專利名稱：修飾天然sod酶液的方法、后處理修飾的sod酶液及肉豆蔻酸-sod凍干粉的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化領(lǐng)域，具體涉及一種修飾天然SOD酶液的方法、后處理修飾的SOD酶液及制備肉豆蘧酸-SOD凍干粉。
背景技術(shù)：
自由基學(xué)說是在生命科學(xué)領(lǐng)域中，越來越被人們廣泛接受的關(guān)于生命體衰老理論的學(xué)說，該學(xué)說認(rèn)為自由基是造成生命體老化及諸多疾病的重要原因。據(jù)估計(jì)80%左右的老化性、退行性疾病都與自由基有關(guān)，其中包括癌癥、老年癡呆癥、帕金森氏癥、皮膚色素沉積、白內(nèi)障、心臟病等，所以清除自由基對(duì)維持健康體魄和保持年輕體態(tài)至關(guān)重要。而SOD是專一的自 由基清除劑。SOD是一種廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，具有催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)的生物酶，其催化的歧化反應(yīng)式如下:.02 +.02 +2HH—> H202+02SOD能清除人體細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子自由基(生物垃圾)，因而被譽(yù)為人體的生物垃圾清道夫，而自由基過多則導(dǎo)致80多種疾病，因此人體適時(shí)適量補(bǔ)充S0D，就能預(yù)防甚至治療因自由基過多而導(dǎo)致的多種疾病，具有抗氧化、抗輻射、抗癌變、消炎等功能，用于治療或輔助治療心腦血管疾病、自身免疫性疾病、血液再灌注損傷、慢性炎癥和癌癥等，而且可用于日常的抗衰老保健，防治老年性疾病和慢性病等。據(jù)報(bào)道，SOD的修飾方法已有多種，如袁勤生用右旋糖酐對(duì)SOD的化學(xué)修飾(生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)[J]，1986 ；18(2):308)和陳吉祥、袁勤生用β _環(huán)糊精對(duì)SOD的化學(xué)修飾(中國醫(yī)藥工業(yè)雜志[J]，1998 ；29(2):59-61)及尹亮用聚乙二醇修飾SOD(生物技術(shù)[J]，2003:8)。右旋糖酐、β -環(huán)糊精和聚乙二醇等大分子化合物做為修飾劑，使修飾后的SOD分子量大幅度增加，達(dá)到300 400kd，靜脈注射時(shí)易引起血管堵塞，而且修飾時(shí)SOD酶活性損失聞達(dá)40%左右。也有學(xué)者用月桂酸等小分子修飾劑來修飾SOD的，如鄒國林的《月桂酸修飾SOD的制備及其穩(wěn)定性研究》(武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)[J]，1998 ；44(4):49(81))和閻家麒的《月桂酸修飾SOD的制備及性質(zhì)研究》(生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展[J]，1994 ；21⑵:154-157)，還有鄒國林的《硬脂酸修飾SOD的制備及其性質(zhì)》(生物化學(xué)雜志[J]，1996 ；12(1):64-67)等。閻家麒的修飾方法，需要把月桂酸活化，而活化是一個(gè)復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)過程，反應(yīng)不完全容易導(dǎo)致氯化亞砜、吡啶等化學(xué)試劑的殘留，影響產(chǎn)品的安全性。鄒國林的修飾方法，把月桂酰氯一次性地加入到SOD酶液中，會(huì)導(dǎo)致SOD酶液的pH值急劇下降和月桂酰氯局部濃度過高，造成SOD的活性損失達(dá)20%左右，而且反應(yīng)過程劇烈而不易控制，從而不適于規(guī)模化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述不足之處，本發(fā)明的目的之一是提供一種修飾天然SOD酶液的方法，該修飾天然SOD酶液的方法使天然SOD的修飾反應(yīng)活性損失僅在5%左右，且能降低成本。技術(shù)方案是:一種修飾天然SOD酶液的方法，所述天然SOD酶液修飾采用的修飾劑為肉豆蘧酰氯。作為優(yōu)選，所述天然SOD酶液是采用以下步驟制取的:將酶活性為6.0X IO3 1.2X104U/mg蛋白的天然SOD凍干粉，溶解于pH9.0，
