。多肽可以是下述多肽和雜合多肽的天然存在的等位變體和工程改造的變體。術(shù)語“多肽”在本文并不指特定長度的編碼產(chǎn)物，因此，包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語“多肽”還包括雜合多肽，其包含獲得自至少兩個不同多肽的部分或全部多肽序列的組合，其中一個或多個多肽可以對真菌細胞是異源的。多肽進一步包括多肽的天然存在的等位變體和工程改造的變體。在優(yōu)選的方面，多肽是抗體、抗原、抗微生物肽、酶、生長因子、激素、immunodi Iator、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報告蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子。 在更優(yōu)選的方面，多肽是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或連接酶。在最優(yōu)選的方面，多肽是α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)式糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖腦苷脂酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、月旨肪酶、甘露糖苷酶、變構(gòu)酶、氧化酶、果膠酸分解酶、過氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。在另一個優(yōu)選方面，多肽是白蛋白、膠原、原彈性蛋白、彈性蛋白或明膠。在另一個優(yōu)選方面，多肽是雜合多肽，其包含獲得自至少兩個不同多肽的部分或完整多肽序列的組合，其中一個或多個多肽對于細菌宿主細胞可以是異源的。在另一個優(yōu)選的方面，多肽是融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼一種多肽的核苷酸序列(或其部分)與編碼另一種多肽的核苷酸序列(或其部分)融合而產(chǎn)生融合多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，且包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。編碼目的多肽的DNA可以獲得自任何原核、真核或其他來源。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”，意思是多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的基因的細胞產(chǎn)生。用于分離或克隆編碼目的多肽的DNA的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆目的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR ProtocolsiA Guideto Methods and Application, Academic Press, New York?？寺〔襟E可以涉及包含編碼多肽的核酸序列的期望核酸片段的切除與分離，向載體分子中插入片段，和將重組載體并入突變真菌細胞，其中將復制多個拷貝或克隆的核酸序列。DNA可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任意組合?？梢杂迷S多方式操作編碼目的多肽的DNA以提供DNA在合適的細菌宿主細胞中的表達。核酸構(gòu)建體和用于編碼目的多肽的DNA的重組表達載體的構(gòu)建可以如本文在本發(fā)明的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達中所述進行。
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DNA還可以是調(diào)控序列，例如，啟動子，用于操作目的基因的表達。調(diào)控序列的非限定性實例在本文中描述。DNA可以進一步是用于將細菌細胞中目的基因失活的核酸構(gòu)建體。DNA不限定于上述公開的具體實例的范圍，因為這些實例意欲作為本發(fā)明幾個方面的說明。產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有生物活性的多肽的方法，其包括:(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細菌宿主細胞，所述細胞包含導入的編碼具有生物活性多肽或與所述多肽表達有關(guān)的DNA ；其中在導入宿主細胞之前用選自下組的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化:(i)多肽，其包含與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性的氨基酸序列；
(ii)多肽，其由包含與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(iii)多肽，其由在至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴緊條件下，與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(iv)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQID NO:2的氨基酸I至381。其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有相同的特異性，并且對于細菌宿主細胞是天然的；和其中甲基化防止導入的DNA被細菌宿主細胞的限制性內(nèi)切核酸酶消化；和(b)回收所述具有生物活性的多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有生物活性的多肽的方法，其包括:(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細菌宿主細胞，所述細胞包含導入的編碼具有生物活性多肽或與所述多肽表達有關(guān)的DNA ；其中細菌宿主細胞包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸，所述多核苷酸是失活的；其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸選自下組:(i)多核苷酸，其編碼包含與SEQ ID NO: 4的氨基酸I至337具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性的氨基酸序列的多肽；(ii)多核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 3的核苷酸I至1011具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性的核苷酸序列；和(iii)多核苷酸，其在至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴緊條件下，與 SEQ ID NO:3的核苷酸I至1011或其全長互補鏈雜交；其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQ ID NO:4的氨基酸I至337的限制性內(nèi)切核酸酶具有相同的特異性；和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活防止導入的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導入細菌宿主細胞之前用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化；和(b)回收所述具有生物活性的多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽的方法，其包括:(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細菌宿主細胞，其中所述宿主細胞包含本發(fā)明的編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的方法，包括:(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細菌宿主細胞，其中所述宿主細胞包含本發(fā)明的編碼具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于產(chǎn)生目的多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌宿主細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離目的多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公布的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。分泌的目的多肽能夠從培養(yǎng)基中直接回收。可以使用本領(lǐng)域已知的對于目的多肽是特異性的方法來檢測所述多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、高效液相色譜、毛細管電泳、酶產(chǎn)物的形成、酶底物的消失或SDS-PAGE。例如,酶試驗(enzyme assay)可用于測定酶的活性。對于很多酶，用于測定酶活性的方法在本領(lǐng)域中已知(參見，例如，D.Schomburg和M.Salzmann(編)，EnzymeHandbook, Springer-Verlag, New York, 1990)。用于測定本發(fā)明的限制性內(nèi)切核酸酶或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的試驗在本文描述。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，目的多肽可以通過常規(guī)方法從培養(yǎng)基中分離，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。然后分離的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法進一步純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)或提取(參見,例如,ProteinPurification, J.-C.Janson 和 Lars Ryden 編，VCH Publishers, New York, 1989)?