專利名稱：一種核酸適配體及其衍生物、核酸適配體的篩選方法及在檢測人膽管癌細胞株中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種核酸適配體及其篩選和應用，尤其涉及一種可用于檢測人膽管癌細胞的核酸適配體及其篩選方法和應用。
背景技術：
核酸適配體(aptamer)是通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進化技術(SELEX)篩選得到的，能特異結合祀物質的單鏈寡聚核苷酸(ssDNA或ssRNA)。核酸適配體與抗體功能類似，但是與抗體相比具有更多的優(yōu)勢，具有更高的親和力與特異性；無免疫原性；能夠化學合成，成本低；可進行標記；穩(wěn)定性好，易于保存等優(yōu)點。核酸適配體的靶分子更為廣泛，包括金屬離子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白質，并從單一靶標擴展至完整的病毒顆粒及細胞等復合物靶標。因此，核酸適配體具有廣泛的應用前景。人膽管癌細胞株QBC-939屬于肝門部膽管癌(HCCA)，肝門部膽管癌是膽道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。肝門部膽管癌因其發(fā)生部位特殊、呈浸潤性生長及與肝門部血管關系密切等特點給手術切除造成極大的困難。長期以來，肝門部膽管癌被認為是無法用手術根治性切除的癌腫。近20年來，隨著影像學和手術技術的進步，使肝門部膽管癌的診斷和治療取得重大進展，但肝門部膽管癌有關的發(fā)病原因或危險因素尚不清楚，因此篩選出它的aptamer對于臨床檢測、腫瘤標志物的尋找、腫瘤發(fā)病機理的發(fā)現(xiàn)都有很重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性、無免疫原性、能夠化學合成、分子量小、穩(wěn)定、易于保存和標記的可用于檢測人膽管癌細胞株QBC-939的核酸適配體及其衍生物，還相應提供前述核酸適配體的篩選方法和應用。 為解決上述技術問題，本發(fā)明提出的技術方案為一種核酸適配體，所述核酸適配體的核苷酸序列包含以下序列1、序列2中任意一條序列所示的DNA片段:
序列1:
5，-AGAAGGATGGAGAGGAGCACACAATTGGGCGGGGTGTTGACGGGGGAGTTTAAAGAAGTGGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’ ；
序列2:
5，-AGAAGGATGGAGAGGAGCACCTAAGCGGGGTTCGAAGTATTCTTATCTTTGCCTGGATTGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’。上述的核酸適配體中，所述核酸適配體的核苷酸序列上的某一位置可被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。上述的核酸適配體中，所述核酸適配體的核苷酸序列上可結合有生物素、地高辛、熒光物質(如FITC)、納米發(fā)光材料或酶標記(甚至連接上放射性和治療性物質等)。
以上不論是經(jīng)部分取代或者經(jīng)過修飾后的核苷酸序列，都具有原核酸適配體基本相同或類似的分子結構、理化性質和功能，都可用于檢測人膽管癌細胞株QBC-939。作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供一種核酸適配體，所述核酸適配體的核苷酸序列包括以下三種序列中的任意一種:
(1)與上述所列核酸適配體的核苷酸序列的同源性在60%以上(例如可將上述核酸適配體序列刪除或增加部分互補的核苷酸);
(2)與上述所列核酸適配體的核苷酸序列進行雜交的序列；
(3)上述所列核酸適配體的核苷酸序列轉錄的RNA序列。作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供一種核酸適配體衍生物，所述衍生物是上述所列核酸適配體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是上述所列核酸適配體改造成的相應肽核酸。以上不論是衍生出的核酸適配體還是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸適配體基本相同或類似的分子結構性質和功能，即都可用于檢測人膽管癌細胞株QBC-939。作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供一種上述核酸適配體的篩選方法，包括以下步驟:
(1)合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物:
