專利名稱：含Levan果聚糖的酸奶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含Levan果聚糖的酸奶的制備方法，屬于乳制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Levan果聚糖是一類來源于植物或微生物的果聚糖，分子中含有大量β -(2，6)_果糖苷鍵組成的聚糖主鏈及少量β -(2，I) -果糖苷鍵組成的支鏈，與主要是由β-(2，I)-果糖苷鍵組成的菊粉(Inulin)類果聚糖顯著不同。來源于植物的Levan果聚糖分子量在2000 3，3000Da范圍內(nèi)，而來源于微生物的Levan果聚糖分子量較高，通常在
2X IO6 100X 106Da。Levan果聚糖是功能性食品的重要組成部分，不易被人體消化，且熱量低，微生物來源的Levan果聚糖具有一定的抗腫瘤、抗內(nèi)毒素、降膽固醇、降血糖等免疫保健功能。Levan果聚糖可通過微生物L(fēng)evan鹿糖酶(Levansucrase, EC2.4.1.10)以鹿糖為底物轉(zhuǎn)果糖基聚合而成，反應(yīng)同時(shí)還會(huì)生成低聚果糖。近年來，酸奶等乳制品越來越得到消費(fèi)者的青睞，尤其添加功能性低聚糖的成品酸奶更是備受關(guān)注，但目前酸奶中添加的功能性低聚糖的品種較少。此外，由于功能性多糖制備純化工藝較為繁瑣、成本高，因而添加功能性多糖的成品酸奶的研究和開發(fā)還是空白。目前酸奶中所添加的成本較低的多糖一般僅作為增稠劑使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種含Levan果聚糖的酸奶的制備方法。本發(fā)明技術(shù)方案如下:含Levan果聚糖的酸奶的制備方法，包括如下步驟:(I)將產(chǎn)Levan鹿糖酶的菌株進(jìn)行活化培養(yǎng),將活化菌以I 10% (v/v)的接種量接種于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 45°C的條件下培養(yǎng)16 48小時(shí)，獲得最終發(fā)酵培養(yǎng)液；上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，單位為g/L:牛肉膏0.5 20，酵母粉0.2 10，磷酸二氫鉀2.5 10，磷酸氫二鉀2.5 10，氯化鈉0.2 5，蔗糖或棉籽糖10 200，七水硫酸鎂0.1 1，ρΗ4.0 8.0。(2)將步驟(I)中獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液以10000 12000轉(zhuǎn)/分的速度，離心25 30分鐘，收集發(fā)酵液上清或者菌體；(3)將步驟(2)制得的發(fā)酵液上清置于冰浴中，然后添加硫酸銨粉末至飽和度達(dá)到60 80%，在10000 12000轉(zhuǎn)/分的條件下離心25 30分鐘，收集沉淀即為蛋白沉淀；或者，將步驟(2)制得的菌體經(jīng)超聲波破碎離心，上清液置于冰浴中，然后添加硫酸銨粉末至飽和度達(dá)到60 80%，在10000 12000轉(zhuǎn)/分的條件下離心25 30分鐘，收集沉淀即為蛋白沉淀；將蛋白沉淀重懸于30 50ml的20 100mM、pH7.0 9.0的Tris-HCL緩沖液中，透析除鹽得到粗酶液；將粗酶液進(jìn)行DEAE陰離子交換柱純化，獲得純酶蛋白Levansucrase ；(4)按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5 15%的添加量向原料奶中添加蔗糖，攪拌均勻，然后按每百毫升原料奶添加100 300 μ g的比例添加步驟(3)中制得的純酶蛋白Levansucrase,按原料奶質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為4% 10%的接種量接種乳酸桿菌，混合均勻，在40 45°C條件下，密封靜置4 8小時(shí)，然后在4°C條件下冷藏6 24h，制得含Levan果聚糖的酸奶。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，還包括向步驟(4)制得的含Levan果聚糖的酸奶中添加食品添加劑的步驟。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的產(chǎn)Levan蔗糖酶的菌株選自:地衣芽孢桿菌ATCC14580(Bacillus licheniformis)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)CICC10232、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) ATCC6051或產(chǎn)左聚糖微桿菌(Microbacteriumlaevaniformans) ATCC15953 之一。上述ATCC為美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收減中心囷種保減中心縮與，CICC為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心縮寫。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟(I)中的產(chǎn)Levan蔗糖酶的菌株選自地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis) ATCC14580。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的活化培養(yǎng)為在20 45°C的條件下，于LB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)8 24小時(shí)；LB培養(yǎng)基組分如下，單位為g/L:酵母粉5，蛋白胨10，NaCllO, pH7.0。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，單位為g/L:牛肉膏1.0，酵母粉0.6，磷酸二氫鉀3.0，磷酸氫二鉀3.0，氯化鈉1.0，蔗糖100，七水硫酸鎂
