專利名稱：常溫保存的封閉式核酸層析試紙檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，涉及一種常溫下保存核酸擴(kuò)增試劑的方法；此外本發(fā)明還涉及一種常溫保存的封閉式核酸層析試紙檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，同時(shí)也公開了核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的無害化處理方法。
背景技術(shù)：
自1985年美國(guó) Cetus 公司用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)實(shí)現(xiàn)核酸的特異性擴(kuò)增以來，這項(xiàng)技術(shù)就因具有高靈敏度、高特異性和高效的特點(diǎn)被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)體外診斷以及食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域。近年來隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展以及生物物理技術(shù)的大量應(yīng)用，新的核酸擴(kuò)增模式也不斷涌現(xiàn)。已經(jīng)建立起來的方法大體可分為兩大類，靶核酸的直接擴(kuò)增與信號(hào)放大擴(kuò)增。前者包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、鏈替代擴(kuò)增(SDA)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)和依賴核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)等，這些方法都具有很高的靈敏度。信號(hào)放大擴(kuò)增包括技術(shù)核酸(bDNA)、雜交捕獲、侵染(Invader)和通過擴(kuò)增替代分子來檢測(cè)靶核酸等方法。而滾環(huán)增(RCA)是一種既能直接擴(kuò)增靶核酸，又能實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大擴(kuò)增的方法。但所有核酸擴(kuò)增方法在核酸檢測(cè)試劑應(yīng)用中令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。核酸檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用需要一套完整的解決方案，包含四個(gè)環(huán)節(jié):核酸試劑的保存，核酸提取、核酸擴(kuò)增，核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。在PCR方法誕生至今，部分環(huán)節(jié)存在一定的問題，導(dǎo)致核酸檢測(cè)產(chǎn)業(yè)一直停留在大型的實(shí)驗(yàn)室，執(zhí)行著很嚴(yán)格的管理措施。這些大型實(shí)驗(yàn)室按按國(guó)家衛(wèi)生部規(guī)定需要設(shè)置四個(gè)獨(dú)立操作區(qū)，分別是試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。這導(dǎo)致該技術(shù)不能廣泛地被基層醫(yī)院或工廠等單位使用。如何在這些環(huán)節(jié)上發(fā)展出新的技術(shù)，最終將核酸檢測(cè)技術(shù)從目前的三甲醫(yī)院普及到鄉(xiāng)村醫(yī)療所，地段醫(yī)院，從嚴(yán)格的大型實(shí)驗(yàn)室，普及到工廠或養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室，甚至移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室，讓核酸檢測(cè)不再依賴于昂貴的儀器和高要求的大型實(shí)驗(yàn)室，實(shí)現(xiàn)病原生物核酸檢測(cè)的POCT化，真正地將核酸檢測(cè)技術(shù)造福廣大人民群眾，是亟待解決的問題。核酸檢測(cè)試劑的運(yùn)輸保存一直是行業(yè)的難題。核酸擴(kuò)增試劑中包含酶、堿基、引物和探針，它們中的部分成分在常溫下不穩(wěn)定，長(zhǎng)期儲(chǔ)存需要-20 -70°C。商業(yè)化的核酸試劑在運(yùn)輸過程中基本采用_20°C的低溫方式。該方式運(yùn)輸成本高，當(dāng)運(yùn)輸距離較長(zhǎng)或操作不當(dāng)時(shí)，很容易導(dǎo)致產(chǎn)品的活性失效。這極大地阻礙了產(chǎn)品的分銷流轉(zhuǎn)和向基層單位的推廣。因此行業(yè)迫切需要一種核酸試劑常溫運(yùn)輸解決方案。核酸提取技術(shù)目前的主流方向?yàn)榘胱詣?dòng)化高通量和簡(jiǎn)單快速。自動(dòng)化高通量的核酸提取儀購(gòu)買和維護(hù)成本高，基層單位無法使用。簡(jiǎn)單快速的提取方法已有許多商業(yè)化產(chǎn)品，從原理上有三類產(chǎn)品:硅膠柱法、磁珠法和化學(xué)沉淀法，但這些方法在使用上都有一定的限制，如提取時(shí)間均在30min以上且操作繁瑣，此外硅膠柱法和磁珠法的核酸提取回收
率不高。 核酸擴(kuò)增后的產(chǎn)物生成量是以指數(shù)方式增加的，擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度極高。很容易在后續(xù)操作過程中污染空氣、試驗(yàn)器具和水，導(dǎo)致后續(xù)的核酸檢測(cè)出現(xiàn)假陽結(jié)果。為了解決污染問題，主要有兩種策略。第一種是在檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的過程中營(yíng)造密閉的環(huán)境，如:電泳在密閉的負(fù)壓房間內(nèi)進(jìn)行，實(shí)時(shí)熒光PCR的全過程不打開溶液管，按國(guó)家衛(wèi)生部對(duì)PCR試劑的要求，進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)，標(biāo)本制備區(qū)，擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)單方向流動(dòng)，避免發(fā)生交叉污染。各工作區(qū)必須安裝適當(dāng)?shù)呐棚L(fēng)設(shè)備確保空氣流向按單一方向。工作區(qū)的墻面、地面、辦公用品等必須選用耐消毒藥品腐蝕的材料。工作區(qū)必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。但這些方法措施都需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件和昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)施設(shè)備，不適合普及至基層用戶。第二種是在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用dUTP取代dTTP，并加入U(xiǎn)NG酶，將污染產(chǎn)物U-DNA中的尿嘧啶堿基降解，并在高溫變性條件下將U-DNA鏈徹底水解斷裂，消除由于污染產(chǎn)物造成的擴(kuò)增，保證擴(kuò)增結(jié)果的特異性，但這種方法需要變溫操作，步驟多，成本高，且存在一定的污染概率，限制了它的應(yīng)用。核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法包括凝膠電泳檢測(cè)，儀器的熒光或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，儀器的比濁檢測(cè)。但凝膠電泳的檢測(cè)速度慢靈敏度低且易造成環(huán)境污染，而通過熒光，化學(xué)發(fā)光，比濁等方法的檢測(cè)則需要特定儀器。儀器的檢測(cè)成本高昂操作繁瑣，基層單位人員不方便使用。Gerdes等(US2004/0110167)將側(cè)流層析技術(shù)應(yīng)用到核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)中，給核酸檢測(cè)在基層應(yīng)用帶來了希望。為了避免在核酸側(cè)流層析過程中產(chǎn)生污染，最佳的選擇是使用裝置將層析過程封閉起來。顧家永等(CN1888902)發(fā)明了一種封閉式核酸側(cè)流層析檢測(cè)裝置，該方法能提高檢測(cè)靈敏度，而且也初步解決了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的問題。但該裝置的缺點(diǎn)是:1、裝置體積大，不適合成品的規(guī)模生產(chǎn)與運(yùn)輸；2、裝置中的試紙條安裝復(fù)雜，不適合規(guī)模化的試紙裝配生產(chǎn)；3、本裝置再啟動(dòng)使用后，能被輕松簡(jiǎn)單而且沒有痕跡地重新打開，因此只是相對(duì)地實(shí)現(xiàn)了核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的封閉，如果被人無意開啟了反應(yīng)過的裝置，擴(kuò)增產(chǎn)物的污染就不可避免了 ；4、該裝置中只能完成單個(gè)反應(yīng)液的檢測(cè)，而無法檢測(cè)多個(gè)反應(yīng)液，即無法以多個(gè)反應(yīng)液的方式在一個(gè)試紙條上完成多重樣品的檢測(cè)。5、該裝置中的液體釋放是通過在注塑過程中預(yù)先定位安放的金屬刀片與針刺破反應(yīng)試管和稀釋液管做到的。