；虻氖Щ畋景l(fā)明還涉及產(chǎn)生親本細菌細胞突變體的方法，其包括(a)將包含核酸構(gòu)建體的DNA導入親本細菌細胞，使親本細菌細胞中編碼多肽的基因失活，這產(chǎn)生與在相同條件下培養(yǎng)時的親本細胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽的突變體細胞；其中細菌宿主細胞包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸，所述多核苷酸是失活的，并且編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸選自下組:(i)多核苷酸，其編碼包含與SEQ ID N0:4的氨基酸I至337具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少6·5%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性的氨基酸序列的多肽；(ii)多核苷酸，其包含與SEQ ID N0:3的核苷酸I至1011具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性的核苷酸序列；和(iii)多核苷酸，其在至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴緊條件下，與SEQ ID N0:3的核苷酸I至1011或其全長互補鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼變體，所述變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID N0:4的氨基酸I至337 ;其中限制性內(nèi)切核酸酶具有與SEQ ID N0:4的氨基酸I至337的限制性內(nèi)切核酸酶相同的特異性，并且其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活防止導入的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導入親本細菌細胞之前用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化；和(b)分離突變體細胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生親本細菌細胞突變體的方法，其包括(a)將包含核酸構(gòu)建體的DNA導入親本細菌細胞，使親本細菌細胞中編碼多肽的基因失活，這產(chǎn)生與在相同條件下培養(yǎng)時的親本細胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽的突變體細胞；其中在導入細菌宿主細胞之前通過選自下組的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化:(i)多肽，其包含與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性的氨基酸序列；(ii)多肽，其由包含與SEQID NO:1的核苷酸I至1143具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(iii)多肽，其由在至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴緊條件下，與SEQ ID NO:1的核苷酸I至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和(iv)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ ID NO:2的氨基酸I至381 ;其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有與SEQ ID NO:2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相同的特異性，并且其中甲基化防止導入的DNA被親本細菌細胞的限制性內(nèi)切核酸酶消化；和(b)分離突變體細胞。可以使用本文所述方法構(gòu)建包含失活基因的突變體細胞。這樣構(gòu)建的細菌突變體細胞作為用于表達對細胞天然或外源的多肽的宿主細胞特別有用。因此，本發(fā)明進一步涉及產(chǎn)生天然或外源多肽的方法，其包括:(a)在有益于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)突變體細胞；和(b)回收所述多肽。術(shù)語“外源多肽”在本文定義為對于宿主細胞不是天然的多肽，其中經(jīng)過修飾以改變天然序列的天然蛋白質(zhì)，或作為通過重組DNA技術(shù)對宿主細胞操作的結(jié)果其表達在量上發(fā)生改變的天然蛋白質(zhì)。能在這樣的突變體中表達的多肽的實例在本文描述。用于培養(yǎng)和純化目的產(chǎn)物的方法可以通過本領(lǐng)域已知和本文所述的方法進行。通過下述實施例進一步描述本發(fā)明，但不應(yīng)將下述實施例理解為對本發(fā)明范圍的限制。
實施例DNA 測序·使用Applied Biosystems Model3130X Genetic Analyzer (3130X 型遺傳分析儀)(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA),利用染料終止子化學(Giesecke等，1992，Journal of Virol.Methods38:47-60)進行 DNA 測序。使用 phred/phrap/consed(University of Washington, Seattle, WA, USA)用測序特定引物組裝序列。菌株在枯草芽孢桿菌168Λ4中構(gòu)建芽孢桿菌屬質(zhì)粒。枯草芽孢桿菌168 Λ 4源自枯草芽抱桿菌模式菌株(type strain) 168 (BGSC1A1, Bacillus Genetic Stock Center (芽孢桿菌屬遺傳保藏中心)，Columbus, OH),并在spoIIAC、aprE、nprE和amyE基因中有缺失。這四個基因的缺失基本如針對枯草芽孢桿菌Α164Λ 5所述的進行，該方法在美國專利N0.5,891,701中有詳細描述。培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基由每升IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl組成。LB平板由LB培養(yǎng)基與每升15g細菌用瓊脂組成。LB氨芐青霉素培養(yǎng)基由LB培養(yǎng)基與每毫升100 μ g氨芐青霉素(過濾除菌，高壓滅菌后加入)組成。LB氨芐青霉素平板由LB氨芐青霉素培養(yǎng)基與每升15g細菌用瓊脂組成。
VY 培養(yǎng)基由每升 25g 小牛肉浸出液(veal infusion) (BD Diagnostics, FranklinLakes, NJ, USA)和5g酵母提取物組成。2X YT培養(yǎng)基由每升16g胰蛋白胨、IOg酵母提取物和5g NaCl組成。2X YT氨芐青霉素培養(yǎng)基由2X YT培養(yǎng)基和每毫升100 μ g氨芐青霉素(過濾除菌，高壓滅菌后加入)組成。2X YT氨芐青霉素平板由每升2X YT氨芐青霉素培養(yǎng)基和15g細菌用瓊脂組成。LBS培養(yǎng)基由LB培養(yǎng)基和0.5M山梨醇組成。LBSM培養(yǎng)基由LBS培養(yǎng)基和0.38M甘露醇組成。TBAB 培養(yǎng)基由 Difco Tryptose Blood Agar Base (膜際蛋白血瓊脂基礎(chǔ))(BDDiagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA)組成。TBAB氯霉素平板由TBAB培養(yǎng)基和每毫升5 μ g氯霉素組成。TBAB新霉素平板由TBAB培養(yǎng)基和每毫升6 μ g新霉素組成。TBAB紅霉素/林可霉素平板由TBAB和每毫升I μ g紅霉素和25 μ g林可霉素組成。TY培養(yǎng)基由下述物質(zhì)組成:每升20g胰蛋白胨、5g酵母提取物、6mg FeCl2.4H20、Img MnCl2.4H20 和 15mg MgSO4.7H20。TY平板由TY培養(yǎng)基和每升20g細菌用瓊脂組成。TY氯霉素平板由包含每毫升6 μ g氯霉素的TY平板培養(yǎng)基組成。LBPG平板由包含0.0lM K3PO4和0.4%葡萄糖的LB平板培養(yǎng)基組成。實施例1:確定地衣芽孢桿菌菌株SJ1904的基因組序列由使用454DNA 測序技術(shù)(Margulies 等，2005，Nature437:376-380)產(chǎn)生的重疊群(contig)確定地衣芽孢桿菌菌株SJ1904完整染色體的基因組序列，使用Sanger測序技術(shù)讀出隨機配對序列(random paired)，并且，為了關(guān)閉缺口和解析重復序列，由基因組DNA的PCR片段讀出。使用Phrap組裝測序數(shù)據(jù)，并在Consed中編輯和查看。使用 Glimmer (Delcher 等，1999，Nucleic Acids Research27:4636-4641)由基因組 DNA 序列預(yù)測基因模型。使用E-值閾值為1X10—5的BLASTP，通過與無冗余數(shù)據(jù)庫PIR-NREF(Wu等，2002，Nucleic Acids Research30:35-37)的比較，對基因模型進行機器注解。實施例2:地衣芽孢桿菌Μ.Β1 1904ΙΙ DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的鑒定使用BLASTP (Altschul 等，1997，Nucleic Acids Research25:3389-3402)將地衣芽孢桿菌菌株SJ1904基因模型的推定的氨基酸序列與來自REBASE (Roberts, R.J.,Macelis1M.,Rebase.2005)的蛋白質(zhì)序列進行比較。因為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有中等水平的序列保守性，所以這項分析鑒定了這個基因組中所有推定的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。使用Prints_S16版,如通過InterProScan v3.3版所實施的,鑒定Μ.Blil904II中的胞卩密唳特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶特征(signature)。此外，發(fā)現(xiàn)存在于胞嘧啶特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶中的六個高度保守的基序(motif)在地衣芽孢桿菌M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)移酶中也是保守的。實施例3:地衣芽孢桿菌Μ.