0.2, pH5.0。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中的Tris-HCl緩沖液為50mM、pH7.5的緩沖液。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中超聲波破碎條件為超聲功率400W，超聲間隔5s，超聲時(shí)間30min。所述步驟(4)中的乳酸桿菌為保加利亞乳桿菌CICC6046、嗜熱鏈球菌CICC6038等酸奶制備用菌。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中乳酸桿菌的接種量為4%。有益效果1、本發(fā)明通過先制備純酶蛋白Levansucrase,然后將純酶蛋白Levansucrase、鹿糖添加到牛奶中，接種乳酸菌，在牛奶發(fā)酵的同時(shí)合成Levan果聚糖和部分低聚果糖，該工藝簡(jiǎn)單合理，避免了直接添加Levan果聚糖或低聚果糖的高成本問題；并且所獲得的酸奶中的Levan果聚糖具有免疫保健和增稠劑的雙重功能，低聚果糖具有益生元功能，極大提升了酸奶產(chǎn)品的附加值，減少了其他增稠劑的添加量。2、本發(fā)明利用微生物L(fēng)evan蔗糖酶在酸奶發(fā)酵的同時(shí)生成Levan果聚糖，從而直接獲得含有功能性多糖的酸奶新品種，避免了復(fù)雜的多糖純化工藝，操作簡(jiǎn)單，成本低，應(yīng)用前景廣闊。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。菌種來源地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心囷種保減中心；發(fā)酵運(yùn)動(dòng)單胞菌(Zymomonasmobilis) CICC10232購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；產(chǎn)左聚糖微桿菌(Microbacteriumlaevaniformans) ATCC15953 購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心；德式保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulqaricus)CICC6046購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophiIus) CICC6038購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種
保藏管理中心；所得產(chǎn)品酸奶的糖組成采用薄層掃描分析法分析，設(shè)備及條件如下:取制得的酸奶煮沸離心后取上清，將上清稀釋10倍左右后取0.5μ I在薄層層析板(Silica gel60, Merck)上點(diǎn)樣,在展層劑(正丁醇:無水乙醇:水=5:3:2)中展開,霧噴顯色劑(20%硫酸溶液+0.5%的3，5- 二羥基甲苯)，于120°C烘烤5分鐘，糖斑點(diǎn)顯色后，將薄板掃描后通過軟件ImageJ vl.28 (http://rsb.1nf0.nih.gov/i j/)進(jìn)行定量分析。苯酚-硫酸法檢測(cè)所得產(chǎn)品酸奶中糖含量所用設(shè)備及條件如下:取制得的Levan果聚糖酸奶煮沸離心后上清中加入體積分?jǐn)?shù)為1/1的冷乙醇，靜置12h后離心取沉淀即為L(zhǎng)evan多糖，沉淀用90%乙醇洗滌3次后用苯酚-硫酸法測(cè)定Levan含量。實(shí)施例1含Levan果聚糖的酸奶的制備方法，包括如下步驟:(I)將地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) ATCC14580菌株接種于LB培養(yǎng)基中，在30°C的條件下，活化培養(yǎng)12小時(shí)，將活化菌以4% (v/v)的接種量接種于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C、200轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)24小時(shí)，制得發(fā)酵培養(yǎng)液；上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，單位為g/L:牛肉膏1.0，酵母粉0.6，磷酸二氫鉀3.0，磷酸氫二鉀3.0，氯化鈉1.0，蔗糖100，七水硫酸鎂0.2，ρΗ5.0。(2)將步驟(I)中獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液以12000轉(zhuǎn)/分的速度，離心30分鐘，收集發(fā)酵液上清；(3)將步驟(2)制得的發(fā)酵液上清置于冰浴中，然后添加硫酸銨粉末至飽和度達(dá)到80%，在12000轉(zhuǎn)/分的條件下離心25分鐘，收集沉淀即為蛋白沉淀；將蛋白沉淀重懸于50ml的50mM、pH7.5的Tris-HCL緩沖液中，透析除鹽得到粗酶液；將粗酶液進(jìn)行DEAE陰離子交換柱(GE Healthcare)純化，獲得純酶蛋白Levansucrase ；(4)按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為8%的添加量向原料奶中添加蔗糖，攪拌均勻，然后按每百毫升原料奶添加200 μ g的添加量添加步驟(3)中制得的純酶蛋白Levansucrase,按原料奶質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為4%的接種量接種保加利亞乳桿菌CICC6046、嗜熱鏈球菌CICC6038，混合均勻，在40°C條件下，密封靜置6小時(shí)，然后在4°C條件下冷藏12h，制得含Levan果聚糖的酸奶。
