專利名稱：油茶良種長林55號的分子特異性標(biāo)記引物及鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及油茶良種長林55號的分子特異性標(biāo)記引物，以及利用該引物對油茶良種長林55號進(jìn)行快速鑒定的方法。
背景技術(shù)：
油茶是我國栽植面積最大、分布范圍較廣的木本油料樹種。大力發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)，對保障糧油安全，促進(jìn)農(nóng)民增收，推進(jìn)山區(qū)綜合開發(fā)和建設(shè)社會主義新農(nóng)村，都具有十分重要的意義。我國油茶產(chǎn)業(yè) 方興未艾，發(fā)展?jié)摿薮蟆Ｄ壳?，我國油茶林總面積達(dá)4500多萬畝，但產(chǎn)量很低，每畝產(chǎn)茶油僅4公斤左右。其根本原因是，絕大部分油茶林品種品質(zhì)差或嚴(yán)重退化，而大量的國家和省級審(認(rèn))定的優(yōu)良品種又未推廣應(yīng)用。同時，一些地方種苗質(zhì)量意識淡薄，經(jīng)營管理粗放。為保障油茶產(chǎn)業(yè)又好又快發(fā)展，要充分認(rèn)識油茶良種對發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)的重要性，必須加快油茶優(yōu)良種苗發(fā)展和強(qiáng)化質(zhì)量管理。我國目前對油茶種苗質(zhì)量的監(jiān)督管理，主要依靠在管理層面制定的各項制度，而在技術(shù)層面尚未取得關(guān)鍵性突破，特別是缺乏油茶良種的早期快速鑒別技術(shù)體系。目前通過國家林木良種審定的9個長林品種系列分別為3號、4號油茶是我國栽植面積最大、分布范圍較廣的木本油料樹種。大力發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)，對保障糧油安全，促進(jìn)農(nóng)民增收，推進(jìn)山區(qū)綜合開發(fā)和建設(shè)社會主義新農(nóng)村，都具有十分重要的意義。我國油茶產(chǎn)業(yè)方興未艾，發(fā)展?jié)摿薮?。目前，我國油茶林總面積達(dá)4500多萬畝，但產(chǎn)量很低，每畝產(chǎn)茶油僅4公斤左右。其根本原因是，絕大部分油茶林品種品質(zhì)差或嚴(yán)重退化，而大量的國家和省級審(認(rèn))定的優(yōu)良品種又未推廣應(yīng)用。同時，一些地方種苗質(zhì)量意識淡薄，經(jīng)營管理粗放。為保障油茶產(chǎn)業(yè)又好又快發(fā)展，要充分認(rèn)識油茶良種對發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)的重要性，必須加快油茶優(yōu)良種苗發(fā)展和強(qiáng)化質(zhì)量管理。、18號、21號、23號、27號、40號、53號、55號。這些油茶良種具有早實豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、出籽率高、含油量高、抗性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)。對油茶種苗質(zhì)量的監(jiān)督管理要著力解決目前生產(chǎn)上油茶種苗的混亂局面，并首先從技術(shù)層面上對長林油茶良種進(jìn)行鑒別保護(hù)。對油茶品種的鑒別主要依據(jù)表觀特征，但由于許多形態(tài)性狀鑒定的周期長、受環(huán)境影響大，并且品種數(shù)量不斷增多，使得品種鑒定愈來愈困難。自本世紀(jì)以來，一些基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)如RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)、ISSR (Inter-Simple Sequence Repea,簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性)和SRAP(sequence-related amplified polymorphism,相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性)相繼用于油茶的種質(zhì)資源遺傳多樣性、遺傳距離研究，但對于分子標(biāo)記與油茶性狀的連鎖、油茶品種間的分子鑒別研究很少，況且這些分子標(biāo)記所采用的或為通用隨機(jī)引物或為成套設(shè)計引物的隨機(jī)組合，其PCR擴(kuò)增圖譜不僅復(fù)雜、重復(fù)性差，而且特異性不高，因此并不適合用于品種鑒定。SCAR (Sequence Characterized Amplified Region,特征性片段擴(kuò)增區(qū)域)標(biāo)記是 1993 年由Paran和Michelmore在RAPD基礎(chǔ)上提出的，它基于對特異RAPD片段的測序，根據(jù)兩端序列設(shè)計一對18 24堿基的引物，在較高的退火溫度下進(jìn)行特異擴(kuò)增實現(xiàn)的，其專一性引物的采用排除了隨機(jī)引物結(jié)合位點(diǎn)之間的競爭，因而它是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有迅速、簡便、低成本的特點(diǎn)，迄今為止，尚未有SCAR標(biāo)記應(yīng)用于油茶品種鑒別的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的提供油茶良種長林55號的分子特異性標(biāo)記引物，以及一種能對油茶良種長林55號進(jìn)行快速鑒定的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:油茶良種長林55號的分子特異性標(biāo)記引物，所述引物序列為:上游引物:5'-CATACATACACTTCCTAAGCCAAAA-3'；上游引物:5'-GTTCAAGCATTGTTCAAGCACTC-3'。