這不利于環(huán)境保護(hù)，也增加的注塑 生產(chǎn)的難度與成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種常溫保存核酸擴(kuò)增試劑的方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種常溫保存的封閉式核酸層析試紙檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供一種利用上述試劑盒進(jìn)行核酸檢測(cè)的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:在本發(fā)明的一方面，提供了一種常溫保存核酸擴(kuò)增試劑的方法，將核酸擴(kuò)增試劑中的部分試劑或全部試劑，通過固化工藝轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，從而實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增試劑能在常溫下穩(wěn)定保存，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)試劑盒在常溫下穩(wěn)定保存。該方法是一種不同類型的核酸擴(kuò)增試劑在常溫保存的通用方法，原理是按照核酸擴(kuò)增試劑中不同組分在常溫中液態(tài)和固態(tài)的穩(wěn)定性加以區(qū)分，將常溫液態(tài)下不穩(wěn)定的組分干燥脫水轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，從而實(shí)現(xiàn)常溫下的穩(wěn)定。
進(jìn)一步地，所述核酸擴(kuò)增試劑用于從DNA或RNA模板啟動(dòng)核酸序列的擴(kuò)增，最終產(chǎn)生遠(yuǎn)高于模板起始濃度的且與模板互補(bǔ)或相同序列的RNA或DNA片段產(chǎn)物。核酸擴(kuò)增反應(yīng)包括:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-Time PCR)、鏈替代擴(kuò)增(SDA)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、依賴核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP )。進(jìn)一步地，所述核酸擴(kuò)增試劑的檢測(cè)物包括:RNA和DNA，所述核酸擴(kuò)增試劑的檢測(cè)樣本，包括:血液、組織、分泌物、菌液和牛奶等可以用核酸擴(kuò)增方法檢測(cè)的樣本。進(jìn)一步地，所述的常溫是指在9 45°C的溫度范圍內(nèi)，所述的穩(wěn)定保存是指至少保存3個(gè)月后，各試劑的生物、物理和化學(xué)等性能變異系數(shù)CV小于10%。本發(fā)明常溫保存核酸擴(kuò)增試劑方法包括核酸試劑的組分分類，固化保護(hù)劑和固化工藝三方面，具體方案如下:一、核酸試劑的組分分類，按照核酸擴(kuò)增試劑在常溫下的穩(wěn)定性，可以將核酸試劑中的組分歸為三類:組分A類:核酸擴(kuò)增試劑中能在常溫液態(tài)和固態(tài)下穩(wěn)定保存的組分，包括:水、Tris-HCl, MgSO4，甜菜堿，(NH4)2SO4, NaCl, MgCl2,曲拉通(Triton)；組分B類:核酸擴(kuò)增試劑中在常溫液態(tài)下不一定穩(wěn)定而在常溫固態(tài)下能穩(wěn)定保存的組分，包括:脫氧核苷三磷酸(dNTP)，引物、探針或其他核苷酸序列以及帶小分子標(biāo)記的引物、探針或其他核苷酸序列；組分C類:核酸擴(kuò)增試劑中在常溫液態(tài)下不穩(wěn)定而在固態(tài)下穩(wěn)定的組分，包括:Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、BstDNA聚合酶、T7RNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶。 為了實(shí)現(xiàn)核酸試劑的常溫保存，組分C類必須固化，組分B類根據(jù)在液態(tài)中的實(shí)際穩(wěn)定性選擇是否固化，組分A類即可在液態(tài)下保存又可選擇以固態(tài)形式保存。此外固化時(shí)，A、B、C三組分可混合固化也可單獨(dú)固化。例如，可以將所述組分A和所述組分B以液態(tài)形式穩(wěn)定儲(chǔ)存；或者，同時(shí)將組分B和組分C固化，將組分A以液態(tài)形式保存；或者，同時(shí)將組分A、組分B和組分C全部固化，整個(gè)核酸擴(kuò)增試劑以固體形式在常溫穩(wěn)定保存。二、固化保護(hù)劑，組分固化必須在固化保護(hù)劑的作用下進(jìn)行，固化保護(hù)劑中成分包括糖、蛋白、表面活性劑、抗氧化劑和防腐劑，具體成分如下:糖包括雙糖和多糖，如蔗糖或海藻糖，其使用的終濃度為體積比的0.5 20% ;蛋白包括動(dòng)物血清與動(dòng)、植物蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)、明膠、酪蛋白或牛血清，其使用的終濃度為體積比的0.1 15% ;所述的表面活性劑包括離子和非離子的表面活性劑，如吐溫或十二烷基苯磺酸鈉，其使用的終濃度為體積比的0.01 5% ;抗氧化劑如維生素、超氧化物歧化酶，其使用的終濃度為體積比的0.01 5% ;防腐劑如疊氮鈉、硫柳汞、Proclin300，其使用的終濃度為體積比的0.001 0.1%。三、固化工藝，所述固化工藝是指液態(tài)的核酸擴(kuò)增試劑組分在固化保護(hù)劑的存在下，通過物理干燥脫水的工藝變成固體。固化的方法包括:真空抽干、冷凍真空干燥和烘干，具體工藝為:真空抽干其工藝參數(shù)包括:真空度10 30KPa，濕度為10 35%RH，溫度為O 45°C，時(shí)間為I 2小時(shí)；冷凍真空干燥其工藝參數(shù)包括:預(yù)凍溫度-30 -50°C，預(yù)凍時(shí)間I 2小時(shí)，升 華溫度為-10 _30°C，升華過程為0.5 1.5小時(shí)升高I 3°C，凍干的真空度為5 30KPa ;烘干其工藝參數(shù)包括:濕度為10 35%RH，溫度為O 45°C，時(shí)間為I 4小時(shí)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種常溫保存的封閉式核酸層析試紙檢測(cè)試劑盒，該試劑盒是一套能在常溫運(yùn)輸保存、在一次性封閉式層析試紙裝置的核酸檢測(cè)試劑，實(shí)現(xiàn)核酸簡(jiǎn)單、快速提取，實(shí)現(xiàn)核酸的恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物能被免疫學(xué)的方法檢測(cè)，核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)封閉、快速和高靈敏，實(shí)現(xiàn)核酸試劑的常溫運(yùn)輸和保存，實(shí)現(xiàn)了核酸檢測(cè)的P0CT(即時(shí)檢驗(yàn)(point-of-care testing)化,為核酸檢測(cè)技術(shù)走向基層單位的廣泛普遍的使用打開了大門。該試劑盒包括:樣本的核酸提取試劑、能在常溫下保存的核酸擴(kuò)增試劑和封閉式層析試紙檢測(cè)裝置；所述封閉式核酸層析試紙檢測(cè)試劑盒是指在封閉式層析試紙檢測(cè)裝置中對(duì)常溫保存的核酸擴(kuò)增試劑的擴(kuò)增產(chǎn)物溶液通過免疫層析試紙實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)；所述核酸擴(kuò)增試劑采用上述常溫保存核酸擴(kuò)增試劑的方法進(jìn)行常溫保存；所述封閉式層析試紙檢測(cè)裝置，包括:免疫層析試紙和封閉式檢測(cè)裝置；其中免疫層析試紙被固定在封閉式檢測(cè)裝置中，被檢測(cè)樣品溶液不能同裝置外部的環(huán)境接觸。所述核酸擴(kuò)增試劑的檢測(cè)目標(biāo)對(duì)象包括:RNA和DNA ;所述核酸擴(kuò)增試劑用于從DNA或RNA模板啟動(dòng)核酸序列的擴(kuò)增，最終產(chǎn)生遠(yuǎn)高于模板起始濃度的且與模板互補(bǔ)或相同序列的RNA或DNA片段產(chǎn)物，核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法包括:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、鏈替代擴(kuò)增(SDA)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、依賴核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)、實(shí)時(shí)熒光定量環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP )。其中，核酸提取試劑的組分包括:I)裂解液，其組分為:0.1 0.2M pH8.0Tris-HCl，3 5M異硫氰酸胍，I 2MCTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，0.02 0.05M EDTA (乙二胺四乙酸)；2)洗滌液A，其組分為:體積百分比為90% 100%的異丙醇；3)洗滌液B，其組 分為:體積百分比為45% 50%的異丙醇；4)溶解液，其組分為:無RNAase (RNA酶)的去離子水；所述的核酸提取試劑，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且回收率高，能夠縮短和簡(jiǎn)化物理的提取步驟和時(shí)間。核酸擴(kuò)增試劑的方法包括:聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)、依賴核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。上述擴(kuò)增方法的引物和探針序列根據(jù)檢測(cè)針對(duì)的目標(biāo)基因所設(shè)計(jì)，引物和探針上標(biāo)記有小分子抗原，包括=FITC (異硫氰酸熒光素)、地高辛和生物素等小分子抗原。小分子抗原標(biāo)記能讓核酸擴(kuò)增產(chǎn)物能夠被免疫層析試紙條檢測(cè)到。所述的擴(kuò)增試劑中，因可以包含多條的標(biāo)記有小分子的引物和目的序列探針，能夠同時(shí)擴(kuò)增多條不同的目的核酸序列。所述核酸包括:RNA和DNA ;所述樣本，包括:血液、組織、分泌物、菌液和牛奶等需要進(jìn)行核酸檢測(cè)的樣本。所述核酸擴(kuò)增試劑，按照本發(fā)明公開的常溫保存方法進(jìn)行處理，能實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增試劑的常溫運(yùn)輸和保存。所述的免疫層析試紙條的組成如下:I)樣品墊:由玻璃纖維切割而成。