經(jīng)薄層掃描分析檢測(cè)，所得的Levan果聚糖酸奶中其糖組分含量比例為:Levanl2.1%，低聚果糖19.5%，乳糖19.5%，葡萄糖和果糖15.8%，蔗糖33.1%。經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)得產(chǎn)品中Levan含量為15.lmg/ml。用Viscometer Brookfield DV-E型粘度計(jì)(美國(guó))測(cè)量含Levan果聚糖酸奶的粘度，所用轉(zhuǎn)速為12轉(zhuǎn)/分，溫度為30°C。經(jīng)測(cè)定，用上述方法制備得到的酸奶的粘度為2310cP。實(shí)施例2如實(shí)施例1所述的含Levan果聚糖的酸奶的制備方法，不同之處在于:步驟(I)中:產(chǎn)Levan鹿糖酶的菌株為發(fā)酵運(yùn)動(dòng)單胞菌(Zymomonas mobilis)CICC10232。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，單位為g/L:牛肉膏1.0，酵母粉10.0，磷酸二氫鉀2.0，磷酸氫二鉀2.0,氯化鈉1.0，蔗糖150，七水硫酸鎂0.3，pH6.0。將活化菌以4% (v/v)的接種量接種于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C、200轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)28小時(shí),制得發(fā)酵培養(yǎng)液；步驟(3)中，將步驟(2)獲得的菌體經(jīng)超生波破碎后，離心，上清液置于冰浴中，然后添加硫酸銨粉末至飽和度達(dá)到60%，在12000轉(zhuǎn)/分的條件下離心25分鐘，收集沉淀即為蛋白沉淀；純化方法與實(shí)施例1相同。酸奶制備過程與實(shí)施例1相同。經(jīng)薄層掃描分析檢測(cè)，所得的Levan果聚糖酸奶中其糖組分含量比例為L(zhǎng)evanl0.8%，低聚果糖17.3%，乳糖20.3%，葡萄糖和果糖12.3%，蔗糖39.3%。經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)得產(chǎn)品中Levan含量為12.9mg/ml。經(jīng)粘度計(jì)測(cè)得酸奶粘度為2189cP。實(shí)施例3如實(shí)施例2所述的含Levan果聚糖的酸奶的制備方法，不同之處在于:步驟(I)中:產(chǎn)Levan鹿糖酶的菌株為產(chǎn)左聚糖微桿菌(Microbacteriumlaevaniformans) ATCC15953。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，單位為g/L:牛肉膏10，酵母粉3，磷酸二氫鉀10，磷酸氫二鉀10，氯化鈉1.0，蔗糖30，七水硫酸鎂 0.5，pH6.5。培養(yǎng)條件與實(shí)施例1相同。酶的制備及酸奶制備過程與實(shí)施例1相同經(jīng)薄層掃描分析檢測(cè)，所得的Levan果聚糖酸奶中其糖組分含量比例為L(zhǎng)evan8.7%，低聚果糖15.2%，乳糖19.3%，葡萄糖和果糖13.3%，蔗糖43.5%。經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)得產(chǎn)品中Levan含量為10.3mg/ml。經(jīng)粘度計(jì)測(cè)得酸奶粘度為2015cP。對(duì)比例按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為8%的添加量向原料奶中添加蔗糖，攪拌均勻，然后按原料奶質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為4%的接種量接種保加利亞乳桿菌CICC6046、嗜熱鏈球菌CICC6038，混合均勻，在40°C條件下，密封靜置6小時(shí)，然后在4°C條件下冷藏12h。檢測(cè)制得的酸奶的粘度為1573cP。
在實(shí)施例中，最終酸奶成品的粘度一般在2000cP以上，而不加Levan蔗糖酶制得的酸奶的粘度只有1573cP，故本申請(qǐng)所述技術(shù)方案可以少加或不加增稠劑。
權(quán)利要求