Β1 1904ΙΙ DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表征地衣芽孢桿 菌M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)如圖1A和IB中所示。編碼序列為1014bp，其包括終止密碼子。編碼區(qū)為36.1%G+C。編碼的預(yù)測蛋白質(zhì)為337個氨基酸，分子量為38.5kDa。使用Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970,見上文),如 EMBOSS 的Needle程序中所執(zhí)行的，缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，使用EBL0SUM62矩陣，確定氨基酸序列的比較配對全局比對。比對顯示，地衣芽孢桿菌M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的推定氨基酸序列與韋氏芽孢桿菌(Bacillus weihenstephanensis)C-5胞喃唳特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶前體(UniRef 100_Q2AVE0)具有64%的同一性，并且與Oceanobacillusiheyensis的胞嘧啶特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(UniRef 100_Q8EL98)具有47%的同一性。當使用Needle標記為“最長同一性”的輸出結(jié)果作為百分比同一性并如下計算時:(相同的殘基χ100)/(比對長度-比對中缺口數(shù)目)，地衣芽孢桿菌M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的推定氨基酸序列與韋氏芽孢桿菌C-5胞嘧啶特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶前體(UniRef 100_Q2AVE0)具有68.5%的同一性,并且與Oceanobacillus iheyensis的胞卩密唳特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(UniRef 100_Q8EL98)具有 55.9% 的同一性。實施例4:地衣芽孢桿菌Blil904II II型限制性內(nèi)切核酸酶基因的鑒定II型限制性內(nèi)切核酸酶彼此之間通常沒有序列同一性，當它們具有相似的DNA限制性位點時也只有很小的同一性。此外，II型限制性內(nèi)切核酸酶通常在指定的限制-修飾系統(tǒng)中位于其相應(yīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的旁邊。此外，目前表征的所有限制性內(nèi)切核酸酶基因都大于 450bp(Kong,等，2000，Nucleic Acids Research28:3216-3223)。使用這些標準，由地衣芽孢桿菌SJ1904經(jīng)注解的基因模型鑒定出大于450bp并且位于地衣芽孢桿菌M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因旁邊的假定基因作為II型限制性內(nèi)切核酸酶基因Blil904II。實施例5:地衣芽孢桿菌Blil904II II型限制性內(nèi)切核酸酶基因的表征

地衣芽孢桿菌Blil904II II型限制性內(nèi)切核酸酶基因的核苷酸序列(SEQ IDNO:3)和推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)示于圖2。編碼序列為1146bp，其包括終止密碼子。編碼區(qū)為36.3%G+C。編碼的預(yù)測蛋白質(zhì)為381個氨基酸，分子量為43.7kDa。使用Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)，如EMBOSS的Needle程序中所執(zhí)行的，缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，使用EBL0SUM62矩陣，確定氨基酸序列的比較配對全局比對。比對顯示，地衣芽孢桿菌Β1Π904ΙΙ II型限制性內(nèi)切核酸酶的推定氨基酸序列與韋氏芽孢桿菌假設(shè)蛋白質(zhì)(UniRefl00_Q2AVE3)具有45%的同一性，并且與嗜冷單胞菌菌種CNPT3假設(shè)蛋白質(zhì)(UniRefl00_QlZE16)具有32.6%的同一性。當使用Needle標記為“最長同一性”的輸出結(jié)果作為百分比同一性并如下計算時:(相同的殘基χ100)/(比對長度-比對中缺口數(shù)目)，地衣芽孢桿菌M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的推定氨基酸序列與韋氏芽孢桿菌假設(shè)蛋白質(zhì)(UniRefl00_Q2AVE3)具有47%的同一性，并且與嗜冷單胞菌CNPT3假設(shè)蛋白質(zhì)(UniRef 100_Q1ZE16)具有 47.2% 的同一性。實施例6:地衣芽孢桿菌Μ.Β1 1904ΙΙ DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆為在枯草芽孢桿菌中表達而通過PCR克隆地衣芽孢桿菌M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)
移酶基因。根據(jù)Pitcher 等，1989, Lett.Appl.Microbiol.8:151-156 的方法從地衣芽抱桿菌SJ1904分離基因組DNA。圖3顯示了包含編碼Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶和M.Blil904IIDNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因的地衣芽孢桿菌染色體區(qū)域。使用如下所示的引物999611和999612，通過PCR從地衣芽孢桿菌SJ1904基因組DNA擴增地衣芽孢桿菌SJ1904染色體的約1043bp片段，其包括Μ.Β1 1904ΙΙ DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的核糖體結(jié)合位點和編碼區(qū)，包含SEQ ID NO: 5的核苷酸2019-3049(圖3)。引物999611并入了 SacI限制性位點，而引物999612并入了 MluI限制性位點。引物999611:5' -GAGCTCTGCAAGGAGGTATAATTTTG-3' (SEQ ID NO:6)引物999612:5' -ACGCGTTTATTCAGCTATTGCATATTC-3' (SEQ ID NO:7)使用Pfx PLATINUM DNA 聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)進行 PCR。擴增反應(yīng)液(50 μ I)由下述組成:1X Pfx擴增緩沖液(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ImMMgSO4,300 μ M 每種 dNTP, 0.3 μ M 每條引物，1.25 單位 PLATINUM Pfx DNA 聚合酶，和約 200ng 模板 DNA。使用 ROBOCYCLER(IC._‘40 溫度循環(huán)儀(Stratagene Corporation, LaJolla, CA, USA)進行反應(yīng)，程序為95°C 2分鐘的I個循環(huán)；95°C I分鐘、55°C I分鐘和68°C I分鐘的30個循環(huán)；和68 °C 3分鐘的I個循環(huán)。使用用于測序的ZERO BLUNT_ TOPO PCR克隆試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)將獲得的約 1043bp PCR 產(chǎn)物克隆入載體 pCR4Blunt,并根據(jù)制造商說明轉(zhuǎn)化入ONE SHOT T0P10化學感受態(tài)大腸桿菌細胞中。使用Plasmid Midi試劑盒(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)從一個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA,并通過用EcoR1、NcoI和SnaBI消化然后在TBE (50mM Tris堿_50mM硼酸-1mM EDTA 二鈉)中的0.8%瓊脂糖電泳進行驗證，用EcoRI消化獲得3939bp和1061bp的期望片段；NcoI為3217bp和1783bp ；而SnaBI為4165bp和835bp。 通過DNA測序確定克隆的PCR片段的DNA序列。將這個質(zhì)粒命名為pMDT138(圖4)。根據(jù)制造商說明，將質(zhì)粒pMDT138轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XLl-Blue細胞(StratageneCorporation, La Jolla, CA, USA),在37°C在2X YT氨節(jié)青霉素平板上選擇氨節(jié)青霉素抗性。將一個轉(zhuǎn)化體命名為MDT45，并按照布達佩斯條約的條款于2006年9月7日將其保藏在農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(Agricultural Research ServicePatent Culture Collection, Northern Regional Research Center),1815UniversityStreet, Peoria, Illinois, 61604，并且給予登錄號 NRRL B-41967。實施例7:pMDT100的構(gòu)建質(zhì)粒pMDTlOO是大腸桿菌復制子，其包含P yM199/Pfi共有《yQ/PrayIIIA/cryIIIAstab三串聯(lián)啟動子，其驅(qū)動克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(aprH)的表達。這個aprH表達盒和pC194 的 cat 基因(Horinouchi 和 Weisblum, 1982, J.Bacteriol.150:804-814)兩側(cè)側(cè)翼為枯草芽孢桿菌α-淀粉酶(amyE)基因的片段，允許通過雙同源重組經(jīng)由兩個amyE片段在枯草芽孢桿菌染色體的amyE基因座插入aprH表達盒和cat基因。用另一個基因替代PMDT100中的aprH基因允許將所述基因插入并在枯草芽孢桿菌中表達。pMDTlOO的構(gòu)建如下所述。質(zhì)粒DNBT51。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用QIAGEN 質(zhì)粒試劑盒(QIAGENInc.，Valencia, CA, USA)從大腸桿菌宿主 DH5 α 分離質(zhì)粒 pNBTIO (pDG268MCS-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV ;美國專利 N0.6，255，076)，并用 ClaI 和 ScaI 消化。裂解發(fā)生在 aprH編碼序列約326密碼子處的ClaI位點，而不是約23密碼子處的ClaI位點，這是由于大腸桿菌Dam DNA甲基轉(zhuǎn)移酶而通過甲基化阻斷。使用Klenow片段(New EnglandBiolabs, Inc., Beverly, MA, USA)和dNTP,根據(jù)制造商的說明將ClaI末端平端化。通過
TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析消化的質(zhì)粒，并使用QIAQUICIC 凝膠提取試劑盒
(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)純化約 6615bp 的載體片段。用 Sail 和 Seal 消化質(zhì)粒p0S4301(Bacillus Genetic Stock Center, Ohio State Universit, Columbus, OH, USA),并使用Klenow片段和dNTP將Sail末端平端化，如上所述。通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析消化的質(zhì)粒，并使用QIAQUICK: 凝膠提取 試劑盒純化攜帶大腸桿菌rrnB轉(zhuǎn)錄終止子的約 840bp 片段?？梢詮妮d體 pKK223_3 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)(圖5)分離同樣的840bp Sall/Scal片段。根據(jù)制造商的說明，用T4DNA連接酶(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)將 pNBTIO 載體片段和攜帶終止子的片段連接在一起，并根據(jù)制造商的說明，用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci (GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA)，在37°C在2X YT氨芐青霉素平板上選擇氨芐青霉素抗性。將得到的質(zhì)粒命名為 PNBT51 (pDG268-PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV Δ )(圖 6)。質(zhì)粒DNBT52。用 SfiI 消化質(zhì)粒 pNBT51，在 11 °C 用 T4DNA 聚合酶(RocheDiagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)和 25 μ M 每種 dNTP 溫育 20 分鐘，將末端平端化，然后75°C溫育10分鐘，將聚合酶熱失活。然后用DraIII消化末端平端化的質(zhì)粒，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，使用QIAQUICIC 凝膠提取試劑盒純化約592Obp 的載體片段。用 DraIII 和 Ecll36II 消化質(zhì)粒 pNBTIO (pDG268MCS_P短共有aniyQ/SAV ；美國專利N0.6，255，076)，并且使用QIAQUICK .凝膠提取試劑盒純化約1641bp的攜帶短共有amyQ啟動子(P短共有《yQ)的片段。如上所述連接PNBT51載體片段和P短共有amyQ片段，并如上所述用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在37°C在2X YT氨芐青霉素平板上選擇氨芐青
霉素抗性。使用Q1APREP 8小型制備試劑盒(QIAGEN, Valencia, CA，USA)從幾個轉(zhuǎn)化
體分離質(zhì)粒DNA，用SphI消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析。將具有期望的約4873 bp和2688bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT52 (pDG268-Pfift；tamyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV Δ )(圖 7)。質(zhì)粒DNBT53。用 SfiI 和 SacI 消化質(zhì)粒 pNBT6 (pHP13amp_SAV ;美國專利N0.6，255，076)，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，使用QIAQUICK .凝膠提取試劑盒純化約6438bp的載體片段。用SfiI和SacI消化質(zhì)粒pNBT52，并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且使用Qi AQUiCK 凝膠提取試劑盒純化約727bp的攜帶
P 短共有 amyQ/PcrylllA
/crylIIAstab串聯(lián)啟動子的片段。如上所述連接pNBT6載體片段和P短共有-yQ/PcryiiiA/cryIIIAstab片段，并如上所述用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在37°C在2X YT氨芐青霉素平板上選擇氨芐青霉素抗性。使用QIAPREP 8小型制備試劑盒(QIAGEN，Valencia, CA, USA)，從幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，用PvuII消化，并通過TBE緩沖液中的
0.8%瓊脂糖電泳分析。將具有期望的約4903bp、1320 bp和942 bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為 pNBT53(pHP13amp-P短共有amyQ/PcrymA/CryIIIAstab/SAV)(圖 8)。質(zhì)粒DNBT54。用 SfiI 和 BamHI 消化質(zhì)粒 pNBTl (pDG268MCS ;美國專利
N0.6，255，076)，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，使用Qi AQU丨CK .凝膠提取試劑盒純化約6040bp的載體片段。用SfiI和BamHI消化質(zhì)粒pNBT53，并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且使用Q1AQLI1CK 凝膠提取試劑盒純化約1953bp的
攜P 短共有 amyt^PcryIIIA
/cryIIIAstab/SAV盒的片段。如上所述連接pNBTl載體片段和P短共
有 amyQ/PcrylllA
/cryIIIAstab/SAV片段，并如上所述用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在37°C在
2X YT氨芐青霉素平板上選擇氨芐青霉素抗性。使用QIAPREP 8小型制備試劑盒，從
幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，并通過用SfiI和BamHI同時消化，然后是TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳來分析。將具有期望的約6040bp和1953bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT54(pDG268MCS-P短共有呵Q/P町IIIA/cryIIIAstab/SAV)(圖 9)。質(zhì)粒DNBT35。用 SfiI 和 BamHI 消化質(zhì)粒 pNBT2 (pDG268MCS Λ-Prcryim/cryIIIAstab/SAV ;美國專利N0.6，255，076)，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，使用QiAQU丨CK 凝膠提取試劑盒純化約5394bp的載體片段。用SfiI和BamHI消化質(zhì)粒PNBT54，并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且使用QIAQUICK 凝膠提取試劑盒純化約1953bp的攜帶P短共brt/Perynu/cryinAstab/SAV盒的片段。如上所述連接PNBT2載體片段和P短共有amyQ/PrayIIIA/CryIIIAStab/SAV片段，并如上所述用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在37°C在2X YT氨芐青霉素平板上選擇氨芐青霉素抗性。使用Q1APREP 8小型制備試劑盒，從幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒 DNA，用NcoI消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析。將具有期望的約5492bp和1855bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為 pNBTSSbDGSeSMCSA-PgM^/PqmA/crylllAstab/SAV)(圖 10)。質(zhì)粒DNBT30。構(gòu)建質(zhì)粒pNBT30，以包含amyL基因啟動子的amyL4199變體的PCR克隆(美國專利N0.6，100, 063)。根據(jù)Pitcher等，1989，見上文的方法分離地衣芽孢桿菌SJ1904的基因組DNA。使用如下所示的引物950872和991151，通過PCR從地衣芽孢桿菌SJ1904的基因組DNA擴增amyL4199啟動子(Pamyl4199)基因。引物950872并入SfiI限制性位點，而引物991151并入SacI限制性位點和Pamywi99的變體核苷酸。引物950872:5' -CCAGGCCTTAAGGGCCGCATGCGTCCTTCTTTGTGCT-3/ (SEQ ID NO:8)引物991151:5' -GAGCTCCTTTCAATGTGATACATATGA-3' (SEQ ID NO:9)根據(jù)制造商的推薦，使用AMPUTAQ Gold DNA聚合酶(AppliedBiosystems, Foster City, CA, USA)進行 PCR,只是 MgCl2 濃度是 3mM,而不是標準的 1.5mM。擴增反應(yīng)物(50 μ I)由下述組成:10mM Tris-HCl (pH8.3), 50mM KC1,3.0mM MgCl2, 200 μ M
每種dNTP，0.5 μ M每條引物，0.25單位AMPLITAQ Gold DNA聚合酶，和約200ng模板
DNA。在ROBOCYCLER 40溫度循環(huán)儀中進行PCR，程序為95°C 9分鐘的I個循環(huán)；95 0C I分鐘、55°C I分鐘和72 °C I分鐘的30個循環(huán)；和72 °C 3分鐘的I個循環(huán)。