0.05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液中。作為優(yōu)選，所述天然SOD凍干粉為60 200克。作為優(yōu)選，所述肉豆蘧酰氯為45 150ml，肉豆蘧酰氯濃度為95% -99%。作為優(yōu)選，所述天然SOD酶液修飾是通過以下步驟完成的:天然SOD酶液倒入帶夾套的反應(yīng)釜中，攪拌，加熱至36 45°C并保持恒溫；然后滴加肉豆蘧酰氯，同時(shí)滴加2 mol/L堿溶液，使酶液的pH值始終維持在9.0左右；恒溫反應(yīng)I小時(shí)，其中肉豆蘧酰氯在前30分鐘左右滴加完畢；堿溶液的滴加貫穿整個(gè)反應(yīng)過程以維持酶液PH值的穩(wěn)定；修飾反應(yīng)完畢后，迅速倒出酶液并冷卻至4°C，得到修飾的SOD酶液。所述堿溶液可以是氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液以及其它堿性溶液之一，也可以是它們中兩種或兩種以上的混合液。優(yōu)選2mo I/L的氫氧化鈉溶液。作為優(yōu)選，所述肉豆蘧酰氯和堿溶液滴加是連續(xù)緩慢滴加的。本發(fā)明的目的之二是提供一種后處理上述修飾的SOD酶液的方法。技術(shù)方案是:一種后處理修飾的SOD酶液的方法，所述后處理包括以下步驟:修飾SOD酶液冷卻后，邊攪拌邊加入2倍體積的冷丙酮，靜置30分鐘后離心，收集沉淀，用適量的純凈水溶解，再離心去除沉淀，以除去未反應(yīng)的肉豆蘧酰氯，收集上清液，超濾濃縮后冷凍干燥，得到肉豆蘧酸-SOD凍干粉。本發(fā)明的目的之三是提供一種肉豆蘧酸-SOD凍干粉。 技術(shù)方案是:一種肉豆蘧酸-SOD凍干粉，所述肉豆蘧酸-SOD凍干粉是采用上述方法制備的。發(fā)明的原理:肉豆蘧酰氯在弱堿性條件下，作用于SOD分子表面的非活性部位的賴氨酸，并與賴氨酸的ε -NH2共價(jià)結(jié)合,即發(fā)生Schotten-Baumann反應(yīng),形成一種?；疭0D,增強(qiáng)了 SOD的剛性構(gòu)象，?；a(chǎn)生的空間障礙和靜電斥力，阻擋了蛋白水解酶和其他制劑對(duì)SOD的進(jìn)攻，使穩(wěn)定SOD分子構(gòu)象的次級(jí)鍵得到保護(hù)，SOD的穩(wěn)定性大幅提聞。本發(fā)明直接用高純度肉豆蘧酰氯做修飾劑，而省去了肉豆蘧酸的活化反應(yīng)步驟。因肉豆蘧酸與氯化亞砜反應(yīng)生成肉豆蘧酰氯，往往反應(yīng)不完全，容易導(dǎo)致氯化亞砜、吡啶等化學(xué)試劑的殘留，影響了產(chǎn)品的安全性；其次，減少了活化反應(yīng)這一步驟，節(jié)約了設(shè)備投入和人力成本，共計(jì)節(jié)約了 3%左右的生產(chǎn)成本。更重要的是，肉豆蘧酰氯是連續(xù)緩慢滴加到SOD酶液中發(fā)生Schotten-Baumann反應(yīng)，加入約需要30分鐘左右的時(shí)間；滴加肉豆蘧酰氯的同時(shí)，連續(xù)緩慢滴加2mol/L的堿溶液，使酶液的PH值始終穩(wěn)定在9.0左右，這樣，SOD酶液的pH值波動(dòng)不大，反應(yīng)過程溫和而容易控制，從而適于規(guī)模化生產(chǎn)；并且SOD活性損失少，整個(gè)修飾工藝，SOD的活性損失在5%左右，不會(huì)造成肉豆蘧酰氯一次性加入后，SOD酶液的pH值急劇下降導(dǎo)致SOD活性損失大的現(xiàn)象。
有益效果是:1、直接用肉豆蘧酰氯做修飾劑，省去了活化反應(yīng)步驟，不僅避免了化學(xué)試劑的殘留，保證了產(chǎn)品的安全性，而且節(jié)約了設(shè)備投入和人力成本，共計(jì)節(jié)約了 3%左右的生產(chǎn)成本。2、肉豆蘧酰氯和堿溶液的連續(xù)緩慢滴加方法，改變了修飾反應(yīng)的過程和環(huán)境，使SOD酶液的pH值波動(dòng)不大，反應(yīng)過程溫和而容易控制，從而適于規(guī)模化生產(chǎn)；并且SOD的修飾反應(yīng)活性損失在5%左右，而以前的修飾方法，SOD活性損失在20%左右，比較下來，減少了 15%左右的活性損失。
具體實(shí)施方式
下面將參照實(shí)施例具體闡明本發(fā)明。實(shí)施例1.