2)偶聯(lián)物墊:物理材料為玻璃纖維，將偶聯(lián)物顆粒溶液飽和浸泡或定量噴灑后干燥而成。所述的偶聯(lián)物顆粒是直徑為30 400nm的膠體金顆粒或乳膠顆粒。膠體金顆?；蛉槟z顆粒溶液中包含兩種顆粒:檢測(cè)線的膠體金顆粒或乳膠顆粒上標(biāo)記有抗-抗原的抗體或小分子抗原，包括但不限于:抗-FITC，抗-地高辛，鏈霉親和素；質(zhì)控線的膠體金顆?；蛉槟z顆粒上標(biāo)記有抗原或抗體，包括但不限于:兔IgG，鼠IgG.。進(jìn)一步的，同一膠體金顆?；蛉槟z顆粒中能包含幾種標(biāo)記了不同小分子抗原抗體的檢測(cè)線膠體金顆粒。膠體金顆粒的濃度為3 50D。3)硝酸纖維素膜:選用默克公司的135型或類似物理特性的硝酸纖維素膜，在檢測(cè)線位置包埋抗-抗原的抗體或小分子抗原，包括但不限于:抗-FITC，抗-地高辛，鏈霉親和素；在質(zhì)控線位置包埋了抗原或抗體，包括但不限于羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、抗雙鏈核酸抗體和抗單鏈核酸抗體。進(jìn)一步的，硝酸纖維素膜上可以包埋幾條不同小分子抗原抗體的檢測(cè)線。包埋蛋白的濃度為2 5mg/ml。4)吸水紙:由具備虹吸作用的濾紙切割而成。免疫層析試紙條中的檢測(cè)線偶聯(lián)物顆粒和硝酸纖維素膜檢測(cè)線上包埋的小分子抗原抗體能夠與前述核酸擴(kuò)增試劑的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的引物和探針上標(biāo)記的小分子抗原抗體特異性結(jié)合，形成的“偶聯(lián)物顆粒-核酸擴(kuò)增產(chǎn)物”免疫復(fù)合物能夠被硝酸纖維素膜檢測(cè)線上包埋的小分子抗原抗體捕獲，在免疫層析試紙條的檢測(cè)線上形成一條肉眼可見的橙紅色條帶。進(jìn)一步的，在免疫層析試紙條的幾條不同檢測(cè)線上，可以同時(shí)捕獲不同的“膠體金顆粒-核酸擴(kuò)增產(chǎn)物”，形成不同的幾條橙紅色條帶。所述封閉式層析試紙檢測(cè)裝置由溶液管，連接管和試紙管這三個(gè)組件裝配組成，I)溶液管:用于儲(chǔ)存核酸擴(kuò)增試劑和采用核酸提取試劑提取的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；該溶液管包括溶液管體和溶液管蓋子；所述溶液管管體內(nèi)壁圓周面上設(shè)有上下兩個(gè)凹槽，分別是溶液管內(nèi)部第一凹槽、溶液管內(nèi)部第二凹槽；所述溶液管蓋子的外周設(shè)有凸起密封環(huán)，該溶液管蓋子外周 凸起密封環(huán)與溶液管內(nèi)部第一凹槽、溶液管內(nèi)部第二凹槽都能配合密封，溶液管內(nèi)部第一凹槽能允許溶液管蓋子重復(fù)開啟，溶液管內(nèi)部第二凹槽則反向倒鉤住溶液管蓋子，使其在一次性受壓入位后形成封閉環(huán)境，不容易被再次打開；所述溶液管管體外周設(shè)有溶液管外部凹槽，能與連接管對(duì)應(yīng)接口內(nèi)設(shè)的凸起密封環(huán)配合形成反向倒鉤結(jié)構(gòu)，形成封閉環(huán)境而不容易被打開；所述溶液管管體底部設(shè)有底部結(jié)構(gòu)，它外周邊緣設(shè)底部切痕，當(dāng)?shù)撞拷Y(jié)構(gòu)受到一定作用力時(shí)，它從底部切痕處斷裂脫離，此時(shí)預(yù)先分裝在溶液管內(nèi)的樣品溶液能夠從斷裂縫隙流出；2)連接管:用于將溶液管和試紙管密閉連接起來，并促使釋放溶液管中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液；所述連接管上設(shè)有一個(gè)或多個(gè)與所述溶液管下部管體外形匹配的沉孔形接口 ；所述沉孔形接口內(nèi)設(shè)有溶液管凸起密封環(huán)，能與插入接口的溶液管外部凹槽配合形成反向倒鉤結(jié)構(gòu)，形成封閉環(huán)境而不容易被再次打開；該連接管上還設(shè)有一個(gè)或多個(gè)與試紙管匹配的接口，該接口內(nèi)設(shè)有試紙管凸起密封環(huán)，該試紙管凸起密封環(huán)與插入接口的試紙管外部凹槽配合成反向倒鉤密封結(jié)構(gòu)而不容易被打開；連接管沉孔形接口底部設(shè)有溶液釋放結(jié)構(gòu)，它對(duì)溶液管底部結(jié)構(gòu)給予特定作用力即可將其斷裂脫離，溶液從溶液管釋放出來；連接管溶液釋放結(jié)構(gòu)底部設(shè)有溶液通道，溶液管釋放出來的液體將經(jīng)過溶液通道流到試紙管中的層析試紙的樣品溶液接收區(qū)；
3)試紙管:用于固定免疫層析試紙；所述試紙管是一端開口的中空長(zhǎng)管；試紙管的開口端設(shè)有試紙管凸起卡槽，用于安裝免疫層析試紙條時(shí)卡住并固定免疫層析試紙條；試紙管在插入連接管的接口部位設(shè)有試紙管外部凹槽，該外部凹槽與連接管內(nèi)壁設(shè)的試紙管凸起密封環(huán)配合后反向倒鉤形成封閉環(huán)境，不容易被再次打開。進(jìn)一步地，所述的封閉式層析裝置的溶液管的蓋子上設(shè)有一沉孔形空腔，在該沉孔形空腔內(nèi)可插入另一個(gè)溶液管下部管體形成疊加套管結(jié)構(gòu)，并釋放出核酸擴(kuò)增完成的反應(yīng)液，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多管擴(kuò)增完成的反應(yīng)液；所述溶液管蓋子的沉孔形空腔底部設(shè)有溶液釋放結(jié)構(gòu)，溶液釋放結(jié)構(gòu)底部設(shè)有溶液通道；所述溶液管體下部外圓周面設(shè)有外部凹槽；靠近蓋子頂部的溶液管蓋子內(nèi)壁面設(shè)有凸起密封環(huán)，該凸起密封環(huán)與插入蓋子沉孔形空腔內(nèi)的另一個(gè)溶液管的外部凹槽配合后形成反向倒鉤密封結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步地，所述試紙管末端部位設(shè)有環(huán)形凹槽，在用力達(dá)到一定程度時(shí)，能從此環(huán)形凹槽部分折斷試紙管，便于對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行污染消除處理。所述的核酸檢測(cè)試劑，使得核酸擴(kuò)增產(chǎn)物能夠在封閉的裝置中，無污染的進(jìn)行膠體金層析檢測(cè)。另外，在本發(fā)明的另一方面，還公開了一種利用上述核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行核酸檢測(cè)的方法，包括步驟: ( I)采用核酸提取試劑 進(jìn)行核酸提取a、取100 150 μ I的液體樣本，加入300 400 μ I裂解液，震蕩混勻后室溫靜置I 2min ；b、加入350 400 μ I洗滌液Α，震蕩混勻后以10000 12000rpm離心3 5min，
棄上清；C、加入350 400 μ I的洗滌液B，震蕩洗滌使絮狀物溶解，隨后以10000 12000rpm離心I 2min,棄上清,得沉淀；d、沉淀于室溫干燥(約2 3min干燥完全)，加入8 μ I的溶解液將沉淀溶解； 個(gè)過程耗時(shí)約IOmin)(2 )采用核酸擴(kuò)增試劑進(jìn)行DNA或RNA擴(kuò)增:將核酸擴(kuò)增試劑中的液體試劑用移液槍或者一次滴管移至固體試劑的溶液管，充分溶解形成核酸擴(kuò)增反應(yīng)液，依照不同的核酸擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，隨后恢復(fù)室溫終止核酸擴(kuò)增。(3 )利用核酸封閉式檢測(cè)試劑進(jìn)行DNA或RNA檢測(cè):a.將試紙管連帶試紙插進(jìn)連接管與其匹配的接口中，密封不可拔出；b.將結(jié)束擴(kuò)增的溶液管插入水平放置的封閉式層析卡連接管中通過旋轉(zhuǎn)溶液管，溶液管底部凸起斷裂脫落，繼續(xù)完全插入溶液管，使溶液管外部凹槽與第一連接管凸起密封環(huán)配合形成倒鉤結(jié)構(gòu)，該溶液管將被該倒鉤結(jié)構(gòu)反向頂住呈不可拔出且密封狀態(tài)；c.擴(kuò)增完的核酸擴(kuò)增反應(yīng)液由溶液管底部和呈打開狀態(tài)的連接管內(nèi)部的切痕片流到免疫層析試紙條上，開始核酸的膠體金層析免疫學(xué)檢測(cè)。d.從液體出現(xiàn)在硝酸纖維素膜上起開始計(jì)時(shí)，5min后免疫層析結(jié)束判定結(jié)果，在質(zhì)控線有可見條帶的前提下，檢測(cè)線出現(xiàn)條帶說明檢測(cè)結(jié)果為陽性，檢測(cè)線沒有條帶說明檢測(cè)結(jié)果為陰性。