使用TOPO TA 克隆試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)將得到的約 625bp的PCR產(chǎn)物克隆入載體pCR2.1，并根據(jù)制造商的說明轉(zhuǎn)化入ONE SHOT T0P10化學感受態(tài)大腸桿菌細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。使用Q丨APREP H微型制備試劑盒從幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，并通過用EcoRI消化，然后是TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳來分析克隆的PCR片段的存在。將一個具有預(yù)期的約3913bp和640bp的限制性片段的質(zhì)粒命名為PNBT30 (pCR2.l_amyL4199)(圖11)。通過DNA測序確認克隆的PCR片段的DNA序列。質(zhì)粒DNBT31。用 SfiI 和 SacI 消化質(zhì)粒 pNBT3 (pDG268MCS Λ Iieo-Prcryim/cryIIIAstab/SAV ;美國專利N0.6，255，076)，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，使用Q1AQUICK⑩凝膠提取試劑盒純化約7931bp的載體片段。用SfiI和SacI消化質(zhì)粒PNBT30，并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且使用QIAQUICK .凝膠提取試劑盒純化約612bp的攜帶Pamywi99的片段。如上所述連接PNBT3載體片段和PamyL4I99片段，并根據(jù)制造商的說明用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue細胞(StratageneCorporation, La Jolla, CA, USA),在37°C在2X YT氨節(jié)青霉素平板上選擇氨節(jié)青霉素抗性。
使用QIAPREP_ 8微型制備試劑盒從幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，用NcoI消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析。將具有預(yù)期的約6802bp和1741bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT31(圖12)。質(zhì)粒DNBT36。用SfiI消化質(zhì)粒pNBT35，并使用T4DNA聚合酶和dNTP將末端平端化，如上所述。然后將末端平端化的質(zhì)粒用DraIII消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%
瓊脂糖電泳分析。使用QIAQU1CK .凝膠提取試劑盒純化約5808bp的載體片段。用
DraIII和Ecol36II消化質(zhì)粒pNBT31，并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且
使用QlAQU丨CK 凝膠提取試劑盒純化約2150bp攜帶Pamywi99的片段。如上所述連接
PNBT35載體片段和Pamywi99片段，并根據(jù)制造商的說明用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE 細胞(Stratagene Corporation, La Jolla, CA, USA),在 37°C在 2X YT 氨節(jié)青霉素平板上選擇氨芐青霉素抗性。使用QIAPREP 8微型制備試劑盒從幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，用NcoI消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析。將具有預(yù)期的約5492bp和2466bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT36(圖13)。質(zhì)粒dMDTIOO。用 DraIII 和 SacI 消化質(zhì)粒 pNBTl3 (pDG268 Δ Xieo-Vwi1JVctnilk/cryIIIAstab/SAV;美國專利N0.6，255，076)，并使用QIAQUICK 凝膠提取試劑盒純化約6395bp的載體片段。用DraIII和SacI消化質(zhì)粒pNBT36，并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且使用QIAQUICK 凝膠提取試劑盒純化約2873bp的攜帶P—/
PamyQ (sc) /^cryIIIA
二串聯(lián)啟動子的片段。如上所述連接PNBT13載體片段和PamyL41%/PamytKs;。)/PcryIIIA片段，并如上所述用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE 細胞，在37°C在2X YT氨芐青霉素平板上選擇氨芐青霉素抗性。使用Q1APREP 8微型制備試劑盒從幾個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，用ApaI消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖分析。將具有預(yù)期的約4974bp和4294bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pMDT100(圖14)。實施例8:地衣芽孢桿菌Μ.Β1 1904ΙΙ DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達將地衣芽孢桿菌M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因插入枯草芽孢桿菌的染色體中，以在該宿主中表達DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，從而在枯草芽孢桿菌中使DNA甲基化。

用SacI和MluI消化質(zhì)粒pMDTlOO并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，
并使用Q1AQU1CK 凝膠提取試劑盒純化約SlOObp的載體片段。用SacI和MluI消化質(zhì)粒pMDT138，并且使用QIAQUICK .凝膠提取試劑盒純化約1033bp的攜帶Μ.Β1 1904ΙΙ
基因的片段。如上所述連接PMDT100載體片段和M.Blil904II基因片段。此連接將Μ.Β1 1904ΙΙ基因置于PamyL4199/P短共有_/Ρ_ΙΙΑ/(3ηΙIIAstab啟動子的下游和aprH轉(zhuǎn)錄終止子的上游。根據(jù) Anagnostopoulos 和 Spizizen, 1961, J.Bacteriol.81:741-746 的方法用連接物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168 △ 4，在37°C在TBAB氯霉素平板上選擇氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化體。在37°C在TBAB新霉素平板上篩選對于新霉素敏感的抗氯霉素轉(zhuǎn)化體，以確定是否通過雙交換已將DNA插入到枯草芽孢桿菌染色體的amyE基因中。使用如下所示的引物994112和999592 (其分別在三串聯(lián)啟動子和Μ.Β1 1904ΙΙDNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因中結(jié)合)和如下所示的引物999611和960456 (其分別在Μ.Β1 1904ΙΙDNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因和amyE基因中結(jié)合)，通過PCR確認在amyE基因座存在Μ.Β1 1904ΙΙDNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達盒。將在amyE基因座包含cat基因和M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達盒的一個這樣的轉(zhuǎn)化體，命名為枯草芽孢桿菌MDT101。引物994112:5' -GCGGCCGCTCGCTTTCCAATCTGA-3' (SEQ ID NO:10)引物999592:5' -ATCGATCAGCTTGGATAAACCCTA-3' (SEQ ID NO:11)引物999611:5' -GAGCTCTGCAAGGAGGTATAATTTTG-3' (SEQ ID NO:12)引物960456:5' -CGTCGACGCCTTTGCGGTAGTGGTGCTT-3' (SEQ ID NO:13)根據(jù)制造商的說明，使用Taq DNA聚合酶(New EnglandBiolabs, Inc.，Beverly, MA, USA)進行 PCR。擴增反應(yīng)物(50 μ I)由下述組成:10mMTris-HCl (pH8.3), 50mM KCl，3.0mM MgCl2, 200 μ M 每種 dNTP，0.5 μ M 每條引物，0.25 單位Taq DNA聚合酶，和約200ng基因組DNA。在ROBOCYCLER 40溫度循環(huán)儀中進行PCR，程序為95°C 2分鐘的I個循環(huán)；95°C 2分鐘、55°C 2分鐘和72°C 2分鐘的30個循環(huán)；和72 °C 3分鐘的I個循環(huán)。為了證實克隆的M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)移酶能將DNA甲基化，從表達甲基轉(zhuǎn)移酶的芽孢桿菌屬菌株分離質(zhì)粒DNA,并測試DNA甲基化。根據(jù)Anagnostopoulos和Spizizen, 1961，見上文的方法，用質(zhì)粒pCJ791 (美國公開申請N0.20030175902)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌菌株168 Λ 4和MDTlO I，在34°C在TBAB紅霉素/林可霉素平板上選擇紅霉素抗性。使用QIAGEN Plasmid Midi試劑盒，從枯草芽孢桿菌168 Δ 4和枯草芽孢桿菌MDTlOl的各一個轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒PCJ791DNA。根據(jù)Xue 等,1999, J.Microbiol.Methods34 (3): 183-191 的方法，通過電穿孔用來自枯草芽孢桿菌MDTlOl轉(zhuǎn)化體的pCJ791DNA轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌SJ1904。簡而言之，使用l-5ml LBS培養(yǎng)基中生長的地衣芽孢桿菌的過夜培養(yǎng)液接種50ml新鮮LBS培養(yǎng)基，并在37°C和250rpm培育培養(yǎng)物。培養(yǎng)物生長至靜止期，在緩慢生長期(指數(shù)生長期結(jié)束后1-3小時)后，當培養(yǎng)經(jīng)歷生長速率增加時，通過在6500x g離心收獲細胞。用50ml冰冷的MSG(0.5M甘露醇，0.5M山梨醇，10%甘油)將細胞洗滌兩次，并重懸于約750 μ I MSG中。如下轉(zhuǎn)化細胞或?qū)⒓毎赺20°C保存。在電極間距為Imm的電穿孔杯中，60 μ I電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞與質(zhì)粒DNA混合，并使用設(shè)置為25 μ F、200 Ω和1.0kV的GENE PULSER (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)施加于電脈沖。然后將電穿孔細胞轉(zhuǎn)移至包含0.2 μ g紅霉素每ml的950 μ I LBSM培養(yǎng)基，誘導紅霉素抗性。在34°C和250rpm將轉(zhuǎn)化體培育2.5-3小時，然后在34°C在TBAB紅霉素/林可霉素平板上選擇紅霉素抗性。使用QIAGEN Plasmid Midi試劑盒從一個地衣芽孢桿菌SJ1904轉(zhuǎn)化體分離