該引物對是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過大量篩選試驗，采用ISSR標(biāo)記為引物獲得油茶良種長林55號的特異性DNA片段，將該片段克隆測序，以得到的DNA序列為基礎(chǔ)，所設(shè)計的特異性引物，以該引物對油茶良種長林55號進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得約900bp大小的特異性片段。需要說明的是，本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物僅限于油茶良種的鑒定(鑒定其是否為長林55號)，即待測樣品僅限于油茶。本發(fā)明還涉及一種所述的分子特異性標(biāo)記引物對油茶良種長林55號進(jìn)行鑒定和檢測的方法，所述方法為:提取待測油茶品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)約900bp的DNA條帶，則待測菌種為油茶良種長林55號；反之則否；

所述分子特異性標(biāo)記引物序列為:上游引物:5'-CATACATACACTTCCTAAGCCAAAA-3'；上游引物:5'-GTTCAAGCATTGTTCAAGCACTC-3'。所述方法關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物的選擇，DNA提取、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件確定，以及電泳檢測，均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。優(yōu)選的，本發(fā)明所述PCR反應(yīng)體系組成如下:PCR Buffer 終濃度為 IXdNTPsImmol /I,MgCl22.Smmol /I,Taq DNA 酶 1.0U/ 反應(yīng)上、下游引物各0.4μΜ模板DNA60ng/ 反應(yīng)余量為ddH20 ；PCR反應(yīng)條件如下:95°C預(yù)變性 4min 后；95°C變性 lmin，60°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共 30 個循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C。PCR Buffer終濃度為IX，是指PCR Buffer中各組分在反應(yīng)體系中的濃度與IXPCR Buffer相同，通常選用體積為反應(yīng)體系體積1/10的10XPCR Buffer。10XPCRBuffer 成分為:100mM Tris-HCl (ρΗ8.5)、500mM KCl、25mM MgCl2 和 1.0%Triton-X_100，溶劑為ddH20。具體的，本發(fā)明所述方法如下:(I)取待測油茶葉片0.0lg，加液氮徹底磨碎，以SDS-CTAB法提取待測油茶葉片的基因組DNA ；(2)以步驟(I)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系每25 μ I組成如下:10XPCR Buffer 2.5 μ I10mmol/L dNTPs2.5 μ I25mmol/L MgCl22.5 μ I
5U/ μ I Taq DNA 酶0.2 μ I10 μ M上、下游引物各 μ 20ng/ μ I 模板 DNA3 μ IddH20 補(bǔ)足至 25 μ I ;PCR反應(yīng)條件如下:95°C預(yù)變性 4min 后；95°C變性 lmin，60°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共 30 個循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C ；(3)取步驟(2)擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ 1，與I μ 10.25%溴酚蘭緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于I X TAB緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，EB染色通常在含0.5 μ g/mlEB的水溶液中染色30分鐘。于自動凝膠圖像分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)約900bp大小的DNA條帶，則待測樣品為油茶良種長林55號。本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物可對油茶良種長林55號進(jìn)行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，是表觀特征辨別油茶良種所不能替代的分子手段。


圖1為對油茶良種進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果；M*DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；箭頭所指為從編號為9的油茶良種長林55號擴(kuò)增出的分子量約900bp大小的特殊DNA條帶；其余編號為其它的油茶良種。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:實施例1:(I)油茶良種基因組DNA的提取:取待測油茶良種幼嫩葉片0.0lg，加液氮徹底磨碎，基因組DNA的提取采用SDS-CTAB法，經(jīng)多次抽提，來提取獲得油茶良種的基因組DNA粗提物。DNA粗提物再經(jīng)Magabio核酸純化試劑盒進(jìn)行純化(博日Bioer，杭州，中國)后，通過