進(jìn)一步地，在步驟(3)之后增加如下核酸擴(kuò)增產(chǎn)物無害化處理步驟:將使用完畢后的封閉式層析試紙檢測(cè)裝置在試紙管的環(huán)形凹槽處折斷，同時(shí)將溶液管蓋子沉孔形空腔底部的切痕片頂壓破裂，然后把全部組件浸入納米二氧化鈦溶液中，然后在紫外光的照射下降解封閉式層析試紙裝置中的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。所述納米二氧化鈦包括:金紅石型、銳礦型，納米二氧化鈦溶液的濃度為:0.5 5mg/ml ;所述的紫外光波長(zhǎng)范圍是200 420nm，照射時(shí)間為2 48小時(shí)。再者，本發(fā)明還公開了上述核酸檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，如在包括食品安全、動(dòng)物疫病和人類疾病檢測(cè)中的應(yīng)用，其中，檢測(cè)目標(biāo)包括:細(xì)菌、病毒、細(xì)胞以及包含核酸片段和序列的物質(zhì)。本發(fā)明可解決以下的技術(shù)問題:1、實(shí)現(xiàn)核酸試劑的常溫運(yùn)輸和保存。目前的商業(yè)化核酸檢測(cè)試劑均采用低溫運(yùn)輸?shù)姆绞剑杀靖甙簵l件苛刻，限制了運(yùn)輸流轉(zhuǎn)和向基層推廣，此外低溫運(yùn)輸過程中的條件不當(dāng)，會(huì)損害核酸試劑的性能，增加檢測(cè)的不準(zhǔn)確性。2、實(shí)現(xiàn)核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物能被免疫學(xué)的方法檢測(cè)?，F(xiàn)有的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)沒有特殊的設(shè)計(jì)，擴(kuò)增產(chǎn)物無法用簡(jiǎn)單、快捷、便宜的免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，而通過化學(xué)發(fā)光或比濁的方法檢測(cè)核酸需要昂貴的儀器，不適合在基層普及。3、核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)封閉、快速和高靈敏。傳統(tǒng)的核酸電泳檢測(cè)過程易污染環(huán)境并且耗時(shí)，操作繁瑣，而采用負(fù)壓的環(huán)境電泳、加入熒光探針不開蓋的發(fā)光或比濁檢測(cè)、UNG酶策略雖然能降低污染概率，但使用成本高不適合在基層使用，而通過核酸染料染色的檢測(cè)因靈敏度低不能滿足要求。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有的技術(shù)問題，創(chuàng)新如下:本發(fā)明中，實(shí)·現(xiàn)了核酸檢測(cè)試劑的常溫運(yùn)輸保存。將核酸檢測(cè)試劑盒中的組分按照常溫下的穩(wěn)定性分類制備，在常溫下穩(wěn)定的組分以液態(tài)形式儲(chǔ)存，在常溫下不能穩(wěn)定保存的組分則通過真空干燥技術(shù)配合干燥保護(hù)劑脫水固體，固體后的組分能夠在常溫下穩(wěn)定儲(chǔ)存，因而實(shí)現(xiàn)了整個(gè)核酸檢測(cè)試劑盒在常溫下的穩(wěn)定儲(chǔ)存。此外，常規(guī)的蛋白或抗體固體程序需要使用昂貴的凍干機(jī)在冷凍干燥的過程中完成，本發(fā)明的核酸試劑固體過程只需要的簡(jiǎn)單的設(shè)備即可達(dá)到目的。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)增產(chǎn)物在一次性封閉式層析裝置中進(jìn)行檢測(cè)。該一次性封閉式層析裝置由溶液管，連接管和試紙管這三個(gè)體積小巧的組件裝配組成，組裝出的裝置能實(shí)現(xiàn)完全封閉，能完全阻斷層析試紙的樣品對(duì)操作人員的危害和環(huán)境的污染。該裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單易于批量注塑生產(chǎn)，也易于免疫層析試紙條的批量組裝生產(chǎn)；能實(shí)現(xiàn)在一個(gè)裝置中能通過物理組合的方式檢測(cè)多種樣品溶液；裝置中樣品液的釋放不需要任何金屬部件。本發(fā)明試劑盒的核酸提取試劑在沉淀法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，優(yōu)化了裂解液配方，減少了離心次數(shù)和時(shí)間，去除了一些不必要的步驟，最終的操作時(shí)間在IOmin內(nèi)。本發(fā)明的核酸擴(kuò)增進(jìn)行了改進(jìn):在引物上標(biāo)記了小分子抗原A，同時(shí)引入一條能與擴(kuò)增序列雜交的探針，并在探針的5’端標(biāo)記小分子抗原B。這樣的設(shè)計(jì)使得擴(kuò)增后的產(chǎn)物能用免疫學(xué)的方法捕獲檢測(cè)，通過免疫學(xué)的方法檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物既快速又靈敏。本發(fā)明中，核酸擴(kuò)增包括RNA和DNA的擴(kuò)增，均采用恒溫的方法一步完成。DNA的擴(kuò)增時(shí)間為15min-30min,RNA的擴(kuò)增時(shí)間為45min-90min。核酸擴(kuò)增通過精細(xì)的引物設(shè)計(jì)能夠?qū)崿F(xiàn)一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行兩種或兩種以上的目的核酸片段擴(kuò)增，同時(shí)能設(shè)計(jì)兩種或兩種以上的帶小分子抗原標(biāo)記的特異性探針與兩種或兩種以上的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。免疫層析試紙條中，偶聯(lián)物顆粒偶聯(lián)了抗-抗原A的抗體，硝酸纖維素膜上包埋了抗-抗原B的抗體，這樣的設(shè)計(jì)能夠?qū)崿F(xiàn)雙抗體夾心捕獲前述帶有抗原標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物。免疫層析試紙條的硝酸纖維素膜上能夠包埋兩種或兩種以上的抗-抗原單克隆抗體，因此，能夠捕獲兩種或兩種以上的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:1、核酸試劑的保存:商品化的核酸試劑均要求在低溫下運(yùn)輸，這種方式成本高昂且限制了運(yùn)輸?shù)陌霃?，許多基層地區(qū)不能提供如此苛刻的運(yùn)輸條件。本發(fā)明采用特有的固體技術(shù)，將試劑中在常溫下不穩(wěn)定的組分固體，實(shí)現(xiàn)試劑盒整體能夠在常溫下運(yùn)輸保存，便于將核酸試劑運(yùn)輸?shù)交鶎邮褂谩?、核酸提取環(huán)節(jié):現(xiàn)有的手工核酸提取技術(shù)操作復(fù)雜，提取一個(gè)樣本的耗時(shí)超過30min。本發(fā)明的提取技術(shù)，優(yōu)化了配方簡(jiǎn)化了步驟，在保證相同提取效率的情況下，將時(shí)間縮短到IOmin內(nèi)，有利于在基層使用。3、核酸擴(kuò)增環(huán)節(jié):將引物標(biāo)記小分子抗原，并將標(biāo)記小分子抗原的探針引入核酸擴(kuò)增體系，使得擴(kuò)增產(chǎn)物能用免疫層析的方法檢測(cè)，較電泳法提高了核酸檢測(cè)的靈敏度且縮短了檢測(cè)的時(shí)間和步驟，較熒光或比濁法消除了對(duì)儀器的依賴。此外通過不同的引物和探針標(biāo)記不同的小分子，能實(shí)現(xiàn)一個(gè)反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增幾種目的核酸序列。4、核酸檢測(cè)環(huán)節(jié):普通的核酸電泳檢測(cè)技術(shù)容易導(dǎo)致環(huán)境污染并且耗時(shí)，采取措施避免污染環(huán)境的核酸技術(shù)需要良好的試驗(yàn)條件和昂貴的儀器設(shè)備。本發(fā)明的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)試劑將免疫層析試紙和封閉式層析裝置結(jié)合，使得核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)在5分鐘內(nèi)完成，并且全過程封閉無污染，靈敏度較電泳檢測(cè)高且費(fèi)用低廉，因此便于在基層使用。5、根據(jù)基層單位的需求和試驗(yàn)條件，將核酸檢測(cè)過程的主要環(huán)節(jié)和試劑改進(jìn)，分別實(shí)現(xiàn)了核酸提取過程、核酸 擴(kuò)增過程和核酸檢測(cè)過程的快速、簡(jiǎn)單和準(zhǔn)確，并且實(shí)現(xiàn)了核酸試劑在常溫下的保存運(yùn)輸。將這些環(huán)節(jié)的新型技術(shù)整合成一種新型的核酸檢測(cè)試劑盒，能夠促進(jìn)基層單位普及使用先進(jìn)的核酸檢測(cè)技術(shù)，提升基層診斷工作的準(zhǔn)確性?？傊景l(fā)明在核酸試劑的保存運(yùn)輸環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)了常溫，核酸提取環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便快速，核酸擴(kuò)增環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)了與免疫學(xué)檢測(cè)的結(jié)合，核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)的環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)了快速和封閉無污染。本發(fā)明的核酸檢測(cè)試劑盒集中這些優(yōu)勢(shì)，能夠便于在基層使用。