將酶活性為8.73 X 103U/mg蛋白的天然SOD凍干粉(成都養(yǎng)泰和生物科技有限公司生產(chǎn))60克，溶解于3500ml的pH9.0,0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液中，得天然SOD酶液。將天然SOD酶液倒入帶夾套的IOL玻璃反應(yīng)釜中，開動(dòng)攪拌裝置，夾套熱水循環(huán)加熱至38°C，并保持恒溫；然后連續(xù)緩慢滴加56ml肉豆蘧酰氯，同時(shí)連續(xù)緩慢滴加2mol/L的NaOH液，使酶液的pH值始終維持在9.0左右，恒溫反應(yīng)I小時(shí)，其中肉豆蘧酰氯在前30分鐘左右滴加完畢；而NaOH液的滴加貫穿整個(gè)反應(yīng)過程,但滴加速度逐漸減慢。修飾反應(yīng)完畢后，迅速倒出SOD酶液，用熱交換器冷卻至室溫，然后放置到冰柜中進(jìn)一步冷卻至4°C，得到修飾的SOD酶液。修飾的SOD酶液冷卻后，邊攪拌邊加入2倍體積的-18°C的冷丙酮，靜置30分鐘后離心，收集沉淀，用適量的純凈水溶解，再離心去除沉淀，以除去未反應(yīng)的肉豆蘧酰氯，收集上清液，超濾濃縮后冷凍干燥，得到56.8克、活性為8.31 X 103U/mg蛋白的肉豆蘧酸-SOD凍干粉。實(shí)施例2.
將酶活性為1.03 X 104U/mg蛋白的天然SOD凍干粉(成都養(yǎng)泰和生物科技有限公司生產(chǎn))100克，溶解于7000ml的pH9.0,0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液中。天然SOD酶液倒入帶夾套的IOL玻璃反應(yīng)釜中，開動(dòng)攪拌裝置，夾套熱水循環(huán)加熱至42°C，并保持恒溫；然后連續(xù)緩慢滴加94ml肉豆蘧酰氯，同時(shí)連續(xù)緩慢滴加2mol/L的KOH液，使酶液的pH值始終維持在9.0左右，恒溫反應(yīng)I小時(shí)，其中肉豆蘧酰氯在前30分鐘左右滴加完畢；而KOH液的滴加貫穿整個(gè)反應(yīng)過程，但滴加速度逐漸減慢。修飾反應(yīng)完畢后，迅速倒出SOD酶液，用熱交換器冷卻至室溫，然后放置到冰柜中進(jìn)一步冷卻至4°C，得到修飾的SOD酶液。修飾SOD酶液冷卻后，邊攪拌邊加入2倍體積的_18°C的冷丙酮，靜置30分鐘后離心，收集沉淀，用適量的純凈水溶解，再離心去除沉淀，以除去未反應(yīng)的肉豆蘧酰氯，收集上清液，超濾濃縮后冷凍干燥，得到95.8克、活性為9.75X 103U/mg蛋白的肉豆蘧酸-SOD凍干粉。對(duì)比實(shí)驗(yàn)I采用文獻(xiàn)武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)[J]，1998 ；44(4):49(81))的方法，將酶活性為8.73 X 103U/mg蛋白的天然SOD凍干粉30克，溶于pH9.0,0.lmol/L的NaCO3緩沖液2000ml中，然后倒入反應(yīng)釜中，攪拌中加入28ml月桂酰氯，同時(shí)加入lmol/L的NaOH液來維持PH值，然后立即升溫至42°C，并攪拌I小時(shí)，再迅速降溫至室溫，加入3倍體積的-18°C的冷丙酮，經(jīng)離心收集沉淀物并將其溶于適量蒸餾水中，離心后取上清液，透析后凍干，得到月桂酸-SOD凍干粉。同樣按上述文獻(xiàn)的方法，將酶活性為1.03 X 104U/mg蛋白的天然SOD凍干粉30克，溶于pH9.0，0.lmol/L的NaCO3緩沖液2500ml中，然后倒入反應(yīng)釜中，攪拌中加入30ml月桂酰氯，同時(shí)加入lmol/L的NaOH液來維持pH值，然后立即升溫至42°C，并攪拌I小時(shí)，再迅速降溫至室溫，加入3倍體積的_18°C的冷丙酮，經(jīng)離心收集沉淀物并將其溶于適量蒸餾水中，離心后取上清液，透析后凍干，得到月桂酸-SOD凍干粉。實(shí)施例1和2與對(duì)比實(shí)驗(yàn)1，均按GB/T 5009.171-2003的第一法，檢測SOD凍干粉
的酶活性，檢測結(jié)果見下表。
權(quán)利要求