1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和DNA/RNA紫外分光光度計(GeneQuant Pro，GE Healthcare)來檢測完整性、純度及濃度。OD260/OD280>l.8的DNA樣品用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。DNA提取物于_20°C冰箱貯藏備用。(2)設(shè)計特異PCR擴(kuò)增引物，引物對的序列為上游引物5' -CATACATACACTTCCTAAGCCAAAA-3 '和下游引物 5' -GTTCAAGCATTGTTCAAGCACTC-3 '，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。(3 ) SCAR分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系組成:10XPCR Buffer2.5μ 1，10mmol/L dNTPs2.5 μ l,25mmol/L MgCl22.5 μ 1，5U/μ ITaq DNA 酶 0.2 μ I，IOmM 特異引物對各 I μ l,20ng/y I 模板 DNA3 μ 1，ddH20 補(bǔ)足至 25 μ I。擴(kuò)增反應(yīng)在TC-XP型擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增條件:95°C預(yù)變性4min后；95°C變性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C。(4)電泳檢測:取步驟(3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ul，與Iul0.25%溴酚蘭緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于IXTAB緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，在含
0.5 μ g/mlEB的水溶液中染色30分鐘，然后在培清JS-380A自動凝膠圖像分析儀上照相。按照上述方法，分別對多個油茶良種(編號I 10代表油茶良種依次為:1:長林3號；2:長林4號3:長林18號；4:長林21號；5:長林27號；6:長林32號；7:長林40號；8:長林53號；9:長林55號；10:長林66號)進(jìn)行檢測，電泳結(jié)果見圖1。其中編號為9的油茶良種長林55號，擴(kuò)增出了分子量約900bp大小的特殊DNA條帶，其余編號為其他油茶良 種，未見有900bp大小的特殊DNA條帶產(chǎn)生。
權(quán)利要求
1.油茶良種長林55號的分子特異性標(biāo)記引物，所述引物序列如下: 上游引物:5' -CATACATACACTTCCTAAGCCAAAA-3'； 上游引物:5' -GTTCAAGCATTGTTCAAGCACTC-3'。
2.一種利用權(quán)利要求1所述的分子特異性標(biāo)記引物對油茶良種長林55號進(jìn)行快速鑒定的方法，所述方法為:提取待測油茶品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)900bp的DNA條帶，則待測菌種為油茶良種長林55號； 所述分子特異性標(biāo)記引物序列為: 上游引物:5' -CATACATACACTTCCTAAGCCAAAA-3'； 上游引物:5' -GTTCAAGCATTGTTCAAGCACTC-3'。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增條件如下:95°C預(yù)變性4min；95°C變性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下: (1)取待測油茶葉片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待測油茶葉片的基因組DNA； (2)以步驟(I)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增: PCR反應(yīng)體系每25 μ I組成如下: .10XPCR Buffer2.5 μ I .10mmol/L dNTPs2.5 μ I .25mmol/L MgCl22.5 μ I.5U/ μ I Taq DNA 酶 0.2 μ I.10 μ M上、下游引物各Ιμ .20ng/ μ I 模板 DNA 3 μ IddH20 補(bǔ)足至 25 μ I ; PCR反應(yīng)條件如下: .95°C預(yù)變性4min ;95°C變性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；最后于.72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C ； (3)取步驟(2)擴(kuò)增產(chǎn)物5μ 1，與I μ 10.25%溴酚蘭緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于I XTAB緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動凝膠圖像分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)900bp大小的DNA條帶，則待測油茶為油茶良種長林55號。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種油茶良種長林55號的分子特異性標(biāo)記引物，所述引物序列如下上游引物5′-CATACATACACTTCCTAAGCCAAAA-3′；上游引物5′-GTTCAAGCATTGTTCAAGCACTC-3′。本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物可對油茶良種長林55號進(jìn)行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，是表觀特征辨別油茶良種所不能替代的分子手段。
文檔編號C12Q1/68GK103205424SQ20131012513
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月10日
發(fā)明者王麗玲, 李海波, 劉本同, 錢華, 王衍彬 申請人:浙江省林業(yè)科學(xué)研究院