隨機文庫 RS40:5’ -AGAAGGATGGAGAGGAGCAC(40N)GTCCTCGTCTCCTTCCTACT ；
5，引物:5，-FAM-AGAAGGATGGAGAGGAGCAC-3’ ；3，引物:5，-Biotin-GTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3，；
(2)Cel1-SELEX篩選:培養(yǎng)人膽管癌細胞株QBC-939細胞至基本鋪滿瓶底，去除培養(yǎng)基后用緩沖液洗滌，然后與上述隨機序列在冰上孵育后，棄溶液；再將上述隨機文庫溶解、恒溫振蕩后與經(jīng)前述處理后的QBC-939細胞在冰上孵育；孵育完成后棄掉孵育瓶內的液體，并用緩沖液沖洗孵育瓶，然后用無菌水刮取孵育瓶內的QBC-939細胞并置于沸水浴中加熱，加熱完成后再離心取上清，即為篩選所得的QBC-939特異核酸適配體文庫；
(3)PCR擴增文庫:將步驟(2)中篩選所得的QBC-939特異核酸適配體文庫進行常規(guī)PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物； (4)制備DNA單鏈文庫:將鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微球離心去上清，再將步驟(3)中PCR擴增所得的雙鏈DNA與瓊脂糖微球在常溫下孵育，通過雙鏈DNA上的生物素與瓊脂糖微球上的鏈霉親和素的親和作用將雙鏈DNA充分捕獲到瓊脂糖微球表面，洗滌后加入堿液至瓊脂糖微球中，常溫下反應、離心、收集上清；將上清液過除鹽柱后收集滴下的溶液，此即為DNA單鏈文庫；
(5)重復篩選:將步驟(4)得到的DNA單鏈文庫替代步驟(2)中的隨機文庫，并重復上述步驟(2) (4)的過程至少一次；
(6)陰性篩選:以人肝癌細胞SMMC-7721為對照，將步驟(5)后篩選得到的DNA單鏈文庫進行陰性篩選，陰性篩選的具體操作為:培養(yǎng)人肝癌細胞SMMC-7721至基本鋪滿瓶底，去除培基后用緩沖液洗滌，然后與無關序列在冰上孵育后，棄溶液；再將步驟(5)后篩選得到的DNA單鏈文庫溶解、恒溫振蕩后與經(jīng)前述處理后的人肝癌細胞SMMC-7721在冰上孵育，孵育完成后收集細胞孵育后的溶液；
(7)多輪篩選:將步驟(6)所收集的溶液替代步驟(5)中的DNA單鏈文庫，繼續(xù)重復上述步驟(5) 步驟(6)的操作過程至少一次；重復篩選過程中用流式細胞術監(jiān)測DNA單鏈文庫對QBC-939細胞識別能力的增強情況，直至DNA單鏈文庫對QBC-939細胞的識別能力滿足要求后，將所得產(chǎn)物經(jīng)克隆測序分析，最終得到核酸適配體。上述的篩選方法中，所述PCR擴增時的工藝條件優(yōu)選為:94°C 3min，94°C 30sec,58.5V 30sec,72°C 30sec，經(jīng)13輪循環(huán)輪數(shù)(可在PCR擴增前進行循環(huán)輪數(shù)的優(yōu)化，選取能夠滿足條帶亮度及特異性好的循環(huán)輪數(shù)作為PCR反應循環(huán)數(shù))，720C 3min。上述的篩選方法，所述步驟(2)中，與隨機序列在冰上孵育的時間優(yōu)選控制在15min ;與所述QBC-939細胞在冰上孵育的時間優(yōu)選控制在30min，所述沸水浴中的加熱時間優(yōu)選控制在lOmin。上述的篩選方法，所述步驟(4)中，與瓊脂糖微球在常溫下孵育的時間優(yōu)選控制在
0.5h,加入堿液后的反應時間優(yōu)選控制在15min。作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供一種上述的核酸適配體或者上述的核酸適配體衍生物在識別人膽管癌細胞株QBC-939或者制備檢測人膽管癌細胞株QBC-939的試劑盒中的應用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:本發(fā)明通過SELEX篩選得到的核酸適配體具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性；無免疫原性；能夠體外化學合成，分子量小，可以對不同部位進行修飾和取代，且序列穩(wěn)定，易于保存；便于標記(不需要標記的二抗)等。采用本發(fā)明的核酸適配體進行膽管癌細胞的檢測時，操作更為簡單、迅速，由于核酸適配體的合成成本較抗體制備成本低，且周期短，重現(xiàn)性好。本發(fā)明的可識別人膽管癌細胞株QBC-939的核酸適配體均能特異性且高親和力的識別人膽管癌細胞株QBC-939，且結合能力強，解離常數(shù)均在納摩爾范圍 以內。利用本發(fā)明的核酸適配體對其結合的靶分子進行研究，可以得到其腫瘤標志物，這對于肝癌的早期檢測具有重要意義，在肝癌的診斷方面有良好的應用前景。