1.一種修飾天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述天然SOD酶液修飾采用的修飾劑為肉豆蘧酰氯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述天然SOD酶液是采用以下步驟制取的: 將酶活性為6.0 X IO3 1.2 X 104U/mg蛋白的天然SOD凍干粉，溶解于pH9.0,0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的修飾天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述天然SOD凍干粉為60 200克。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的修飾天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述肉豆蘧酰氯為45 150ml，肉豆蘧酰氯濃度為95% 99%。
5.一種制備權(quán)利要求1、2或3所述的修飾天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述天然SOD酶液修飾是通過以下步驟完成的: 天然SOD酶液倒入帶夾套的反應(yīng)釜中，攪拌，加熱至36 45°C并保持恒溫；然后滴加肉豆蘧酰氯，同時(shí)滴加2mol/L堿溶液，使酶液的pH值始終維持在9.0左右；恒溫反應(yīng)I小時(shí)，其中肉豆蘧酰氯在前30分鐘左右滴加完畢；堿溶液的滴加貫穿整個(gè)反應(yīng)過程以維持酶液PH值的穩(wěn)定；修飾反應(yīng)完畢后，迅速倒出酶液并冷卻至4°C，得到修飾的SOD酶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的修飾天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述肉豆蘧酰氯和堿溶液滴加是連續(xù)緩慢滴加的。
7.一種制備權(quán)利要求4所述的修飾天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述天然SOD酶液修飾是通過以下步驟完成的: 天然SOD酶液倒入帶夾套的反應(yīng)釜中，攪拌，加熱至36 45°C并保持恒溫；然后滴加肉豆蘧酰氯，同時(shí)滴加2mol/L堿溶液，使酶液的pH值始終維持在9.0左右；恒溫反應(yīng)I小時(shí)，其中肉豆蘧酰氯在前30分鐘左右滴加完畢；堿溶液的滴加貫穿整個(gè)反應(yīng)過程以維持酶液PH值的穩(wěn)定；修飾反應(yīng)完畢后，迅速倒出酶液并冷卻至4°C，得到修飾的SOD酶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的修飾天然SOD酶液的方法，其特征在于:所述肉豆蘧酰氯和堿溶液滴加是連續(xù)緩慢滴加的。
9.一種后處理上述任一權(quán)利要求所述的修飾的SOD酶液的方法，其特征在于:所述后處理包括以下步驟: 修飾SOD酶液冷卻后，邊攪拌邊加入2倍體積的冷丙酮，靜置30分鐘后離心，收集沉淀，用適量的純凈水溶解，再離心去除沉淀，以除去未反應(yīng)的肉豆蘧酰氯，收集上清液，超濾濃縮后冷凍干燥，得到肉豆蘧酸-SOD凍干粉。
10.一種肉豆蘧酸-SOD凍干粉，其特征在于:所述肉豆蘧酸-SOD凍干粉是采用上述任一權(quán)利要求制備的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種修飾天然SOD酶液的方法、后處理修飾的SOD酶液及制備肉豆蔻酸-SOD凍干粉，屬于生化領(lǐng)域，所述天然SOD酶液修飾采用的修飾劑為肉豆蔻酰氯。本發(fā)明保護(hù)的修飾天然SOD酶液的方法直接用肉豆蔻酰氯做修飾劑，省去了活化反應(yīng)步驟，不僅避免了化學(xué)試劑的殘留，保證了產(chǎn)品的安全性，而且節(jié)約了設(shè)備和人力成本，共計(jì)可節(jié)約3％左右的生產(chǎn)成本。SOD的修飾反應(yīng)活性損失在5％左右，而以前的修飾方法，SOD活性損失在20％左右，比較下來，減少了15％左右的活性損失。肉豆蔻酸-SOD凍干粉應(yīng)用于化妝品、保健食品和藥品等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N9/02GK103215247SQ20131014821
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者莫宏春 申請(qǐng)人:莫宏春