下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明:圖1是本發(fā)明實(shí)施例1封閉式層析裝置的裝配示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的溶液管的結(jié)構(gòu)示意圖(在溶液管蓋子打開狀態(tài)下);圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的溶液管管體剖視圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例2的溶液管蓋子剖視圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例1的連接管的結(jié)構(gòu)示意圖；圖6是本發(fā)明實(shí)施例1的連接管剖視圖；圖7是本發(fā)明實(shí)施例1的試紙管的結(jié)構(gòu)示意圖8是本發(fā)明實(shí)施例1的轉(zhuǎn)配圖剖視圖；圖9是本發(fā)明實(shí)施例2的溶液管疊用剖視圖；圖10是本發(fā)明圖8和圖9中的幾處密封防拔出配合局部剖視圖；圖11是本發(fā)明實(shí)施例3的溶液管管體剖視圖；圖12是本發(fā)明實(shí)施例3的連接管的結(jié)構(gòu)示意圖；圖13是本發(fā)明實(shí)施例3的裝配示意圖；圖14是本發(fā)明實(shí)施例4的試紙管的結(jié)構(gòu)示意圖；圖15是本發(fā)明實(shí)施例10和實(shí)施例11的樣品檢測(cè)結(jié)果圖；其中，圖15A為陰性樣品檢測(cè)結(jié)果圖，圖15B為陽性樣品檢測(cè)結(jié)果圖；圖16是本發(fā)明實(shí)施例12的樣品檢測(cè)結(jié)果圖；其中，圖16A為陰性樣品檢測(cè)結(jié)果圖，圖16B為陽性樣品檢測(cè)結(jié)果圖；圖17是本發(fā) 明實(shí)施例13的樣品檢測(cè)結(jié)果圖；其中，圖17A表示經(jīng)二氧化鈦溶液紫外照射處理過的樣本，圖17B表不未處理過的樣本。圖中附圖標(biāo)記說明如下:1、溶液管，U、溶液管管體，12、溶液管蓋子，111、溶液管底部凸起，112、溶液管外部凹槽，113A、溶液管內(nèi)部第一凹槽，113B、溶液管內(nèi)部第二凹槽，114、溶液管底部切痕，121、溶液管蓋子外周凸起密封環(huán)，122、溶液管蓋子內(nèi)部凸起密封環(huán)，123、溶液管蓋子切痕片，124、凹坑，125、沉孔形空腔，13、溶液管連接條。2、連接管，21、溶液管凸起密封環(huán)，22、試紙管凸起密封環(huán)，23、連接管斜坡，24、連接管底部切痕片，25、凹坑，25A、凸起部分，25B、溶液通道孔，26、沉孔形接口，27、接口。3、試紙管，31、試紙管外部凹槽，32、試紙管凸起斜板，33、試紙管凸起卡槽，為安裝試紙時(shí)卡住試紙的作用，34、環(huán)形凹槽。4、試紙。21-112表示連接管上部凸起21與溶液管外部凹槽112配合處；同理121-113B、22-31,112-122均為二者配合處。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的進(jìn)行詳細(xì)的描述。本發(fā)明封閉式層析裝置的結(jié)構(gòu)如圖1-13所示，以下列舉實(shí)施例1-3具體說明。實(shí)施例1如圖1所示，本發(fā)明包括一種由多個(gè)組件裝配成的導(dǎo)引液體流動(dòng)到密閉空間中的側(cè)流層析試紙上進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)的裝置。三個(gè)組件分別是疊加式可密封反應(yīng)溶液管(以下簡(jiǎn)稱溶液管1)，可密封連接管(以下簡(jiǎn)稱連接管2)，可密封試紙管(以下簡(jiǎn)稱試紙管3)。溶液管I可以是一個(gè)或多個(gè)，在圖1所示的實(shí)施例中，溶液管I采用2個(gè)。如圖2所示,溶液管I包括溶液管管體11和溶液管蓋子12,溶液管管體11和溶液管蓋子12之間通過溶液管連接條13連接；溶液管管體11從下至上包括溶液管底部凸起111，溶液管外部凹槽112，溶液管內(nèi)部凹槽113 ;溶液管管體11分為底部、下部和上部，溶液管管體11上部的直徑大于溶液管管體11下部的直徑；溶液管管體11底部設(shè)有溶液管底部結(jié)構(gòu)，在本實(shí)施例中，該溶液管底部結(jié)構(gòu)設(shè)為溶液管底部凸起111，溶液管底部凸起111的外周設(shè)有溶液管底部切痕114，當(dāng)該溶液管底部凸起111受到一定作用力時(shí)，它從底部切痕114處斷裂脫離，此時(shí)預(yù)先分裝在溶液管I內(nèi)的樣品溶液能夠從斷裂縫隙流出；溶液管管體11下部外周設(shè)有溶液管外部凹槽112，溶液管管體11上部?jī)?nèi)壁圓周上設(shè)有溶液管內(nèi)部凹槽113 ;溶液管蓋子12的外周靠近底部位置設(shè)有溶液管蓋子外周凸起密封環(huán)121。如圖3所示，溶液管管體11上部?jī)?nèi)壁圓周上設(shè)有上下兩個(gè)凹槽，分別是溶液管內(nèi)部第一凹槽113A、溶液管內(nèi)部第二凹槽113B，所述溶液管蓋子12的外周設(shè)有凸起密封環(huán)121，該溶液管蓋子外周凸起密封環(huán)121與溶液管內(nèi)部第一凹槽113、溶液管內(nèi)部第二凹槽113B都能配合密封(例如，見圖8中121-113B，溶液管蓋子外周凸起密封環(huán)121與溶液管內(nèi)部凹槽113B配合固定)，溶液管蓋子12在蓋合過程中溶液管蓋子外周凸起密封環(huán)121先與溶液管 內(nèi)部第一凹槽113A配合，第二次按壓后溶液管蓋子12還能再按壓一段行程與溶液管內(nèi)部第二凹槽113B配合，最終蓋合狀態(tài)呈不可拔出且密封狀態(tài)(內(nèi)部液體不會(huì)發(fā)生泄漏現(xiàn)象)。溶液管內(nèi)部第一凹槽113A能允許溶液管蓋子12重復(fù)開啟，溶液管內(nèi)部第二凹槽113B則反向倒鉤住溶液管蓋子12，使其在一次性受壓入位后形成封閉環(huán)境，不能被再次打開。如圖3所示，溶液管管體11底部設(shè)有溶液管底部凸起111，溶液管底部凸起111與溶液管管體11連接處設(shè)有溶液管底部切痕114，當(dāng)溶液管旋轉(zhuǎn)時(shí)，該溶液管底部凸起111將受阻不能旋轉(zhuǎn)而從溶液管底部切痕114處斷裂脫離，此時(shí)預(yù)先分裝在溶液管I內(nèi)的樣品溶液能夠從斷裂縫隙流出。所述溶液管底部切痕114為一帶線狀或點(diǎn)狀，切痕部位的塑料材質(zhì)厚度比其他部位的厚度少0.05-0.5mm ;當(dāng)溶液管旋轉(zhuǎn)而其底部凸起111被卡住時(shí)，切痕部位的扭力耐受值較其他部位低，因此溶液管底部凸起111將從切痕部位斷裂。如圖5和圖6所示，連接管2上設(shè)有一個(gè)或多個(gè)與溶液管I匹配的沉孔形接口 26(圖5和圖6中顯示2個(gè)接口)，該2個(gè)沉孔形接口 26內(nèi)均設(shè)有溶液管凸起密封環(huán)21 (溶液管凸起密封環(huán)21能與插入接口的溶液管外部凹槽112配合固定形成反向倒鉤結(jié)構(gòu)，形成密封環(huán)境而不能被打開，見圖8中21-112);該2個(gè)沉孔形接口 26內(nèi)底部設(shè)有溶液釋放結(jié)構(gòu)，它對(duì)溶液管底部結(jié)構(gòu)給予特定作用力即可將其斷裂脫離，溶液從溶液管釋放出來；連接管溶液釋放結(jié)構(gòu)底部設(shè)有溶液通道，溶液管釋放出來的液體將經(jīng)過溶液通道流到試紙管中的層析試紙的樣品溶液接收區(qū)。在本實(shí)施例中，所述連接管底部溶液釋放結(jié)構(gòu)設(shè)為供溶液管底部凸起111插入并嵌合的凹坑25，該凹坑25能與溶液管底部凸起111相互作用，使溶液管的溶液釋放出來；所述溶液通道采用底部切痕片24，它將連接管沉孔形接口 26與試紙管接口 27隔斷為兩個(gè)獨(dú)立空間；當(dāng)?shù)撞壳泻燮?4受到頂壓時(shí)，它從有切痕的部位開始斷裂出縫隙形成溶液通道，當(dāng)溶液管釋放的液體將經(jīng)過此處流到試紙管中的層析試紙的樣品溶液接收區(qū)；該凹坑25與溶液管底部凸起111的形狀嵌合，可以是一字形或十字形或其它與溶液管底部凸起111嵌合的形狀，當(dāng)溶液管進(jìn)行一定角度的旋轉(zhuǎn)時(shí)，溶液管底部凸起111將被嵌合的凹坑25卡住而不能旋轉(zhuǎn)，因而從溶液管底部切痕114處斷裂后釋放出液體；當(dāng)溶液管底部凸起111繼續(xù)插入時(shí)，連接管底部切痕片24有切痕的部位全部斷裂；連接管底部切痕片24的切痕部位的塑料材質(zhì)厚度比其他部位的厚度少0.05-0.2mm，該連接管底部切痕片24為帶線狀或點(diǎn)狀切痕的圓形或方形片當(dāng)插入連接管底部的溶液管底部凸起111按壓連接管底部切痕片24時(shí)，切痕部位的張力耐受值較其他部位低，因此連接管底部切痕片24從切痕某個(gè)部位開始斷裂；當(dāng)溶液管底部凸起111繼續(xù)插入時(shí)，連接管底部切痕片24有切痕的部位全部斷裂。如果從上部插入的溶液管底部被擰斷，其內(nèi)部的液體將從該連接管2底部斷裂的切痕片24間隙流入連接管2內(nèi)部。連接管2上還設(shè)有一個(gè)與試紙管3匹配的接口 27，該接口 27內(nèi)設(shè)有試紙管凸起密封環(huán)22 (試紙管凸起密封環(huán)22與試紙管外部凹槽31配合固定，形成反向倒鉤結(jié)構(gòu)，使受力后被插入連接管的試紙管入位后形成密封環(huán)境而不能被打開，見圖8中22-31)，在連接管2內(nèi)部，位于試紙管3匹配的接口 27與溶液管I匹配的沉孔形接口 26的連接部位設(shè)有一連接管斜坡23，在試紙管3插入連接管2時(shí)，該試紙管凸起斜板32將被頂一定角度，將試紙4托起一定高度后頂?shù)竭B接管斜坡23。如圖7所示，試紙管3是一端開口的中空長(zhǎng)管，其開口端兩側(cè)面設(shè)有試紙管凸起卡槽33，起到安裝試紙4時(shí)卡住并固定試紙4的作用，試紙管3開口端底面設(shè)有試紙管凸起斜板32(見圖8)。在插入連接管2的試紙管3匹配部位上還設(shè)有試紙管外部凹槽31，試紙管外部凹槽31與試紙管凸起密封環(huán)22配合固定(見圖8)。