圖1為本發(fā)明實施例中利用Valfold軟件模擬的FAM_yll9核酸適配體的二級結構示意圖。圖2為本發(fā)明實施例中利用Valfold軟件模擬的FAM_yl23核酸適配體的二級結構示意圖。圖3為本發(fā)明實施例中流式細胞儀檢測兩條核酸適配體對人膽管癌細胞株QBC-939的結合能力的檢測結果。圖4為本發(fā)明實施例中流式細胞儀檢測兩條核酸適配體對人肝癌細胞株SMMC-7721的結合能力的檢測結果。圖5為本發(fā)明實施例中激光共聚焦檢測兩條核酸適配體對人膽管癌細胞株QBC-939的結合能力及特異性的檢測結果(圖中的兩組圖片，一個是熒光通道的成像，一個是熒光通道和明場的疊加成像，是同一個照片不同通道的信息)。圖6為本發(fā)明實施例中流式細胞儀測定FAM_yll9核酸適配體結合QBC-939的解離常數(shù)繪制曲線。圖7為本發(fā)明實施例中流式細胞儀測定FAM_yl23核酸適配體結合QBC-939的解離常數(shù)繪制曲線。
具體實施例方式以下結合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護范圍。實施例:
一種可用于檢測人肝門部膽管癌細胞株QBC-939的核酸適配體，該核酸適配體的核苷酸序列包括以下序列I 序列2中的任意一條序列所示的DNA片段(5’端標記有FAM):序列 lFAM_yll9:
5，-AGAAGGATGGAGAGGAGCACACAATTGGGCGGGGTGTTGACGGGGGAGTTTAAAGAAGTGGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’ ；
序列 2FAM-yl23:
5，-AGAAGGATGGAGAGGAGCACCTAAGCGGGGTTCGAAGTATTCTTATCTTTGCCTGGATTGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’。序列3FAM-RS80:
5，-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3，
注:N代表A、T、G、C中任一堿基(序列3作為對照序列，即陰性探針，也即圖3、圖4中的 Random)。上述的各核酸適配體的核苷酸序列上的某一位置可被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。上述各核酸適配體的核苷酸序列上可結合生物素、地高辛、熒光物質、納米發(fā)光材料或酶標。上述核酸適配體的核苷酸序列的骨架還可衍生出可用于檢測人肝門部膽管癌細胞株QBC-939的硫代磷酸酯骨架，上述核酸適配體還可改造成的相應肽核酸，還可衍生出的其他的核酸適配體，衍生出的核酸適配體的核苷酸序列可以為以下三種序列中的任意一種:
Cl)與本實施例所列核酸適配體的核苷酸序列的同源性在60%以上(例如可將上述核酸適配體序列刪除或增加部分互補的核苷酸)；
(2)與本實施例所列核酸適配體的核苷酸序列進行雜交的序列；
(3)上述所列核酸適配體的核苷酸序列轉錄的RNA序列。本實施例的上述兩條可用于檢測人膽管癌細胞株QBC-939的核酸適配體主要采用以下篩選方法篩選得到，具體包括以下步驟:
1.合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物。隨機文庫 RS40: 5，-AGAAGGATGGAGAGGAGCAC (40N) GTCCTCGTCTCCTTCCTACT ；
5，引物:5，-FAM-AGAAGGATGGAGAGGAGCAC-3’
3，引物:5’ -Biotin-GTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3，。2.Cell-SELEX篩選獲得QBC-939特異核酸適體文庫。2.1細胞預處理:1640培養(yǎng)基加15%小牛血清培養(yǎng)人膽管癌細胞株QBC-939細胞至鋪滿瓶底95%，去除培養(yǎng)基后用IOmL washing buffer洗滌，與ImL含InM隨機序列的binding buffer在冰上孵育15min,棄溶液；
2.2孵育:用30(^1^ binding buffer溶解IOnmol上述的隨機文庫,95°C恒溫振蕩5min,迅速放入冰中；在隨機文庫中補充binding buffer至終體積為ImL,與步驟2.1中已經(jīng)處理好的QBC-939細胞在冰上孵育30min。2.3解離:孵育完成后倒出孵育培養(yǎng)瓶內的液體，用IOmL washing buffer洗滌孵育培養(yǎng)瓶中的細胞；用ImL無菌水刮取孵育培養(yǎng)瓶內細胞，置于EP管中沸水浴加熱lOmin，12000 rmp離心取上清，即為篩選所得QBC-939的特異核酸適配體文庫。3.