專利名稱：與修飾的聚糖相關(guān)的方法
與修飾的聚糖相關(guān)的方法本申請要求于2008年12月19日提交的美國臨時專利申請序列號61/139，2M的優(yōu)先權(quán)，其全部披露通過引用結(jié)合在此。背景對于結(jié)合糖(例如糖蛋白)上的聚糖的修飾通常顯著地影響該結(jié)合糖的功能。例如，聚糖修飾可以影響糖蛋白正確折疊的能力、穩(wěn)定性(例如，對蛋白質(zhì)分解和/或其他降解的耐受性)、催化活性、藥效學(xué)和/或藥物代謝動力學(xué)特性、和/或與其他分子的相互作用。糖蛋白的聚糖修飾可以影響該糖蛋白的轉(zhuǎn)運和靶向。例如，糖蛋白的聚糖修飾可以影響該糖蛋白是否保留在細胞內(nèi)(包括，例如將該糖蛋白正確地靶向到正確的一個或多個亞細胞區(qū)室中)，該糖蛋白是否將是膜結(jié)合的和/或該糖蛋白是否將是從細胞中分泌的。概述聚糖通常通過唾液酸化(即，通過加入一種唾液酸)來修飾。當(dāng)分析糖蛋白時通常忽略了對聚糖的非常規(guī)修飾，例如硫酸化、磷酸化以及多乙酰化唾液酸化(例如，二乙酰化唾液酸化)。這類修飾可能被忽略至少部分是由于它們的分析的復(fù)雜性以及這類修飾的不穩(wěn)定性。本披露包括以下認(rèn)識，即雖然如此，非常規(guī)修飾是生物學(xué)相關(guān)的并且用于對它們進行鑒別和定量的方法是令人希望的。除其他事項之外，本披露提供了用于對非常規(guī)修飾的聚糖進行富集、鑒別、檢測和 /或定量的方法。在很多實施方案中，這些方法包括提供一種聚糖制品(例如唾液酸酶處理過的聚糖制品)，從該聚糖制品中已經(jīng)釋放了唾液酸類。這種制品包括聚糖(即，耐唾液酸酶的聚糖)，這些聚糖沒有被釋放唾液酸的處理所切割。所提供的方法典型地包括使所提供的聚糖制品經(jīng)受一種分離技術(shù)，該技術(shù)將具有一個第一電荷的聚糖類與不帶電的聚糖類和 /或具有一個第二電荷的聚糖類分開，和/或基于聚糖的荷質(zhì)比來分離它們；并且任選地對分離出的聚糖進行定量。在很多實施方案中，定量包括使用至少一種定量標(biāo)準(zhǔn)物。附圖簡要描述


圖1描繪了一個示例性的N-連接的聚糖的結(jié)構(gòu)。圖2描繪了聚糖中修飾的殘基的非限制性實例甘露糖-6-磷酸(M6P)和6_磺酸基-N-乙酰葡糖胺(6-磺酸基-GlcNAc)。為了清楚起見，在沒有另外的修飾下描繪了一種常見唾液酸的結(jié)構(gòu)(N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac))。正常地乙?；霈F(xiàn)在位置5處(已示出)；在位置7、8、和9處可以發(fā)生另外的乙?；?。如在此所使用的，關(guān)于唾液酸“多乙?；?是指在位置7、8、和9中兩個或更多個位置處另外的乙?；ｊP(guān)于唾液酸使用“二乙?；?來指在位置7、8、和9中兩個位置處另外的乙酰化。圖3描繪了在唾液酸酶處理后，從一個中國研究來源獲得的，從具有生物活性的促紅細胞生成素治療性糖蛋白衍生的非常規(guī)修飾的種類的一種陰離子交換層析-高效液相色譜(AEX-HPLC)圖。插圖描繪了使用2-氨基苯甲酰胺-殼二糖作為外標(biāo)物的一個校準(zhǔn)曲線。在此被鑒別為非常規(guī)修飾的種類的這些峰被進一步鑒別為磷酸化的N-聚糖和硫酸化的聚糖。圖4描繪了在唾液酸酶處理后，從具有與圖3中所描述的促紅細胞生成素治療性糖蛋白97%的氨基酸序列一致性，具有生物活性的感興趣的一種第二糖蛋白衍生的非常規(guī)修飾的種類的一種陰離子交換層析-高效液相色譜(AEX-HPLC)圖，。在此被鑒別為非常規(guī)修飾的種類的這些峰被進一步鑒別為磷酸化的N-聚糖和硫酸化的聚糖。圖5描繪了來自硫酸化的聚糖的色譜分析的結(jié)果，這些聚糖是從小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的單克隆抗EGFR抗體衍生的。