試紙4由試紙管3開口處插入，完全插入后，在試紙管3開口處按壓試紙4卡在試紙管凸起卡槽33之間，不會(huì)脫落或晃動(dòng)，試紙管3連帶試紙4插入連接管2與其匹配的接口 27，試紙管3的試紙管凸起斜板32受到連接管2的擠壓將被頂起一定角度，將試紙4托起一定高度后頂?shù)竭B接管斜坡23，使試紙4表面受壓而控制液體樣品的流動(dòng)速度(見圖9)。試紙管外部凹槽31與試紙管凸起密封環(huán)22配合固定(見圖8中22-31)，且密封不可拔出(內(nèi)部液體不會(huì)發(fā)生泄漏現(xiàn)象)。圖10是圖8和圖9中的幾處密封防拔出配合局部剖視圖，如圖8、9、10所示，溶液管凸起密封環(huán)21和溶液管外部凹槽112配合卡扣；溶液管蓋子外周凸起密封環(huán)121與溶液管內(nèi)部第二凹槽113B配合卡扣，試紙管凸起密封環(huán)22與試紙管外部凹槽31配合卡扣，溶液管蓋子內(nèi)部凸起密封環(huán)122與溶液管外部凹槽112配合卡扣，這幾處配合卡扣處的凸起和凹槽配合不易拔出，凸起和下面的弧形凸起能夠密封，使內(nèi)部液體不會(huì)發(fā)生泄漏現(xiàn)象。溶液管內(nèi)部第一凹槽113A、溶液管內(nèi)部第二凹槽113B、溶液管外部凹槽112和試紙管外部凹槽31均為環(huán)形凹槽。該實(shí)施例在使用時(shí)，如圖8所示，以溶液管I采用2個(gè)為例，本發(fā)明裝置的使用方法，包括如下步驟: 1、首先，將試紙4安裝在試紙管3內(nèi)(即將試紙4由試紙管3開口處插入，完全插入后，在試紙管3開口處按壓試紙4卡在試紙管凸起卡槽33之間，不會(huì)脫落或晃動(dòng))，然后將試紙管3帶有試紙4的一端插進(jìn)連接管2與試紙管3匹配的接口中，試紙管3的試紙管凸起斜板32受到連接管2接口內(nèi)部結(jié)構(gòu)的擠壓彈起且不會(huì)斷裂。彈起的試紙管凸起斜板32與連接管2接口內(nèi)的連接管斜坡23 —起擠壓試紙4，試紙4變形呈有一段拱起狀，將留下的試液阻止在一定范圍內(nèi)，試紙管外部凹槽31與試紙管凸起密封環(huán)22配合固定(見圖8中22-31)，且密封不可拔出(內(nèi)部液體不會(huì)發(fā)生泄漏現(xiàn)象)。2、將放有試液的溶液管的蓋子蓋起(即在溶液管管體11內(nèi)放入試液,并將溶液管蓋子12蓋入溶液管管體11內(nèi))，溶液管蓋子外周凸起密封環(huán)121與溶液管內(nèi)部第一凹槽113A配合。3、將上述溶液管I安裝在連接管2上(即將溶液管I插入連接管2中與其匹配的沉孔形接口 26中)，溶液管底部凸起111頂觸并擠壓連接管底部切痕片24，連接管底部切痕片24受力后開裂呈打開狀態(tài)，連接管底部切痕片24在溶液管底部凸起111的壓力下從一端開始斷裂，最終呈向下彎折狀，通過旋轉(zhuǎn)溶液管1，溶液管底部凸起111斷裂脫落(溶液管底部凸起111與溶液管管體11連接處設(shè)有溶液管底部切痕114，當(dāng)旋轉(zhuǎn)溶液管I時(shí)，溶液管底部切痕114處完全斷裂，溶液管底部凸起111從溶液管底部切痕114處脫落)，繼續(xù)完全插入溶液管I后，使其溶液管外部凹槽112與溶液管凸起密封環(huán)21配合形成倒鉤結(jié)構(gòu)，該溶液管I將被接口內(nèi)的倒鉤結(jié)構(gòu)反向頂住呈不可拔出且密封狀態(tài)(內(nèi)部液體不會(huì)發(fā)生泄漏現(xiàn)象，在普通人單手操作情況下不能被反向拔出，即使雙手反向也需要相對(duì)費(fèi)力才可能抽出(見圖8)。4、如步驟2、3在連接管另一個(gè)沉孔形接口 26中安裝另一個(gè)溶液管。5、分別按壓兩個(gè)溶液管的蓋子，使溶液管蓋子外周凸起密封環(huán)121與溶液管內(nèi)部第二凹槽113B配合，溶液管內(nèi)的溶液被擠壓由溶液管底部凸起111斷裂的縫隙向下流動(dòng)，經(jīng)過呈打開狀態(tài)的連接管底部切痕片24，導(dǎo)流到下面的試紙4上，最終來自兩個(gè)溶液管的樣品溶液在兩個(gè)位置分別流到試紙條上完成相關(guān)反應(yīng)并顯示出顏色/熒光等信號(hào)，至此完成測(cè)試。此外，以本發(fā)明裝置采用一個(gè)溶液管為例，其使用方法包括如下步驟:步驟1，試紙4插入安裝在試紙管3內(nèi)，試紙管凸起卡槽33卡住試紙4，試紙管3連帶試紙4插進(jìn)連接管與其匹配的接口 27中，試紙管外部凹槽31與試紙管凸起密封環(huán)22配合后反向倒鉤密封不可拔出；步驟2,在溶液管管體11內(nèi)放入樣品溶液,并將溶液管蓋子12蓋入溶液管管體11內(nèi)，溶液管蓋子外周凸起密封環(huán)121與溶液管內(nèi)部第一凹槽113A配合；步驟3，將上述溶液管插入連接管的沉孔形接口 26中，溶液管底部凸起111頂觸并按壓連接管底部切痕片24，切痕片24受力后開裂呈打開狀態(tài)，通過旋轉(zhuǎn)溶液管，溶液管底部凸起111從連接管底部的環(huán)形切痕斷裂，繼續(xù)插入溶液管，使溶液管外部凹槽112與溶液管凸起密封環(huán)21配合形成倒鉤結(jié)構(gòu)，該溶液管將被該倒鉤結(jié)構(gòu)反向頂住呈不可拔出且密封狀態(tài)；步驟5，按壓溶液管的蓋子，使其蓋子的外周凸起密封環(huán)121與溶液管內(nèi)部第二凹槽113B配合，溶液管內(nèi)的溶液被擠壓由溶液管底部突起部分111斷裂的縫隙向下流動(dòng)，經(jīng)過呈打開狀態(tài)的連接管內(nèi)部的切痕片24導(dǎo)流到下面的試紙上，溶液管的樣品溶液流到試紙條上完成相關(guān)反應(yīng)并顯示出顏色/熒光等信號(hào)，至此完成測(cè)試。實(shí)施例2在需要兩種試液混合反應(yīng)后測(cè)試時(shí)，需要兩個(gè)溶液管疊加，本發(fā)明裝置可以采用另外一種結(jié)構(gòu)，如圖4所示，溶液管蓋子12上部可以設(shè)一沉孔形空腔125，該沉孔形空腔125內(nèi)可插入另一個(gè)溶液管(見圖9);溶液管蓋子12的沉孔形空腔125底部設(shè)有溶液管蓋子切痕片123及供溶液管底部凸起111插入并嵌合的凹坑124。溶液管底部凸起111與凹坑124呈一字形或十字形或其他形狀的互相嵌合結(jié)構(gòu)；溶液管蓋子12的外周靠近蓋子底部位置設(shè)有溶液管蓋子外周凸起密封環(huán)121，溶液管蓋子12的內(nèi)壁靠近蓋子頂部位置設(shè)有溶液管蓋子內(nèi)部凸起密封環(huán)122(溶液管蓋子內(nèi)部凸起密封環(huán)122與插入蓋子沉孔形空腔125內(nèi)并將溶液管蓋子切痕片123頂開呈打開狀的另一個(gè)溶液管的溶液管外部凹槽112配合固定，形成反向倒鉤結(jié)構(gòu)，形成密封環(huán)境而不能被打開，見圖9中的112-122)。溶液管蓋子切痕片123切痕部位塑料材質(zhì)厚度比其他部位的厚度少0.05-0.2mm，該切痕可以為一帶缺口的環(huán)形線狀或點(diǎn)狀切痕 的塑料片，環(huán)形的缺口部分的厚度沒有變化；當(dāng)插入連接管底部的溶液管底部凸起111按壓切痕片123時(shí)，切痕部位的張力耐受值較其他部位低，因此切痕片123從切痕某個(gè)部位開始斷裂；當(dāng)溶液管底部凸起111繼續(xù)插入時(shí)，切痕片123有切痕的部位全部斷裂，厚度沒有改變的切痕缺口部分不會(huì)斷裂。如圖9所示，在需要兩種試液混合反應(yīng)后測(cè)試時(shí)，可將第二溶液管IB由底部插入第一溶液管IA的蓋子12的沉孔形空腔125中(如圖9)，第一溶液管IA蓋子切痕片123在第二溶液管IB的底部凸起111底部壓力下由切痕最深處開始斷裂，最終呈無切痕處不斷裂的打開狀態(tài)(見圖9)，第二溶液管IB底部凸起111兩側(cè)落在第一溶液管IA的凹坑124之間，旋轉(zhuǎn)上面的第二溶液管1B，第二溶液管IB底部凸起111受到第一溶液管IA的凹坑124的阻擋，第二溶液管IB底部切痕114斷裂，第二溶液管IB底部凸起111脫離第一溶液管1A，繼續(xù)插入第二溶液管1B，第二溶液管IB的溶液管外部凹槽112與第一溶液管IA的溶液管蓋子內(nèi)部凸起密封環(huán)122配合固定，且密封不可拔出，第二溶液管IB底部凸起111與第二溶液管IB的底部出現(xiàn)落差空隙，試液通過空隙和呈打開狀態(tài)的第一溶液管IA蓋子切痕片123流進(jìn)第一溶液管IA內(nèi)。該實(shí)施例在使用時(shí)，需要兩個(gè)溶液管疊加，即第二溶液管IB由底部插入第一溶液管IA的蓋子上部的空腔內(nèi)(見圖9)。如圖9所示，本發(fā)明裝置的使用方法，包括如下步驟:1、首先，將試紙4安裝在試紙管3內(nèi)(即將試紙4由試紙管3開口處插入，完全插入后，在試紙管3開口處按壓試紙4卡在試紙管凸起卡槽33之間，不會(huì)脫落或晃動(dòng))，然后將試紙管3帶有試紙4的一端插進(jìn)連接管2與試紙管3匹配的接口中，試紙管3的試紙管凸起斜板32受到連接管2接口內(nèi)部結(jié)構(gòu)的擠壓彈起且不會(huì)斷裂。彈起的試紙管凸起斜板32與連接管2接口內(nèi)的連接管斜坡23 —起擠壓試紙4，試紙4變形呈有一段拱起狀，將留下的試液阻止在一定范圍內(nèi)，試紙管外部凹槽31與試紙管凸起密封環(huán)22配合固定(見圖8中22-31)，且密封不可拔出(內(nèi)部液體不會(huì)發(fā)生泄漏現(xiàn)象)。2、將放有試液的溶液管的蓋子蓋起(即在溶液管管體11內(nèi)放入試液,并將溶液管蓋子12蓋入溶液管管體11內(nèi))，溶液管蓋子`外周凸起密封環(huán)121與溶液管內(nèi)部第一凹槽113A配合，形成第一溶液管1A。3、將放有試液的另一個(gè)溶液管的蓋子蓋起,溶液管蓋子外周凸起密封環(huán)121與溶液管內(nèi)部第一凹槽113A配合，形成第二溶液管1B。4、將第二溶液管IB由底部插入第一溶液管IA的蓋子上部的沉孔形空腔25內(nèi)，第二溶液管IB底部凸起111擠壓第一溶液管IA蓋子底部的切痕片123，切痕片123在第二溶液管IB的溶液管底部凸起111底部壓力下由切痕處開始斷裂，最終呈無切痕處不斷裂的打開狀態(tài)，第二溶液管IB底部凸起111插入并嵌合在第一溶液管IA蓋子底部的凹坑124中，旋轉(zhuǎn)第二溶液管1B，第二溶液管IB底部凸起111從第二溶液管IB底部切痕114處斷裂，第二溶液管IB底部凸起111脫離第二溶液管1B，第二溶液管IB內(nèi)的液體，將能從此斷裂縫隙流出。繼續(xù)插入第二溶液管1B，第二溶液管IB的溶液管外部凹槽112與第一溶液管IA的溶液管蓋子內(nèi)部凸起密封環(huán)122配合固定，且密封不可拔出。5、按壓第二溶液管IB的蓋子，使其蓋子的外周凸起密封環(huán)121與第二溶液管IB內(nèi)部第二凹槽113B配合，溶液管內(nèi)溶液被擠壓由第二溶液管(IB)底部的裂縫經(jīng)由呈打開狀態(tài)的第一溶液管IA蓋子切痕片123，流到下面第一溶液管IA內(nèi)，兩種試液混合為一體；6、重復(fù)步驟3，4，5，可以將更多的溶液混合為一體；