1.含Levan果聚糖的酸奶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (I)將產(chǎn)Levan蔗糖酶的菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)，將活化菌以I 10% (v/v)的接種量接種于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 45°C的條件下培養(yǎng)16 48小時(shí)，獲得最終發(fā)酵培養(yǎng)液； 上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，單位為g/L: 牛肉膏0.5 20，酵母粉0.2 10，磷酸二氫鉀2.5 10，磷酸氫二鉀2.5 10，氯化鈉0.2 5，蔗糖或棉籽糖10 200，七水硫酸鎂0.1 1，pH4.0 8.0。(2)將步驟(I)中獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液以10000 12000轉(zhuǎn)/分的速度，離心25 30分鐘，收集發(fā)酵液上清或者菌體； (3)將步驟(2)制得的發(fā)酵液上清置于冰浴中，然后添加硫酸銨粉末至飽和度達(dá)到60 80%，在10000 12000轉(zhuǎn)/分的條件下離心25 30分鐘，收集沉淀即為蛋白沉淀；或者，將步驟(2)制得的菌體經(jīng)超聲波破碎離心，上清液置于冰浴中，然后添加硫酸銨粉末至飽和度達(dá)到60 80%，在10000 12000轉(zhuǎn)/分的條件下離心25 30分鐘，收集沉淀即為蛋白沉淀； 將蛋白沉淀重懸于30 50ml的20 100mM、pH7.0 9.0的Tris-HCL緩沖液中，透析除鹽得到粗酶液；將粗酶液進(jìn)行DEAE陰離子交換柱純化，獲得純酶蛋白Levansucrase ； (4)按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5 15%的添加量向原料奶中添加蔗糖，攪拌均勻，然后按每百毫升原料奶添加100 300 μ g的比例添加步驟(3)中制得的純酶蛋白Levansucrase,按原料奶質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為4% 10%的接種量接種乳酸桿菌，混合均勻，在40 45°C條件下，密封靜置4 8小時(shí),然后在4°C條件下冷藏6 24h,制得含Levan果聚糖的酸奶。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，還包括向步驟(4)制得的含Levan果聚糖的酸奶中添加食品添加劑的步驟。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中的產(chǎn)Levan鹿糖酶的菌株選自:地衣芽抱桿菌ATCC14580(Bacillus licheniformis)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis) CICC10232、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) ATCC6051 或產(chǎn)左聚糖微桿菌(Microbacterium laevaniformans) ATCC15953 之一。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于,所述步驟(I)中的產(chǎn)Levan鹿糖酶的菌株選自地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis) ATCC14580。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中的活化培養(yǎng)為在20 450C的條件下，于LB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)8 24小時(shí)； LB培養(yǎng)基組分如下，單位為g/L:酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，pH7.0。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，單位為g/L:牛肉膏1.0，酵母粉0.6，磷酸二氫鉀3.0，磷酸氫二鉀3.0,氯化鈉1.0，蔗糖100，七水硫酸鎂0.2，ρΗ5.0。
7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的Tris-HCl緩沖液為50mM、pH7.5的緩沖液。
8.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中超聲波破碎條件為超聲功率400W，超聲間隔5s，超聲時(shí)間30min。
9.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中乳酸桿菌的接種量為4% ο
全文摘要
本發(fā)明涉及含Levan果聚糖的酸奶的制備方法，包括如下步驟(1)將產(chǎn)Levan蔗糖酶的菌株經(jīng)活化培養(yǎng)和產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)制得發(fā)酵培養(yǎng)液；(2)離心收集發(fā)酵液上清或者菌體；(3)向發(fā)酵液上清中添加硫酸銨粉末，離心，收集蛋白沉淀；或者，將菌體經(jīng)超聲波破碎離心后，上清液中添加硫酸銨粉末，離心，收集蛋白沉淀；純化后制得純酶蛋白Levansucrase；(4)向原料奶中添加蔗糖和純酶蛋白Levansucrase，然后接種乳酸桿菌，經(jīng)發(fā)酵，制得含Levan果聚糖的酸奶。本發(fā)明利用微生物L(fēng)evan蔗糖酶在酸奶發(fā)酵的同時(shí)生成Levan果聚糖，從而直接獲得含有功能性多糖的酸奶新品種，避免了復(fù)雜的多糖純化工藝，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12R1/10GK103190478SQ20131012181
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者肖敏, 付峰, 盧麗麗 申請(qǐng)人:山東大學(xué)