質(zhì)粒pCJ791DNA。用Fnu4HI并用Sac I消化分離自枯草芽孢桿菌168 Λ 4、枯草芽孢桿菌MDT101和地衣芽孢桿菌SJ1904的質(zhì)粒pCJ791DNA。質(zhì)粒pCJ791具有12個Fnu4HI識別位點和三個Sac I識別位點。Fnu4HI切割序列GCNGC處的DNA，它能消化來自枯草芽孢桿菌168 Λ 4的pCJ791質(zhì)粒DNA，但不能消化來自枯草芽孢桿菌MDT101或地衣芽孢桿菌SJ1904的pCJ791質(zhì)粒DNA，說明來自后兩種來源的質(zhì)粒DNA在GCNGC位點甲基化。Sac I切割序列GAGCTC處的DNA，因此不受序列GCNGC甲基化的影響，能切割來自所有三種來源的pCJ791質(zhì)粒DNA。實施例9:地衣芽孢桿菌Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶基因的克隆通過PCR克隆地衣芽孢桿菌Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶編碼區(qū)。根據(jù)Pitcher等，1989，見上文的方法分離地衣芽孢桿菌SJ1904基因組DNA。圖3顯示地衣芽孢桿菌染色體區(qū)域，其包含編碼Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶和M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因。使用如下所示的引物060625和`060626，通過PCR從地衣芽孢桿菌SJ1904基因組DNA擴增包括Blil904II基因的編碼區(qū)的地衣芽孢桿菌SJ1904染色體的約1158bp片段，其包含SEQ ID NO: 5的核苷酸443-1588(圖3)。引物060625并入Kpn I限制性位點，而引物060626并入Bam HI限制性位點。引物060625:5' -GGTACCATGTTCTATACTAATCAACC-3' (SEQ ID NO:14)引物060626:5' -GGATCCTTATTTGTTTTCATTTTCAA-3' (SEQ ID NO:15)使用Pfx DNA 聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)進行 PCR。擴增反應(yīng)物(50 μ I)由下述組成:1X Pfx 擴增緩沖液(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，1.5mMMgSO4, 300 μ M 每種 dNTP, 0.3 μ M 每條引物，1.25 單位 PLATINUM Pfx DNA 聚合酶，和約200ng模板DNA。在ROBOCYCLER 40溫度循環(huán)儀中進行反應(yīng)，程序為95°C 2分鐘的I個循環(huán)；95°C I分鐘、55°C I分鐘和68 °C I分鐘的30個循環(huán)；和68 °C 3分鐘的I個循環(huán)。
使用測序用 Zero Bk丨nt Τ ΡΟ : PCR克隆試齊Ij盒
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，將獲得的約 1158bp 的 PCR產(chǎn)物克隆入pCR4Blunt，并根據(jù)制造商的說明轉(zhuǎn)化入ONE SHOT T0P10化學感受態(tài)大腸桿菌細胞。使用QIAGEN Plasmid Midi試劑盒從一個轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過用Eco RI消化，然后是TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳來確認，其產(chǎn)生期望的3939bp、897bp和279bp的片段。通過DNA測序確認克隆的PCR片段的DNA序列。將這個質(zhì)粒命名為pMDT156 (圖15)，并將包含該質(zhì)粒的大腸桿菌TOPlO轉(zhuǎn)化體命名為MDT46。根據(jù)布達佩斯條約的條款于2006年9月7日將MDT46保藏于農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearch Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center),1815University Street, Peoria, Illinois, 61604,并給予登錄號 NRRL B-41968。實施例10:構(gòu)建地衣芽孢桿菌Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶基因的缺失型通過PCR構(gòu)建地衣芽孢桿菌Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶的缺失型，以允許地衣芽孢桿菌中天然基因的缺失。根據(jù)Pitcher等，1989，見上文的方法，從地衣芽孢桿菌SJ1904分離基因組DNA，通過PCR從Blil904II染色體基因座擴增兩個片段。使用如下所述的引物999592和999593，通過PCR從地衣芽孢桿菌SJ1904基因組DNA擴增地衣芽孢桿菌SJ1904染色體中Bli 1904II基因上游約505bp的片段，其中包含SEQID NO:5的核苷酸1616-2102。引物999592并入Cla I限制性位點。引物999592:5' -ATCGATCAGCTTGGATAAACCCTA-3' (SEQ ID NO:16)引物999593:5' -TTCACAAGATCTATTTCTTCTTTCAGACCC-3' (SEQ ID NO:17)使用PLATINUM Pfx DNA聚合酶，如實施例6中所述進行PCR。使用引物999594和999595，從地衣芽孢桿菌SJ1904基因組DNA擴增包括Β1 1904ΙΙ基因的最后42個密碼子加下游DNA的地衣芽孢桿菌SJ1904染色體的約507bp片段，其包含SEQ ID NO:5的核苷酸1-487。引物999594并入Not I限制性位點。引物9995945' -AGAAATAGATCTTGTG AAATGGGTTCTTAT-3' (SEQ ID NO:18)引物999595:5' -GCGGCCGCTCATGTTCCCATATTCTT-3' (SEQ ID NO:19)使用PLATINUM' Pfx DNA聚合酶，如實施例6中所述進行PCR，除了 MgSO4濃度為1.5mM0引物999593(用于上游擴增)和引物999594 (用于下游擴增)具有互補的5’末端。因此，兩個擴增物具有互補的末端，允許兩個PCR片段的融合，如下所述。根據(jù)制造商的說明，使用QIAQUiCK PCR純化試劑盒(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)從兩個擴增物去除引物。使用兩個擴增物作為第三次PCR的模板DNA，使用引物999592和999595，通過引物999593和999594序列提供的互補末端將兩個片段融合。使用PLATINUM PfxDNA聚合酶，如實施例6中所述進行PCR，只是模板DNA由各2 μ I的兩個擴增物組成。處.川QIAQUICX 凝膠提取試劑盒純化得到的約994bp PCR產(chǎn)物，并使用測
序用Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑盒將其克隆入載體pCR4Blunt，并如實施例6中所述轉(zhuǎn)化入ONE SHOT TOPlO化學感受態(tài)大腸桿菌細胞。使用BIOROBOT 9600 (QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)從幾個轉(zhuǎn)化體純化質(zhì)粒DNA，并通過用EcoRI和NotI消化，然后是TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳來測試克隆的PCR片段的存在和方向。將一個EcoRI片段為約3939bp和1012bp和NotI片段為約4931bp的質(zhì)粒命名為pMDT134 (圖16)，并將通過DNA測序驗證克隆的PCR片段的DNA序列。實施例11:構(gòu)建地衣芽孢桿菌Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶基因缺失質(zhì)粒構(gòu)建溫度敏感型質(zhì)粒，以允許地衣芽孢桿菌中的Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶基因的缺失。構(gòu)建質(zhì) 粒pMDT131，以產(chǎn)生可賦予氯霉素抗性的溫度敏感型質(zhì)粒。用EcoRI消化質(zhì)粒pMRT074(美國公開申請2003/0175902)，然后用T4DNA聚合酶加dNTP處理以產(chǎn)生平末端，如實施例7中所述。然后用NotI消化質(zhì)粒，通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，并使用QIAQIJICK 凝膠提取試劑盒純化約4355bp的載體片段。用Eco47III和NotI
消化質(zhì)粒PNBTl，通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，并使用Q丨AQU丨CK 凝膠提