7、將上述裝有超過一個(gè)溶液管樣品溶液的第一溶液管IA安裝在連接管2與其匹配的沉孔形接口 26中，溶液管底部凸起111頂觸并擠壓連接管底部切痕片24，連接管底部切痕片24受力后開裂呈打開狀態(tài)，連接管底部切痕片24在溶液管底部凸起111的壓力下從一端開始斷裂，最終呈向下彎折狀，通過旋轉(zhuǎn)第一溶液管1A，溶液管底部凸起111斷裂脫落(溶液管底部凸起111與溶液管管體11連接處設(shè)有溶液管底部切痕114，當(dāng)旋轉(zhuǎn)溶液管I時(shí)，溶液管底部切痕114處完全斷裂，溶液管底部凸起111從溶液管底部切痕114處脫落)，繼續(xù)完全插入第一溶液管IA后，使其溶液管外部凹槽112與溶液管凸起密封環(huán)21配合形成倒鉤結(jié)構(gòu)，該第一溶液管IA將被接口內(nèi)的倒鉤結(jié)構(gòu)反向頂住呈不可拔出且密封狀態(tài)(內(nèi)部液體不會(huì)發(fā)生泄漏現(xiàn)象，在普通人單手操作情況下不能被反向拔出，即使雙手反向也需要相對(duì)費(fèi)力才可能抽出(見圖8)。8、按壓第二溶液管1B，使第一溶液管IA的蓋子外周凸起，密封環(huán)121與第一溶液管IA內(nèi)部第二凹槽113B配合，混合后的溶液被擠壓由溶液管底部凸起111斷裂的縫隙向下流動(dòng)，經(jīng)過呈打開狀態(tài)的連接管內(nèi)部的切痕片24導(dǎo)流到下面的試紙4上，最終混合樣品溶液在試紙條上完成相關(guān)反應(yīng)并顯示出顏色/熒光等信號(hào)，至此完成測(cè)試。實(shí)施例3如圖11-13所示，該實(shí)施例3與實(shí)施例1的區(qū)別在于:溶液管底部結(jié)構(gòu)上設(shè)有底部切痕114，但是沒有設(shè)底部凸起；連接管底部溶液釋放結(jié)構(gòu)由凸起部分25A及其周圍所設(shè)溶液通道孔25B組成；凸起部分25A抵頂溶液管底部結(jié)構(gòu)，溶液管底部結(jié)構(gòu)受到凸起部分25A抵頂?shù)淖饔昧r(shí)，它從底部切痕114處斷裂脫離，此時(shí)預(yù)先分裝在溶液管I內(nèi)的樣品溶液能夠從斷裂縫隙流出，并通過連接管底部的溶液通道孔25B流到試紙管中的層析試紙的樣品溶液接收區(qū)；所述溶液管底部切痕114為線狀或點(diǎn)狀，切痕部位的材質(zhì)厚度比其他部位的厚度少0.05-0.5mm ;當(dāng)溶液管底部結(jié)構(gòu)受到特定作用力時(shí)，切痕部位的力學(xué)耐受值較其他部位低，因此將從溶液管底部切痕114的切痕部位斷裂。本實(shí)施例其他結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4如圖14所示，實(shí)施例4與實(shí)施例1-3的區(qū)別在于:試紙管3末端部位設(shè)有環(huán)形凹槽34，在用力達(dá)到一定程度時(shí)，能從環(huán)形凹槽34處折斷試紙管3，便于對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行污染消除處理。下面再舉具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法予以說明。實(shí)施例5:常溫保存的核酸擴(kuò)增試劑的組成以豬細(xì)小病毒的PCR核酸檢測(cè)為例，說明常溫保存核酸擴(kuò)增試劑的液體和固體試劑組成，具體方法包括:一、以豬細(xì)小病毒(GenBank ID:NC_014665)序列為目標(biāo)基因，設(shè)計(jì)引物:F: CAAACAGATCTCTAGGACTGC (SEQ ID N0.8 所示)B:GTGGTTAAGTGTCCATGTTGG (SEQ ID N0.9 所示)二、擴(kuò)增試劑的組分如下:組分A:Tris-HCl (PH8.5),0.02M、0.05M KC1、0.15M MgCl2,體積百分比為0.2%Triton X-100，共 22μ I ； 組分B:引物 H).ΙμΜ，引物 R0.1 μ M，dNTPlmM,共 22 μ I ；
組分C:TaqDNA 聚合酶 8U ；保護(hù)劑:0.5M BSA, 0.6M酪蛋白，0.5M海藻糖，體積比的0.001%的疊氮鈉；二、常溫保存的核酸擴(kuò)增試劑的組成方案如下:豬細(xì)小病毒擴(kuò)增試劑的組分A在常溫液態(tài)下能穩(wěn)定保存，組分B在常溫液態(tài)下可能穩(wěn)定保存，在常溫固態(tài)下能穩(wěn)定保存，組分C只能在常溫固定下穩(wěn)定保存。根據(jù)不同組分在常溫下的穩(wěn)定性，擴(kuò)增試劑可以有表I中的方式組成:表I核酸擴(kuò)增試劑的組成
權(quán)利要求
1.一種常溫保存核酸擴(kuò)增試劑的方法，其特征在于，將核酸擴(kuò)增試劑中的部分試劑或全部試劑，通過固化工藝轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，從而實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增試劑能在常溫下穩(wěn)定保存，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)試劑盒在常溫下穩(wěn)定保存。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述的常溫是指在9 45°C的溫度范圍內(nèi)，所述的穩(wěn)定保存是指至少保存3個(gè)月后，各試劑的生物、物理和化學(xué)等性能變異系數(shù)CV小于10%。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸擴(kuò)增試劑包括如下組分: 組分A:核酸擴(kuò)增試劑中能在常溫液態(tài)和固態(tài)下穩(wěn)定保存的組分，包括:水、Tris-HCl,MgSO4，甜菜堿，(NH4)2SO4, NaCl，MgCl2,曲拉通； 組分B:核酸擴(kuò)增試劑中在常溫液態(tài)下不一定穩(wěn)定而在常溫固態(tài)下能穩(wěn)定保存的組分，包括:脫氧核苷三磷酸，引物、探針或其他核苷酸序列以及帶小分子標(biāo)記的引物、探針或其他核苷酸序列； 組分C:核酸擴(kuò)增試劑中在常溫液態(tài)下不穩(wěn)定而在固態(tài)下穩(wěn)定的組分，包括:Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、T7RNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增試劑的常溫下穩(wěn)定保存，至少需要固化所述組分C，將所述組分A和所述組分B以液態(tài)形式穩(wěn)定儲(chǔ)存；或者，同時(shí)將組分B和組分C固化，將組分A以液態(tài)形式保存；或者，同時(shí)將組分A、組分B和組分C全部固化，整個(gè)核酸擴(kuò)增試劑以固體形式在常溫穩(wěn)定保存。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固化工藝是指液態(tài)的核酸擴(kuò)增試劑組分在固化保護(hù)劑的存在下，通過物理干燥脫水的工藝變成固體；所述物理干燥脫水的工藝，包括:真空抽干工藝、冷凍真空干燥工藝和烘干工藝。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述固化保護(hù)劑，包括糖、蛋白、表面活性齊U、抗氧化劑和防腐劑；所述糖，包括雙糖和多糖，其使用的終濃度為體積比的0.5 20% ；所述蛋白，包括動(dòng)物血清與動(dòng)、植物蛋白，其使用的終濃度為體積比的0.1 15% ;所述的表面活性劑包括離子和非離子的表面活性劑，其使用的終濃度為體積比的0.01 5% ;所述的抗氧化劑，包括維生素、超氧化物歧化酶，其使用的終濃度為體積比的0.01 5% ;所述的防腐劑，包括疊氮鈉、硫柳汞、Proclin300，其使用的終濃度為體積比的0.001 0.1%。