通過質(zhì)譜法來鑒別該峰內(nèi)聚糖的構(gòu)成。例如在圖B中所使用的命名法中，"5,4,1，0，0+S03” 相應(yīng)于 HexNAc5、Hex4、Fuel、NeuAcO、NeuGcO+ —個硫酸鹽。圖6描繪了來自硫酸化的和二乙?；僖核峄木厶堑纳V分析的結(jié)果，這些聚糖是從來自一個單克隆(克隆1)的CTLA4-IgG衍生的。通過質(zhì)譜法來鑒別該峰內(nèi)聚糖的構(gòu)成。圖7描繪了來自硫酸化的和二乙?；僖核峄木厶堑纳V分析的結(jié)果，這些聚糖是從來自兩個不同的單克隆(克隆2，上圖；克隆3，下圖)的CTLA4-IgG衍生的。定義乙?；缭诖怂褂玫模g(shù)語“乙?；?也稱作“乙?；鶊F”并且通?？s寫為 “Ac”)被用于此處是指具有化學(xué)式-COCH3的官能團。乙酰化如在此所使用的，術(shù)語“乙?；笔侵竿ㄟ^共價地加入一個乙酰基團來進行修飾。例如，一種乙?；木厶鞘峭ㄟ^共價地加入一個或多個乙?；鶊F來進行修飾的一種聚糖。乙?；木厶强梢曰虿豢梢跃哂辛硗獾男揎棥Ｒ阴；缭诖怂褂玫模g(shù)語“乙?；?在IUPAC命名法中也被稱作“乙酰基團化”)是指將一個或多個乙?；鶊F共價地加到一個分子上(例如，一種聚糖上)的過程。大致、約、大約如在此所使用的，當(dāng)應(yīng)用于感興趣的一個或多個值時，術(shù)語“大致”、“約”或“大約”是指類似于所說明的參考值的一個數(shù)值。在某些實施方案中，術(shù)語“大致”、“約”或“大約”是指落在所說明的參考值的25^^20^^19^^18^^17^^16%. 15%、 14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少之內(nèi)的數(shù)值的一個范圍。生物樣品如在此所使用的，術(shù)語“生物樣品”是指從任何活細胞或生物體獲得的、 由其排泄的或由其分泌的任何固體或液體樣品，包括但不限于組織培養(yǎng)物、生物反應(yīng)器樣品、人或動物的組織、植物、果實、蔬菜、單細胞的微生物(例如，細菌以及酵母)以及多細胞的生物體。例如，生物樣品可以是從以下各項得到的一種生物液體例如，血液、血漿、血清、 尿液、膽汁、精液、腦脊髓液、房水或玻璃體液、或任何一種身體的分泌物、一種滲出液、一種溢泌物(例如，從膿腫或感染或炎癥的任何其他部位獲得的液體)、或者從關(guān)節(jié)獲得的液體 (例如，正常的關(guān)節(jié)或被疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)或膿毒性關(guān)節(jié)炎)侵襲的關(guān)節(jié))。生物樣品還可以是例如，從任何器官或組織(包括活檢或尸檢樣本)獲得的樣品，可以包括細胞(不論是原代細胞或培養(yǎng)細胞)，任何細胞的條件培養(yǎng)基、組織或器官、組織培養(yǎng)物。 細胞表面糖蛋白如在此所使用的，術(shù)語“細胞表面糖蛋白”是指一種糖蛋白，其至少一部分存在于細胞的外表面上。在一些實施方案中，細胞表面糖蛋白是一種蛋白，該蛋白被定位在細胞表面上，這樣使得這些聚糖結(jié)構(gòu)中至少一個存在于該細胞的外表面上。
細胞表面聚糖“細胞表面聚糖”是一種聚糖，該聚糖存在于細胞的外表面上。在本披露的多個實施方案中，細胞表面聚糖作為細胞表面糖蛋白的一部分被共價地連接到一個多肽上。細胞表面聚糖還可以被連接到細胞膜的類脂上。相關(guān)聯(lián)如在此所使用的，術(shù)語“相關(guān)聯(lián)”是指在兩個事物之間建立一種可預(yù)測的關(guān)系。在此所描述的實施方案中，細胞的表面上的糖基化模式(或其一種特征)是與由該細胞所生成的一種目標(biāo)結(jié)合糖(例如，糖蛋白)的糖基化模式(或其一種特征)相關(guān)聯(lián)。 這些相關(guān)聯(lián)的模式(或特征)不必彼此完全相同，只要一個可以從另一個被預(yù)測出來即可。 