取試劑盒純化約1222bp的攜帶cat基因和多克隆位點的片段。使用T4DNA連接酶，如上所述連接 pMRT074 載體片段和 pNBTlcat 片段，并根據(jù) Anagnostopoulos 和 Spizizen, 1961,見上文的方法，用連接物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168 △ 4，在34°C在TBAB氯霉素平板上選擇氯霉素抗性。使用QIAGEN Plasmid Midi試劑盒從一個轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA,并通過用BamHI消化，然后是TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳來確認，其可產(chǎn)生期望的約3779bp和1802bp的片段。將得到的質(zhì)粒命名為PMDT131 (圖17)。構(gòu)建質(zhì)粒pMDT139，以產(chǎn)生適合從地衣芽孢桿菌染色體缺失Blil904II基因的質(zhì)粒。根據(jù)制造商的說明，用質(zhì)粒pMDT134轉(zhuǎn)化大腸桿菌SCSI 10 (Stratagene Corporation, LaJolla, CA, USA)，其對于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dam是缺陷的，在37°C在2X YT氨芐青霉素平板上選擇氨節(jié)青霉素抗性。使用QiAGEN Plasmid Midi試劑盒從一個轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，得到能用ClaI (在一定程度上受Dam甲基化抑制)消化的pMDT134質(zhì)粒DNA。用ClaI和NotI消化質(zhì)粒pMDT134DNA，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，并使用QIAQU丨CK_ .凝膠提取試劑盒純化攜帶缺失的Blil904II基因的約986bp片段。用ClaI和NotI消化質(zhì)粒pMDT131，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，并使用QIAQUICK 凝膠提取試劑盒純化約5569bp的載體片段。使用T4DNA連接酶，如上所述，連接PMDT131載體片段和缺失的Blil904II基因片段，并根據(jù)Anagnostopoulos和Spizizen, 1961，見上文的方法，用連接物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168 Λ 4，在34°C在TBAB氯霉素
平板上選擇氯霉素抗性。使用QIAGEN Plasmid Midi試劑盒從一個轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過用PvuII消化而確認，其得到期望的約4334bp和2220bp的片段。將得到的質(zhì)粒命名為pMDT139(圖18)。
實施例12:地衣芽孢桿菌SJ1904中Blil904II基因的缺失從地衣芽孢桿菌SJ1904的染色體缺失地衣芽孢桿菌Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶基因，以測試對將DNA導入地衣芽孢桿菌的作用。如下從地衣芽孢桿菌SJ1904的染色體缺失Blil904II基因。根據(jù)Xue等，1999，見上文的方法，如實施例8中所述，通過電穿孔用質(zhì)粒pMDT139轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌SJ1904。在34°C和250rpm培育轉(zhuǎn)化體2.5-3小時，然后在34°C在TBAB紅霉素/林可霉素平板上選擇紅霉素抗性。在50°C使一個這樣的轉(zhuǎn)化體在帶有紅霉素選擇的TBAB平板上生長，以選擇在Β1 1904ΙΙ基因座pMDT139整合入染色體的整合物。然后在無選擇的條件下在34°C使一個這樣的整合體在VY培養(yǎng)基中生長，以允許整合質(zhì)粒的切除和丟失。在37°C將培養(yǎng)物涂布在LB平板上，測試菌落對紅霉素的敏感性，說明質(zhì)粒的丟失。如下使用EXTRACT-N-AMP 植物PCR 試劑盒(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)，用引物 999592 和 999595(如上所述)，通過PCR測試幾個紅霉素敏感的克隆。通過將菌落懸浮于來自試劑盒的50 μ I提取溶液并在95°C溫育10分鐘而裂解地衣芽孢桿菌細胞。然后每個裂解懸浮液與50 μ I來自試劑盒的稀釋溶液混合，根據(jù)制造商的說明，在PCR中各使用4μ I。將一個克隆命名為地衣芽孢桿菌MDT269，所述克隆中PCR擴增得到約994bp的片段，說明Blil904II基因從染色體上缺失。實施例13:地衣芽孢桿菌SJ1904和MDT269的轉(zhuǎn)化進行轉(zhuǎn)化實驗，以確定Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶和甲基轉(zhuǎn)移酶M.Blil904II對將DNA導入地衣芽孢桿菌的影響。 如實施例8中所述，從枯草芽孢桿菌168 Δ 4、枯草芽孢桿菌MDTlOl和地衣芽孢桿菌SJ1904的轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒pCJ791。如實施例8中所述制備地衣芽孢桿菌菌株SJ1904和MDT269的電感受態(tài)細胞。用分離自三種芽孢桿菌來源的PCJ791質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化兩種地衣芽孢桿菌菌株。對于每個轉(zhuǎn)化，在電極間距為Imm的電轉(zhuǎn)化杯中，用200ng質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化60 μ I電感受態(tài)細胞，其中使用GENE PULSER ,設(shè)定為25yF、200Q和1.0kV。轉(zhuǎn)化一式三份(in triplicate)進行。轉(zhuǎn)化結(jié)果示于表I。用來自枯草芽孢桿菌168Λ4(不表達甲基轉(zhuǎn)移酶Μ.Β1 1904ΙΙ)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌SJ1904(具有野生型Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶基因)時，得到很低的轉(zhuǎn)化頻率。然而，用由甲基轉(zhuǎn)移酶M.Blil904II(來自枯草芽孢桿菌MDTlOl或地衣芽孢桿菌SJ1904)甲基化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌SJ1904時，得到高的轉(zhuǎn)化效率。此外，在用來自三種來源任一個的質(zhì)粒DNA(無論是否被甲基轉(zhuǎn)移酶Μ.Β1 1904ΙΙ甲基化)轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌MDT269(缺失Blil904II限制性內(nèi)切核酸酶基因)時，獲得了高的轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果顯示，通過從表達M.Blil904II DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的宿主菌株分離質(zhì)粒DNA (這修飾了質(zhì)粒DNA)，或者通過缺失受體地衣芽孢桿菌菌株中的Bli 1904II限制性內(nèi)切核酸酶基因，可以顯著改進地衣芽孢桿菌通過用質(zhì)粒DNA電穿孔的轉(zhuǎn)化。表1.用分離自枯草芽孢桿菌168 Λ 4、枯草芽孢桿菌MDTlOl和地衣芽孢桿菌SJ1904的pCJ791質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌SJ1904。1轉(zhuǎn)化頻率是三次重復的平均值土標準偏差。
權(quán)利要求
1.選自下組的分離的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 (a)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其包含與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少97%序列同一'丨生的氨基酸序列； (b)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其由包含與SEQID NO: I的核苷酸I至1143具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少97%序列同一'丨生的核苷酸序列的多核苷酸編碼； (C)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其由在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴緊條件下，與SEQ ID NO: I的核苷酸I至1143或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和 (d)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的變體，包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQ IDNO:2的氨基酸I至381。
2.權(quán)利要求I的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其包含如下或由如下組成SEQID NO: 2的氨基酸I至381，或其具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的片段。
3.權(quán)利要求I的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其由包含如下或由如下組成的多核苷酸編碼SEQIDΝΟ:1的核苷酸I至1143，或其編碼具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的片段的亞序列。
4.權(quán)利要求I的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其由包含于大腸桿菌NRRLB-41967中的質(zhì)粒PMDT138所包含的多核苷酸編碼。
5.編碼權(quán)利要求1-4中任一項的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的分離的多核苷酸。
6.包含權(quán)利要求5的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或重組表達載體,所述多核苷酸與在表達宿主中指導多肽產(chǎn)生的一個或多個調(diào)控序列可操作連接。
7.包含權(quán)利要求5的多核苷酸的重組宿主細胞。
8.產(chǎn)生DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求7的重組宿主細胞；和(b)回收所述的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。