7.—種常溫保存的封閉式核酸層析試紙檢測(cè)試劑盒，其特征在于:包括樣本的核酸提取試劑、能在常溫下保存的核酸擴(kuò)增試劑和封閉式層析試紙檢測(cè)裝置；所述封閉式核酸層析試紙檢測(cè)試劑盒是指在封閉式層析試紙檢測(cè)裝置中對(duì)常溫保存的核酸擴(kuò)增試劑的擴(kuò)增產(chǎn)物溶液通過免疫層析試紙實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)； 所述核酸擴(kuò)增試劑采用權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行常溫保存； 所述封閉式層析試紙檢測(cè)裝置，包括:免疫層析試紙和封閉式檢測(cè)裝置；其中免疫層析試紙被固定在封閉式檢測(cè)裝置中，被檢測(cè)樣品溶液不能同裝置外部環(huán)境接觸。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸擴(kuò)增試劑的檢測(cè)目標(biāo)對(duì)象包括:RNA和DNA ;所述核酸擴(kuò)增試劑用于從DNA或RNA模板啟動(dòng)核酸序列的擴(kuò)增，最終產(chǎn)生遠(yuǎn)高于模板起始濃度的且與模板互補(bǔ)或相同序列的RNA或DNA片段產(chǎn)物，核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法包括:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈替代擴(kuò)增、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、依賴核酸序列的擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增、實(shí)時(shí)熒光定量環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述的封閉式層析試紙檢測(cè)裝置由溶液管，連接管和試紙管裝配組成: 1)溶液管:用于儲(chǔ)存核酸擴(kuò)增試劑和采用核酸提取試劑提取的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；該溶液管包括溶液管體和溶液管蓋子；所述溶液管管體內(nèi)壁圓周面上設(shè)有上下兩個(gè)凹槽，分別是溶液管內(nèi)部第一凹槽、溶液管內(nèi)部第二凹槽；所述溶液管蓋子的外周設(shè)有凸起密封環(huán)，該溶液管蓋子外周凸起密封環(huán)與溶液管內(nèi)部第一凹槽、溶液管內(nèi)部第二凹槽都能配合密封，溶液管內(nèi)部第一凹槽能允許溶液管蓋子重復(fù)開啟，溶液管內(nèi)部第二凹槽則反向倒鉤住溶液管蓋子，使其在一次性受壓入位后形成封閉環(huán)境，不容易被再次打開；所述溶液管管體外周設(shè)有溶液管外部凹槽，能與連接管對(duì)應(yīng)接口內(nèi)設(shè)的凸起密封環(huán)配合形成反向倒鉤結(jié)構(gòu)，形成封閉環(huán)境而不容易被打開；所述溶液管管體底部設(shè)有底部結(jié)構(gòu)，它外周邊緣設(shè)底部切痕，當(dāng)?shù)撞拷Y(jié)構(gòu)受到一定作用力時(shí)，它從底部切痕處斷裂脫離，此時(shí)預(yù)先分裝在溶液管內(nèi)的樣品溶液能夠從斷裂縫隙流出； 2)連接管:用于將溶液管和試紙管密閉連接起來，并促使釋放溶液管中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液；所述連接管上設(shè)有一個(gè)或多個(gè)與所述溶液管下部管體外形匹配的沉孔形接口 ；所述沉孔形接口內(nèi)設(shè)有溶液管凸起密封環(huán)，能與插入接口的溶液管外部凹槽配合形成反向倒鉤結(jié)構(gòu)，形成封閉環(huán)境而不容易被再次打開；該連接管上還設(shè)有一個(gè)或多個(gè)與試紙管匹配的接口，該接口內(nèi)設(shè)有試紙管凸起密封環(huán)，該試紙管凸起密封環(huán)與插入接口的試紙管外部凹槽配合成反向倒鉤密封結(jié)構(gòu)而不容易被打開；連接管沉孔形接口底部設(shè)有溶液釋放結(jié)構(gòu)，它對(duì)溶液管底部結(jié)構(gòu)給予特定作用力即可將其斷裂脫離，溶液從溶液管釋放出來；連接管溶液釋放結(jié)構(gòu)底部設(shè)有溶液通道，溶液管釋放出來的液體將經(jīng)過溶液通道流到試紙管中的層析試紙的樣品溶液接收區(qū)； 3)試紙管:用于固定免疫層析試紙；所述試紙管是一端開口的中空長(zhǎng)管；試紙管的開口端設(shè)有試紙管凸起卡槽，用于安裝免疫層析試紙條時(shí)卡住并固定免疫層析試紙條；試紙管在插入連接管的接口部位設(shè)有試紙管外部凹槽，該外部凹槽與連接管內(nèi)壁設(shè)的試紙管凸起密封環(huán)配合后反向倒鉤形成封閉環(huán)境，不容易被再次打開。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于:所述的封閉式層析試紙檢測(cè)裝置的溶液管的蓋子上設(shè)有一沉孔形空腔，在該沉孔形空腔內(nèi)可插入另一個(gè)溶液管下部管體形成疊加套管結(jié)構(gòu)，并釋放出核酸擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物溶液，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多管擴(kuò)增完成的反應(yīng)液；所述溶液管蓋子的沉孔形空腔底部設(shè)有溶液釋放結(jié)構(gòu)，溶液釋放結(jié)構(gòu)底部設(shè)有溶液通道；所述溶液管體下部外圓周面設(shè)有外部凹槽；靠近蓋子頂部的溶液管蓋子內(nèi)壁面設(shè)有凸起密封環(huán)，該凸起密封環(huán)與插入蓋子沉孔形空腔內(nèi)的另一個(gè)溶液管的外部凹槽配合后形成反向倒鉤密封結(jié)構(gòu)。
11.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于:所述試紙管末端部位設(shè)有環(huán)形凹槽，在用力達(dá)到一定程度時(shí)，能從此環(huán)形凹槽部分折斷試紙管，便于對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行污染消除處理。
12.一種利用如權(quán)利要求7所述的試劑盒進(jìn)行核酸檢測(cè)的方法，其特征在于，包括如下步驟: (I)采用核酸提取試劑進(jìn)行核酸提?。籥、取100 1000μ I的液體樣本，加入300 4000 μ I裂解液，震蕩混勻后室溫靜置I 2min ； b、加入350 4000μ I洗滌液Α，震蕩混勻后以10000 16000rpm離心3 5min，棄上清； C、加入350 1000 μ I的洗滌液B，震蕩洗滌使絮狀物溶解，隨后以10000 16000rpm離心I 2min,棄上清,得沉淀； d、沉淀于室溫干燥，加入1-10 μ I的溶解液將沉淀溶解； (2)采用核酸擴(kuò)增試劑進(jìn)行DNA或RNA擴(kuò)增； 將核酸擴(kuò)增試劑中的液體試劑用移液槍或者一次滴管移至固體試劑的溶液管，充分溶解形成核酸擴(kuò)增反應(yīng)液；然后將I 10 μ I核酸提取試劑提取的DNA或RNA加入備好的核酸擴(kuò)增反應(yīng)液中，依照不同的核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，隨后恢復(fù)室溫終止核酸擴(kuò)增； (3)利用核酸封閉式檢測(cè)裝置進(jìn)行DNA或RNA檢測(cè): a.將試紙管連帶免疫層析試紙條插進(jìn)連接管與其匹配的接口中，密封不可拔出； b.將結(jié)束擴(kuò)增的溶液管插入水平放置的封閉式層析裝置的連接管中通過旋轉(zhuǎn)溶液管，溶液管底部凸起斷裂脫落，繼續(xù)完全插入溶液管，使溶液管外部凹槽與第一連接管凸起密封環(huán)配合形成倒鉤結(jié)構(gòu)，該溶液管將被該倒鉤結(jié)構(gòu)反向頂住呈不可拔出且密封狀態(tài)； c.擴(kuò)增完的核酸擴(kuò)增反應(yīng)液由溶液管底部和呈打開狀態(tài)的連接管內(nèi)部的切痕片流到免疫層析試紙條上,開始核酸的膠體金層析免疫學(xué)檢測(cè)； d.從液體出現(xiàn)在硝酸纖維素膜上起開始計(jì)時(shí)，3-15 min后免疫層析結(jié)束判定結(jié)果，在質(zhì)控線有可見條帶的前提下，檢測(cè)線出現(xiàn)條帶說明檢測(cè)結(jié)果為陽性，檢測(cè)線沒有條帶說明檢測(cè)結(jié)果為陰性。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，在步驟(3)之后增加如下核酸擴(kuò)增產(chǎn)物無害化處理步驟:將使用完畢后的封閉式層析試紙檢測(cè)裝置在試紙管的環(huán)形凹槽處折斷，同時(shí)將溶液管蓋子沉孔形空腔底部的切痕片頂壓破裂，然后把全部組件浸入納米二氧化鈦溶液中，然后在紫外光的照射下降解封閉式層析試紙裝置中的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。
14.如權(quán)利要求13中所述的方法，其特征在于，所述納米二氧化鈦包括:金紅石型、銳礦型，納米二氧化鈦溶液的濃度為:0.5 5mg/ml ;所述的紫外光波長(zhǎng)范圍是200 420nm，照射時(shí)間為2 48小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種常溫保存核酸擴(kuò)增試劑的方法，將核酸擴(kuò)增試劑中的部分試劑或全部試劑，通過固化工藝轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)后在常溫下穩(wěn)定保存。本發(fā)明還公開了一種常溫保存的封閉式核酸層析試紙檢測(cè)試劑盒，包括樣本的核酸提取試劑、常溫保存的核酸擴(kuò)增試劑、封閉式層析試紙檢測(cè)裝置及核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的無害化處理方法；所述封閉式層析試紙檢測(cè)裝置，包括免疫層析試紙和封閉式檢測(cè)裝置；其中免疫層析試紙被固定在封閉式檢測(cè)裝置中，被檢測(cè)樣品溶液不能同裝置外部的環(huán)境接觸。另外，本發(fā)明還公開了利用該試劑盒進(jìn)行核酸檢測(cè)的方法。本發(fā)明能實(shí)現(xiàn)核酸試劑的常溫運(yùn)輸和保存及核酸簡(jiǎn)單、快速提取，且核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)封閉、快速和高靈敏，避免交叉污染。
文檔編號(hào)C12N15/10GK103243087SQ20131015701
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月28日
發(fā)明者周中人, 林忠旺, 熊丁杰, 周正峰, 蔣庭, 吳海洋 申請(qǐng)人:上?？祆`生物科技有限公司