一旦建立了相關(guān)性，它能夠被記錄在例如一種書面記錄中或能夠另外地被附加到一種介質(zhì)或記憶源中(例如，計算機可讀的介質(zhì)或計算機存儲體或存儲盤)。然后，相關(guān)的糖基化模式(或其特征)的檢測可以包含參考書面的或附加的記錄、或參考證實該相關(guān)性的比較實驗、等。這種比較實驗可以與糖基化模式(或其特征)的評估同時完成，或可以是一種歷史的或?qū)淼膶嶒?。二乙?；缭诖怂褂玫模g(shù)語“二乙?；笔侵冈谕ǔＮ窗l(fā)現(xiàn)乙?；姆肿由蟽蓚€位置處的乙?；?。當(dāng)用于唾液酸分子的修飾時，“二乙?；笔侵赋嗽谖恢?處的乙酰化之外(這是典型地唾液酸中的乙?；?，在兩個位置處的乙酰化。在一些實施方案中， 唾液酸分子的“二乙酰化”包括位置7、8、和9中的兩個位置的乙?；?。(參見圖2。)聚糖如本領(lǐng)域中已知的并且在此所使用的，“聚糖”是糖類。聚糖可以是糖殘基的單體或聚合物，但典型地包含至少三個糖，并且可以是直鏈的或分支的。聚糖可以包括天然的糖殘基(例如，葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰神經(jīng)氨酸、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、己糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、等)和/或修飾的糖(例如，2’ -氟代核糖、2’ -脫氧核糖、磷酸甘露糖、6’磺酸基N-乙酰葡糖胺、等)。術(shù)語“聚糖”包括糖殘基的均聚物和雜聚物。術(shù)語 “聚糖”還包括結(jié)合糖的聚糖組分(例如，一種糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖、等)。該術(shù)語還包括游離的聚糖，包括從結(jié)合糖中切割的或另外地由其釋放的聚糖。聚糖制品如在此所使用的，術(shù)語“聚糖制品”是指根據(jù)一個特定的產(chǎn)生方法而獲得的一組聚糖。在一些實施方案中，“聚糖制品”是指從一種糖蛋白制品(參見以下糖蛋白制品的定義)中獲得的一組聚糖。在某些實施方案中，聚糖制品包括對唾液酸酶具有耐受性的聚糖。結(jié)合糖如在此所使用的，術(shù)語“結(jié)合糖，，包括其中至少一個糖部分被共價地連接到至少一個其他部分上的所有分子。該術(shù)語具體地包括具有共價附連的糖部分的所有生物分子，包括例如N-連接的糖蛋白、0-連接的糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖、等。糖形術(shù)語“糖形”被用在此處是指結(jié)合糖的一種特定的形式。即，當(dāng)相同的主鏈部分(例如多肽、脂類、等)，(該相同的主鏈部分是結(jié)合糖的一部分)具有被連接到不同的聚糖或聚糖的不同組上的可能性時，則結(jié)合糖(即，其中主鏈被連接到一個特定組的聚糖上) 的每一種不同形式被稱為一種“糖形”。糖脂如在此所使用的，術(shù)語“糖脂”是指包含一個或多個共價連接的糖部分(即， 聚糖)的一種類脂。該一個或多個糖部分可以是處于單糖、二糖、低聚糖、和/或多糖的形式。該一個或多個糖部分可以包括糖殘基的一個單一的無支鏈的鏈或者可以包括一個或多個分支的鏈。在某些實施方案中，這些糖部分可以包括硫酸基團和/或磷酸基團。在某些實施方案中，這些糖蛋白包含0-連接的糖部分；在某些實施方案中，這些糖蛋白包含N-連接的糖部分。糖蛋白如在此所使用的，術(shù)語“糖蛋白”是指一種蛋白，該蛋白包含共價連接至一個或多個糖部分(即，聚糖)上的一個肽主鏈。如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解的，這種肽主鏈典型地包括氨基酸殘基的一個直鏈。在某些實施方案中，這種肽主鏈跨越了細胞膜，這樣使得它包括一個跨膜部分以及一個細胞外部分。