專利名稱：中國少鱗鱖地域群體的分子鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種中國少鱗鱖地域群體的分子鑒定方法。
背景技術(shù)：
少鱗鱖，屬于鱸形目、鯧科、少鱗鱖屬，為東亞特有的淡水魚類，現(xiàn)生種類有3種:中國少鱗鱖、朝鮮少鱗鱖和日本少鱗鱖。在中國，中國少鱗鱖稀見分布于長江以南和沅江、珠江、錢塘江、歐匯水系及海南島，屬于中國較稀有的少鱗鱖屬魚類資源。關(guān)于少鱗鱖種內(nèi)群體間的遺傳差異比較研究極少，僅Okazaki and Jeon (1996)利用同工酶技術(shù)研究了日本少鱗鱖和朝鮮少鱗鱖不同群體間的遺傳差異。對(duì)中國少鱗鱖不同群體間的遺傳差異的研究，僅趙I I 等利用mtDNA控制區(qū)序列(2007)和AFLP技術(shù)(2008)進(jìn)彳了研究過，而未見利用微衛(wèi)星技術(shù)方面的研究。作為第二代分子標(biāo)記，微衛(wèi)星DNA (Microsatellite DNA)，又稱簡單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeats, SSR),以其具有的共顯性、分布廣泛、遺傳中性的特點(diǎn)，已在群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、鑒定及遺傳資源評(píng)價(jià)發(fā)面發(fā)揮重要作用(Hamada et al.，1982;Schlotterer and TautZ, 1992)。該類型標(biāo)記應(yīng)用不受個(gè)體大小和時(shí)間限制,與物理標(biāo)記相比可以顯著降低遺傳育種中的環(huán)境效應(yīng)因素的影響。對(duì)少鱗鱖的研究報(bào)道，主要集中在形態(tài)分類、資源調(diào)查、生態(tài)學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育等方面。關(guān)于中國少鱗鱖種內(nèi)不同群體的比較研究報(bào)道極少。因此，鑒于中國少鱗鱖屬魚類資源現(xiàn)狀，有必要借助相應(yīng)的分子手段，開展少鱗鱖種內(nèi)及種間群體的鑒定研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于提供一種有別于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生態(tài)學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)等宏觀手段的用于中國少鱗鱖不同地域群體間的微衛(wèi)星分子鑒定方法，不僅具有客觀、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)于中國少鱗鱖種質(zhì)資源的保護(hù)、遺傳育種、親緣鑒定等都有著重要意義。上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種中國少鱗鱖地域群體的分子鑒定方法，該方法包括以下步驟:I)基因組DNA的提取:采集待測中國少鱗鱖魚樣品的鰭條或者肌肉組織，提取基因組DNA并測定其純度和濃度，取A260/A280值為1.Tl.1，濃度為50(T3000ng/μ I的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增；2)目的基因的擴(kuò)增:采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目的DNA片段，所用的PCR反應(yīng)的一對(duì)引物序列為:正向序列:5’TGCTCCAACCAGACAGAGG 3’反向序列:5’AACTTGTTGCTCTTCATCC 3’

3) PCR產(chǎn)物的電泳檢測及銀染鑒定:采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行常規(guī)銀染色，顯影后拍照并記錄電泳結(jié)果；
4)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì):與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)，讀出待測樣品的目的條帶所處的位置，如樣品在靠近圖譜的104bp位置擴(kuò)增出的一條特異性DNA條帶，則鑒定為中國少鱗鱖浙江和湖南群體；如樣品在靠近圖譜的115bp位置擴(kuò)增出一條特異性DNA條帶，則鑒定為中國少鱗鱖廣西群體；如樣品在靠近圖譜的IlSbp和IlObp位置分別擴(kuò)增出一條特異性DNA條帶，則鑒定為中國少鱗鱖廣東群體。優(yōu)選的:步驟I)中所提取的基因組DNA的A260/A280值為1.78 1.93。優(yōu)選的:步驟I)中所提取的基因組DNA的濃度為150(T2500ng/l.! I。其中， 步驟2)中所述的PCR反應(yīng)體系為:
DNA 模板0.25ul IOxTaq PCR Mg2 緩沖液1.25ul dNTPs0.25ul 上游引物F0.25ul 下游引物R0 25ul rTaq 酶0.125ul 去離子水補(bǔ)齊至12.5ul其中，步驟2)中所述的PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性4min，94°C變性30s，60°C退火45s，72°C延伸Imin共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后再72°C延伸lOmin，反應(yīng)結(jié)束后取出4°C保存。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明所提供的鑒定方法不僅能提高中國少鱗鱖地域群體鑒定的效率和準(zhǔn)確性，且操作簡便快捷，對(duì)于研究中國少鱗鱖群體間的遺傳差異，保護(hù)中國少鱗鱖種質(zhì)資源實(shí)現(xiàn)生物資源的可持續(xù)利用具有重要的科學(xué)研究價(jià)值。


圖1:擴(kuò)增的中國少鱗鱖四個(gè)不同地域群體混合模板的微衛(wèi)星帶譜。圖中=MSDNA分子量標(biāo)記。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1一種中國少鱗鱖地域群體的分子鑒定方法，該方法包括以下步驟:I) DNA 的提取:剪取中國少鱗鱖鰭條或肌肉組織少量，約0.5mg于裝有700ul無水酒精的1.5ml離心管中，按照TIANamp Genomic DNA Kit血液、細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)所示方法和步驟提取，并用紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度，再用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測DNA純度，取A260/A280值為1.78 1.93，濃度為150(T2500ng/μ I為最適濃度。2) DNA片段擴(kuò)增:即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，用于PCR反應(yīng)的一對(duì)引物序列為:正向序列:5’TGCTCCAACCAGACAGAGG 3’反向序列:5’AACTTGTTGCTCTTCATCC 3’PCR擴(kuò)增體系如下:
混勻后高速離心數(shù)秒。PCR循環(huán)體系為:94°C預(yù)變性4min，然后按以下條件進(jìn)行30個(gè)循環(huán):94°C變性30s，60°C退火45s，72°C延伸lmin，循環(huán)結(jié)束后再72°C延伸lOmin，反應(yīng)結(jié)束后取出4°C保`存。3) PCR產(chǎn)物的電泳及銀染色鑒定:制膠:8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠。電泳:每個(gè)產(chǎn)物上樣3ul(含Iul上樣緩沖液)，同時(shí)點(diǎn)上標(biāo)準(zhǔn)酶切片段作為標(biāo)準(zhǔn)圖譜以便比對(duì)。用IXTBE電泳緩沖液，120V恒壓電泳約I小時(shí)40分鐘至藍(lán)色染料到達(dá)凝膠底端時(shí)終止。銀染色鑒定:染色過程如下:拆板后將凝膠放于雙蒸水中水洗兩次，然后用0.1%的AgNO3染色lOmin，再用雙蒸水漂洗兩次，每次約15s，接著用含有2%的Na0H、0.04%的Na2CO3和0.4%的甲醛混合配成的顯影液顯影約lOmin，實(shí)際以剛能看到黑色條帶就停止顯影，自來水終止顯影以防顯影過分造成凝膠全部變黑影響讀帶，最后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像拍照并保存電泳結(jié)果。4)電泳圖譜顯示:與標(biāo)準(zhǔn)酶切片段比對(duì)，讀出四個(gè)群體的目的條帶所處的位置。如樣品在靠近Marker的104bp位置擴(kuò)增出的一條特異性DNA條帶，則鑒定為中國少鱗鱖浙江和湖南群體；如樣品在靠近Marker的115bp位置的擴(kuò)增出一條特異性DNA條帶，則鑒定為中國少鱗鱖廣西群體；如樣品在靠近Marker的118bp和IlObp位置分別擴(kuò)增出一條特異性DNA條帶，則鑒定為中國少鱗鱖廣東群體。
權(quán)利要求
1.一種中國少鱗鱖地域群體的分子鑒定方法，其特征在于包括以下步驟 1)基因組DNA的提取采集待測中國少鱗鱖魚樣品的鰭條或者肌肉組織，提取基因組DNA并測定其純度和濃度，取A260/A280值為I. 7 2. 1，濃度為50(T3000ng/μ I的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增； 2)目的基因的擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目的DNA片段，PCR反應(yīng)的一對(duì)引物序列為 正向序列5’ TGCTCCAACCAGACAGAGG 3’ 反向序列5’ AACTTGTTGCTCTTCATCC 3’ 3)PCR產(chǎn)物的電泳檢測及銀染鑒定采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行銀染色，顯影后拍照并記錄電泳結(jié)果； 4)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)，讀出待測樣品的目的條帶所處的位置，如樣品在靠近圖譜的104bp位置擴(kuò)增出的一條特異性DNA條帶，則鑒定為中國少鱗鱖浙江和湖南群體；如樣品在靠近圖譜的115bp位置擴(kuò)增出一條特異性DNA條帶，則鑒定為中國少鱗鱖廣西群體；如樣品在靠近圖譜的IlSbp和IlObp位置分別擴(kuò)增出一條特異性DNA條帶，則鑒定為中國少鱗鱖廣東群體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中國少鱗鱖地域群體的分子鑒定方法，其特征在于步驟I)中所提取的基因組DNA的A260/A280值為I. 78 I. 93。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中國少鱗鱖地域群體的分子鑒定方法，其特征在于步驟I)中所提取的基因組DNA的濃度為150(T2500ng/^l。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中國少鱗鱖地域群體的分子鑒定方法，其特征在于步驟2)中所述的PCR反應(yīng)體系為DNA 模板0.25ulIOxTaq PCR Mg2"緩沖液1.25uldNT'Ps0.25ul上游引物0.25ul下游引物0.25ulrTaq 酶0.125ul去離子水補(bǔ)齊至12.5ul
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中國少鱗鱖地域群體的分子鑒定方法，其特征在于步驟2)中所述的PCR反應(yīng)的程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min，94°C變性30s，60°C退火45s，72°C延伸Imin共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后再72°C延伸lOmin，反應(yīng)結(jié)束后取出4°C保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中國少鱗鱖地域群體的分子鑒定方法，其特征在于步驟3)中所述非變性聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量濃度為8%。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于中國少鱗鱖不同地域群體間的微衛(wèi)星分子鑒定方法。其主要包括以下步驟基因組DNA的提取、目的基因的擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的電泳檢測及銀染鑒定。方法中還包括一對(duì)SSR引物和標(biāo)準(zhǔn)圖譜。本發(fā)明的分子鑒定法能快速分辨出中國少鱗鱖四個(gè)地域中兩個(gè)群體與其他兩個(gè)群體的不同，不僅具有客觀、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)于中國少鱗鱖種質(zhì)資源的保護(hù)、遺傳育種、親緣鑒定等都有著重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103255218SQ20131014533
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月24日
發(fā)明者梁旭方, 趙程, 楊敏, 田昌緒, 鄭荷子, 竇亞琪 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)