9.選自下組的分離的限制性內(nèi)切核酸酶 (a)多肽，其包含與SEQID NO: 4的氨基酸I至337具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少97%序列同一'丨生的氨基酸序列； (b)多肽，其由包含與SEQID NO: 3的核苷酸I至1011具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%,和甚至最優(yōu)選至少97%序列同一'丨生的核苷酸序列的多核苷酸編碼； (c)多肽，其由在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴緊條件下，與SEQ ID NO: 3的核苷酸I至1011或其全長互補鏈雜交的多核苷酸編碼；和 (d)變體，包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQID NO:4的氨基酸I至337。
10.權(quán)利要求9的限制性內(nèi)切核酸酶，其包含如下或由如下組成SEQID NO:2的氨基酸I至381，或其具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的片段。
11.權(quán)利要求9的限制性內(nèi)切核酸酶，其由包含如下或由如下組成的多核苷酸編碼SEQ ID N0:1的核苷酸I至1143，或其編碼具有限制性內(nèi)切核酸酶活性的片段的亞序列。
12.權(quán)利要求9的限制性內(nèi)切核酸酶，其由包含于大腸桿菌NRRLB-41968中的質(zhì)粒PMDT156包含的多核苷酸編碼。
13.編碼權(quán)利要求9-12中任一項的限制性內(nèi)切核酸酶的分離的多核苷酸。
14.包含權(quán)利要求13的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或重組表達載體，其與在表達宿主中指導多肽產(chǎn)生的一個或多個調(diào)控序列可操作連接。
15.包含權(quán)利要求13的多核苷酸的重組宿主細胞。
16.產(chǎn)生限制性內(nèi)切核酸酶的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生限制性內(nèi)切核酸酶的條件下培養(yǎng)包含權(quán)利要求13的多核苷酸的重組宿主細胞；和(b)回收所述限制性內(nèi)切核酸酶。
17.產(chǎn)生細菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括 (a)將DNA導入第一細菌宿主細胞，所述細胞包含權(quán)利要求5的編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸，以產(chǎn)生甲基化的DNA ； 其中所述DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有相同的特異性；和 (b)將來自第一細菌宿主細胞的甲基化DNA轉(zhuǎn)移入第二細菌宿主細胞，其中所述第二細菌宿主細胞包含能降解DNA但不能降解甲基化DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；和 (c)分離包含甲基化DNA的第二細菌宿主細胞的轉(zhuǎn)化體。
18.通過權(quán)利要求17的方法獲得的轉(zhuǎn)化體。
19.產(chǎn)生細菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括 (a)用權(quán)利要求1-4中任一項的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA體外甲基化，以產(chǎn)生甲基化DNA ； 其中所述DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有相同的特異性； (b)將甲基化DNA導入細菌宿主細胞，其中細菌宿主細胞包含能降解DNA但不能降解甲基化DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；和 (c)分離包含甲基化DNA的細菌宿主細胞的轉(zhuǎn)化體。
20.通過權(quán)利要求19的方法獲得的轉(zhuǎn)化體。
21.產(chǎn)生細菌轉(zhuǎn)化體的方法，其包括 (a)將DNA導入細菌宿主細胞中，所述細胞包含編碼限制性內(nèi)切核酸酶的權(quán)利要求13的多核苷酸，所述多核苷酸是失活的； 其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQ ID N0:4的氨基酸I至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性；和 其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活使導入的DNA不被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導入細菌宿主細胞前用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化；和 (b)分離包含所述DNA的細菌宿主細胞的轉(zhuǎn)化體。
22.通過權(quán)利要求21的方法獲得的轉(zhuǎn)化體。
23.產(chǎn)生具有生物活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細菌宿主細胞，所述細胞包含導入的編碼具有生物活性的多肽或與該多肽表達有關(guān)的DNA ； 其中在將DNA導入細菌宿主細胞之前通過權(quán)利要求1-4中任一項的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化； 其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有相同的特異性，而且對于細菌宿主細胞是天然的或外源的；和 其中甲基化防止導入的DNA被所述細菌宿主細胞的限制性內(nèi)切核酸酶消化；和 (b)回收所述具有生物活性的多肽。
24.產(chǎn)生有生物活性的多肽的方法，其包括 (a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細菌宿主細胞，所述細胞包含導入的編碼具有生物活性的多肽或與該多肽表達有關(guān)的DNA ； 其中細菌宿主細胞包含權(quán)利要求13的編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多肽，所述多肽是失活的； 其中限制性內(nèi)切核酸酶與SEQ ID N0:4的氨基酸I至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性，和 其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多肽的失活防止導入的DNA被所述限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導入細菌宿主細胞前用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化；和 (b)回收所述具有生物活性的多肽。
25.產(chǎn)生親本細菌細胞的突變體的方法，其包括 (a)向親本細菌細胞中導入包含核酸構(gòu)建體的DNA，以使親本細菌細胞中編碼多肽的基因失活，這產(chǎn)生與在相同條件下培養(yǎng)時的親本細胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽的突變體細胞； 其中在將DNA導入細菌宿主細胞前，通過權(quán)利要求1-4中任一項的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化； 其中所述DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO: 2的氨基酸I至381的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有相同的特異性；和 其中甲基化防止導入的DNA被親本細菌細胞的限制性內(nèi)切核酸酶消化；和 (b)分離所述突變體細胞。
26.通過權(quán)利要求25的方法獲得的突變體細菌細胞。
27.權(quán)利要求26的突變體細胞，其進一步包含編碼天然或異源蛋白質(zhì)的基因。
28.產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在有益于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求27的突變體細胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。
29.產(chǎn)生親本細菌細胞的突變體的方法，其包括 (a)向親本細菌細胞中導入包含核酸構(gòu)建體的DNA，以使親本細菌細胞中編碼多肽的基因失活，這產(chǎn)生與在相同條件下培養(yǎng)時的親本細胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽的突變體細胞；其中親本細菌宿主細胞包含權(quán)利要求13的編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸,所述多核苷酸是失活的；其中所述限制性內(nèi)切核酸酶與SEQ ID NO:4的氨基酸I至337的限制性內(nèi)切核酸酶有相同的特異性；和其中編碼限制性內(nèi)切核酸酶的多核苷酸的失活防止導入的DNA被限制性內(nèi)切核酸酶消化，且無需在將DNA導入親本細菌細胞前用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將DNA甲基化；和 (b)分離所述突變體細胞。
30.通過權(quán)利要求29的方法獲得的突變體細菌細胞。
31.權(quán)利要求30的突變體細胞，其還包含編碼天然或異源蛋白質(zhì)的基因。
32.產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在有益于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求31的突變體細胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及改進向細菌宿主細胞中導入DNA的方法。
文檔編號C12N5/10GK103255114SQ20131016577
公開日2013年8月21日 申請日期2007年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月29日
發(fā)明者邁克爾.托馬斯, 邁克爾.雷伊 申請人:諾維信股份有限公司