在某些實施方案中，跨越了細胞膜的糖蛋白的肽主鏈包括一個細胞內(nèi)部分，一個跨膜部分、以及一個細胞外部分。在某些實施方案中，本披露的方法包括用一種蛋白酶來切割一種細胞表面糖蛋白以釋放該糖蛋白的細胞外部分，或其一部分，其中這種暴露基本上不使細胞膜破裂。該一個或多個糖部分可以是處于單糖、二糖、低聚糖、和/或多糖的形式。該一個或多個糖部分可以包括糖殘基的一個單一的無支鏈的鏈或者可以包括一個或多個分支的鏈。在某些實施方案中，這些糖部分可以包括硫酸基團和/或磷酸基團?？商娲鼗蛄硗獾兀遣糠挚梢园ㄒ阴；?、羥乙?；⒈蚱渌榛男揎??？商娲鼗蛄硗獾?，糖部分可以通過二乙?；瘉硇揎?。在某些實施方案中，這些糖蛋白包含0-連接的糖部分；在某些實施方案中，這些糖蛋白包含N-連接的糖部分。在某些實施方案中，在此所披露的方法包括對以下各項中任何一項或全部進行分析的一個步驟細胞表面糖蛋白、釋放的細胞表面糖蛋白的片段(例如，糖肽)、附連到細胞表面糖蛋白上的細胞表面聚糖、細胞表面糖蛋白的肽主鏈，此類糖蛋白、聚糖和/或肽主鏈的片段，以及它們的組合。糖蛋白制品如在此所使用的術(shù)語，“糖蛋白制品”是指一組單獨的糖蛋白分子，該組中的每一個包括具有一個特定氨基酸序列(這種氨基酸序列包括至少一個糖基化位點) 的多肽以及被共價地附連到該至少一個糖基化位點上的至少一種聚糖。在糖蛋白制品中的一種特定的糖蛋白的單獨的分子典型地具有相同的氨基酸序列，但是可以在該至少一個糖基化位點的占用率方面和/或在被連接到該至少一個糖基化位點上的聚糖的身份方面有所不同。即，一種糖蛋白制品可以僅包括一種特定的糖蛋白的一種單一的糖形，但是更典型地包括多種糖形。相同的糖蛋白的不同制品可以在存在的糖形的身份方面(例如，在一種制品中存在的糖形可能是另一種制品中不存在的)和/或在不同糖形的相對量的方面有所不同。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于分析相同糖蛋白的不同制品(即，具有相同的氨基酸序列)的方法以及試劑。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于分析兩個(或更多個)糖蛋白的方法以及試劑，這些糖蛋白的氨基酸序列顯示至少85^^90^^91^^92%, 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的一致性，或者更高的一致性。糖苷酶如在此所使用的術(shù)語“糖苷酶”是指一種試劑，該試劑切割位于聚糖中順序的糖之間或糖與主鏈部分之間(例如，在糖蛋白的糖與肽主鏈之間)的一個共價鍵。在一些實施方案中，糖苷酶是一種酶。在某些實施方案中，糖苷酶是包括一個或多個多肽鏈的一種蛋白(例如，一種蛋白質(zhì)酶)。在某些實施方案中，糖苷酶是一種化學(xué)切割試劑。糖基化模式如在此所使用的，術(shù)語“糖基化模式”是指在一個特定的樣品上存在的一組聚糖結(jié)構(gòu)。例如，一個特定的結(jié)合糖(例如，糖蛋白)或一組結(jié)合糖(例如，一組糖蛋白)將具有一種糖基化模式。在一些實施方案中，提及細胞表面聚糖的糖基化模式，或者一種“表面糖基化模式”。如在此所使用的，“表面糖基化模式”可以指存在于感興趣的一個單一的細胞表面糖蛋白和/或糖脂的細胞外結(jié)構(gòu)域上的聚糖的模式(或“糖基化模式”)。 另外地或者可替代地，“表面糖基化模式”可以指存在于多種細胞表面糖蛋白和/或糖脂的細胞外結(jié)構(gòu)域上的聚糖的模式(或“糖基化模式”)。在某些實施方案中，“表面糖基化模式” 描述了存在于細胞表面糖蛋白和/或糖脂的整個補體上的聚糖的模式(或“糖基化模式”)?；谏舷挛模绢I(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易地理解“表面糖基化模式”是否是指多種細胞表面糖蛋白和/或糖脂的糖基化模式。糖基化模式可以被表征為，例如聚糖的身份、單獨的聚糖或特定類型的聚糖的量(絕對的或相對的)、糖基化位點的占用程度、聚糖的修飾(例如唾液酸化、多乙酰化唾液酸化、磷酸化、硫酸化、等)、等，或者這些參數(shù)的組合。多乙?；缭诖怂褂玫模g(shù)語“多乙酰化”是指在通常未發(fā)現(xiàn)乙?；姆肿由系膬蓚€或更多個位置處的乙酰化，。當(dāng)用于唾液酸分子的修飾時，“多乙酰化”是指除了在位置5處的乙?；?這是典型地唾液酸中的乙?；?，在兩個或更多個位置處的乙?；?。 在一些實施方案中，唾液酸分子的多乙?；ㄎ恢?、8、和9中兩個或更多個位置的乙?；?。(參見圖2。)N-聚糖如在此所使用的，術(shù)語“N-聚糖”是指糖的一種聚合物，該聚合物從一種結(jié)合糖中釋放出來，但是之前通過一個氮連接(參見以下N-連接的聚糖的定義)被連接到該結(jié)合糖上。N-連接的聚糖如在此所使用的，術(shù)語“N-連接的聚糖”是指通過一個氮連接被連接到一個結(jié)合糖上的聚糖。存在著不同種類的N-連接的聚糖，但是它們典型地基于共同的核心戊糖(Man)3(GlcNAc) (GlcNAc)。0-聚糖如在此所使用的，術(shù)語“0-聚糖”是指糖的一種聚合物，該聚合物從一種結(jié)合糖中釋放出來，但是之前通過一個氧連接(參見以下0-連接的聚糖的定義)被連接到該結(jié)合糖上。0-連接的聚糖如在此所使用的，術(shù)語“0-連接的聚糖”是指通過一個氧連接被連接到一個結(jié)合糖上的聚糖。0-連接的聚糖典型地通過N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)而被附連至糖蛋白上或者通過N-乙?；?D-葡糖胺(GlcNAc)而被附連至L-絲氨酸(kr) 或L-蘇氨酸(Thr)的羥基基團上。一些0-連接的聚糖還具有多種修飾作用，如乙?；饔煤土蛩峄饔谩Ｔ谝恍├又?，0-連接的聚糖通過巖藻糖被附連到糖蛋白上，或通過甘露糖被附連到L-絲氨酸(kr)或L-蘇氨酸(Thr)的羥基基團上。磷酸基如在此所使用的，術(shù)語“磷酸基”被用于此處是指一個PO4-基團(在自由溶液中)，或一個PO3基團(作為化合物的一部分)。作為化學(xué)名稱的一部分，術(shù)語“磷酸基” 是指通過加入一個磷酸基團進行的化學(xué)修飾。磷酸化如在此所使用的，術(shù)語“磷酸化”是指通過共價加入一個磷酸基團而進行的修飾。例如，磷酸化的聚糖是通過共價加入一個或多個磷酸化的基團而修飾的聚糖。磷酸化的聚糖可以或不可以具有另外的修飾。磷酸化作用如在此所使用的，術(shù)語“磷酸化作用”是指將一個或多個磷酸基團共價地加至一個分子(例如，一種聚糖)上的過程。蛋白酶如在此所使用的，術(shù)語“蛋白酶”是指一種試劑，該試劑切割位于多肽鏈中的順序的氨基酸之間的一個肽鍵。在一些實施方案中，蛋白酶是一種酶(即，一種蛋白水解酶)。在某些實施方案中，蛋白酶是包括一個或多個多肽鏈的一種蛋白(例如，一種蛋白質(zhì)酶)。在某些實施方案中，蛋白酶是一種化學(xué)切割試劑。蛋白質(zhì)總體而言，“蛋白”是一種多肽(即，通過肽鍵彼此連接的至少兩個氨基酸的鏈)。蛋白可以包括除了氨基酸之外的部分(例如，可以是糖蛋白)和/或可以被另外地加工或修飾。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是“蛋白”可以是如細胞所生產(chǎn)的一種完整的多肽鏈(具有或不具有信號序列)，或者可以是它的一個功能性部分。普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)進一步地理解的是有時蛋白可以包括多于一種的多肽鏈，例如通過一個或多個二硫鍵相連接或者通過其他方式相結(jié)合。唾液酸如在此所使用的，術(shù)語“唾液酸”是用于神經(jīng)氨酸(一種九碳單糖)的 N-或0-取代的衍生物的一個通稱。神經(jīng)氨酸的氨基基團典型地在唾液酸中帶有乙?；嗷蛄u乙酰基基團。存在于唾液酸上的羥基取代基可以通過乙?；饔?、甲基化作用、硫酸化作用、以及磷酸化作用進行修飾。主要的唾液酸是N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)。唾液酸將一個負電荷傳遞到聚糖上，因為羧基基團在生理PH下傾向于解離出一個質(zhì)子。示例性的去質(zhì)子的唾液酸顯示如下
權(quán)利要求
1.一種方法，包括以下步驟a)提供一種聚糖制品，從該聚糖制品中已經(jīng)釋放了唾液酸類；b)使該聚糖制品經(jīng)受一種分離技術(shù)，該分離技術(shù)基于荷質(zhì)比來分離聚糖類；并且c)使用至少一種定量標(biāo)準(zhǔn)物來對至少一種分離出的聚糖進行定量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該提供步驟包括將一種包括聚糖類的組合物暴露于至少一種試劑，該試劑在允許切割唾液酸殘基的條件下切割多種唾液酸殘基。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該聚糖制品包括選自下組的非常規(guī)修飾的聚糖類， 該組由以下各項組成硫酸化的聚糖類、磷酸化的聚糖類、多乙酰化唾液酸化的聚糖類、以及它們的組合。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中這些非常規(guī)修飾的聚糖構(gòu)成該聚糖制品中存在的聚糖類的少于約50%。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中這些非常規(guī)修飾的聚糖構(gòu)成該聚糖制品中存在的聚糖類的少于約10%。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中這些非常規(guī)修飾的聚糖構(gòu)成該聚糖制品中存在的聚糖類的少于約5%。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中這些非常規(guī)修飾的聚糖構(gòu)成該聚糖制品中存在的聚糖類的少于約1%。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其中這些非常規(guī)修飾的聚糖構(gòu)成該聚糖制品中存在的聚糖類的少于約0.1%。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其中這些非常規(guī)修飾的聚糖構(gòu)成該聚糖制品中存在的聚糖類的少于約0. 05%。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括分析分離出的聚糖類的結(jié)構(gòu)特征。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括分析分離出的聚糖類的單糖構(gòu)成。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中該分析結(jié)構(gòu)特征的步驟包括執(zhí)行選自下組的一種技術(shù)，該組由以下各項組成核磁共振(NMR)、質(zhì)譜法、液相色譜法、二維色譜法、毛細管電泳法(CE)、以及它們的組合。
13.如權(quán)利要求1、10或11所述的方法，進一步包括將分離出的聚糖類與以前鑒別的分離的聚糖類進行比較。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中這些以前鑒別的分離的聚糖的特征被儲存在一個數(shù)據(jù)庫中。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，進一步包括將分離出的聚糖類與以前鑒別的分離的聚糖類進行比較。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中這些以前鑒別的分離的聚糖的特征被儲存在一個數(shù)據(jù)庫中。
17.如權(quán)利要求12所述的方法，進一步包括對分離出的聚糖類的結(jié)構(gòu)特征進行一個或多個另外輪次的分析。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該經(jīng)受步驟包括在一個帶電荷的柱上對該聚糖制品進行分離。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中該帶電荷的柱是一個陰離子交換柱。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括一個在該聚糖制品中標(biāo)記聚糖類的步驟。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中用與這些聚糖相同的標(biāo)記物來標(biāo)記該定量標(biāo)準(zhǔn)物。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該提供步驟包括提供從結(jié)合糖類中釋放出的一種聚糖類制品。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中這些結(jié)合糖包括糖蛋白類。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中這些聚糖是使用一種糖苷酶多肽來從結(jié)合糖類中釋放的。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中這些聚糖是通過胼解來從結(jié)合糖類中釋放的。
26.如權(quán)利要求22所述的方法，其中這些結(jié)合糖是從治療性配制品類、商品化的生物制品類、生物反應(yīng)器類、以及生物樣品類中得到的。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中這些結(jié)合糖是從選自下組的來源得到的，該組由以下各項組成組織培養(yǎng)物類、人或動物的組織類、植物類、果實類、蔬菜類、以及它們的組
28.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中這些結(jié)合糖是從體液類中獲得的。
29.如權(quán)利要求觀所述的方法，其中這些結(jié)合糖是從選自下組的體液中獲得的，該組由以下各項組成血清、血漿、血液、唾液、精液、尿液、腦脊髓液、以及它們的組合。
30.如權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括鑒別這些分離出的聚糖。
31.如權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括進行一種或多種技術(shù)，該一種或多種技術(shù)允許基于大小、疏水性、電荷、或它們的一種組合來分離多種分子。
全文摘要
除其他事項之外，本披露提供了用于富集、鑒別、和/或定量非常規(guī)修飾的聚糖類(例如磷酸化的聚糖類、硫酸化的聚糖類、和/或多乙?；木厶穷?的方法。在很多實施方案中，這些方法包括提供一種聚糖制品，從該聚糖制品中已經(jīng)釋放了唾液酸；使該唾液酸酶處理過的聚糖制品經(jīng)受一種基于荷質(zhì)比來分離聚糖的分離技術(shù)；并且使用至少一種定量標(biāo)準(zhǔn)物對這些帶電荷的產(chǎn)物進行定量。
文檔編號A61K38/14GK102239173SQ200980147771
公開日2011年11月9日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者C·J·鮑斯克斯, C·劉, J·L·墨菲, S·N·岡奈, Z·施萊佛 申請人:動量制藥公司