進行PCR擴增文庫:取100 μ L篩選所得的QBC-939特異核酸適配體文庫進行常規(guī) PCR 擴增，擴增條件為:94°C 3min,94°C 30sec,58.5°C 30sec,72°C 30sec，經(jīng)合適循環(huán)輪數(shù)，72°C 3min ;第一輪篩選后需將全部所得的QBC-939特異核酸適體文庫預擴增10個循環(huán)，再進行本步驟的擴增，得到擴增產(chǎn)物。4.制備DNA單鏈文庫:將100 μ L鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微球5000rmp離心去上清，再用500 μ L PBS洗滌，離心去上清；重復洗滌一次。將步驟3中PCR擴增所得的雙鏈DNA與瓊脂糖微球在常溫下孵育半小時，通過雙鏈DNA上的生物素與瓊脂糖微球上的鏈霉親和素的親和作用將雙鏈DNA充分捕獲到瓊脂糖微球表面；5000rmp離心去上清，用PBS離心洗滌兩次；然后加入200mM NaOH溶液500 μ L至瓊脂糖微球中用于雙鏈DNA的變性處理，常溫反應15min, 5000rmp離心5min,收集上清；除鹽柱用IOmL無菌水洗漆后,加入堿變性后收集得到的上清液，自然滴完。加入ImL無菌水，收集滴下的溶液，此即為DNA單鏈文庫。5.重復篩選:將步驟4得到的DNA單鏈文庫替代步驟2.2中的隨機文庫，重復上述步驟2 4所示的陽性篩選(即步驟2)、PCR擴增及制取單鏈DNA文庫過程。6.陰性篩選:在 第三輪篩選及以后，以人肝癌細胞SMMC-7721為對照，將步驟5后篩選得到的DNA單鏈文庫進行陰性篩選，陰性篩選的具體操作為:培養(yǎng)人肝癌細胞SMMC-7721至鋪滿瓶底95%，去除培基后用緩沖液洗滌，然后與無關序列在冰上孵育后，棄溶液；再將步驟5篩選得到的DNA單鏈文庫溶解、恒溫振蕩后與經(jīng)前述處理后的人肝癌細胞SMMC-7721在冰上孵育，孵育完成后收集細胞孵育后的溶液。7.多輪篩選:將步驟6所收集的溶液替代步驟5中的DNA單鏈文庫，繼續(xù)重復進行上述步驟5 6的操作過程，在第一輪篩選以后，用于細胞孵育篩選的文庫量約為200pmol，從第三輪篩選開始，陽性篩選細胞預處理的孵育溶液中需加入胎牛血清，隨著篩選輪數(shù)的增加，添加量從5%增加至20% ;重復篩選過程中用流式細胞術監(jiān)測所得DNA單鏈文庫對QBC-939細胞識別能力的增強情況，直至13輪篩選后DNA單鏈文庫對QBC-939細胞的識別能力滿足要求，將所得產(chǎn)物(產(chǎn)物中含有23條序列)經(jīng)克隆測序分析，對測序結果整理分析后，最終可得到富集度高的兩條序列，這兩條序列即為上述本實施例的可用于檢測人膽管癌細胞株QBC-939的核酸適配體?？疾?:用Valfold軟件對該本實施例兩條序列進行二級結構模擬。用Valfold軟件對本實施例的兩條序列進行二級結構模擬后的結構示意圖如圖1 圖2所示。考察2:流式細胞儀檢測本實施例兩條核酸適配體與QBC-939細胞的結合效果及其特異性。將處于對數(shù)期生長的QBC-939細胞用無酶消化液消化后打散，2000rpm離心去上清，用5mL PBS離心洗滌兩次。細胞與含250nM DNA序列(包括序列l(wèi)FAM_yll9、序列2FAM-yl23和序列3FAM-RS80陰性探針Random)的binding buffer冰上孵育半小時，2000rmp 去上清，用 ImL binding buffer 洗漆兩次,最后加入 400 μ L binding buffer,用于流式細胞儀檢測，以人肝癌細胞株SMMC-7721作為對照，檢測結果如圖3、圖4所示。由圖
3、圖4流式細胞術的檢測結果證明，本實施例的yll9、yl23兩條核酸適體均對靶細胞人膽管癌細胞QBC-939具有較強的特異性識別能力，而對對照細胞人肝癌細胞株SMMC-7721無識別，與陰性探針(即上述的序列3:FAM-RS80)也無識別。考察3:激光共聚焦檢測本實施例兩條核酸適配體與QBC-939細胞的結合效果及其特異性。在激光共聚焦小皿中分別培養(yǎng)人膽管癌細胞QBC-939和人肝癌細胞株SMMC-7721，倒出培養(yǎng)基，用PBS將細胞洗滌三次。細胞與含250nM上述本實施例兩條核酸適體的binding buffer冰上孵育半小時，倒出反應液,用binding buffer洗漆兩次，最后加入200yL binding buffer用于檢測,檢測結果如圖5所示。檢測結果表明:本實施例的兩條核酸適體均能識別原位生長狀態(tài)下的靶細胞QBC-939，而不能識別對照細胞SMMC-7721ο考察4:流式細胞儀測定本實施例兩條核酸適配體對QBC-939細胞的解離常數(shù)。特異性檢測的操作與考察2的操作基本一致，平行配制不同濃度的含本實施例核酸適配體的反應液與QBC-939細胞孵育，以流式細胞儀的熒光幾何平均值為縱坐標，以核酸適配體的濃度為橫坐標，由Y=Bmax*X/(Kd+X)方程模擬曲線，得到本實施例兩條核酸適配體的解離常數(shù)繪制曲線如圖6 圖 7，由此可得到解離常數(shù)Kd如下表I所示。圖6 圖7及表I的檢測結果表明:yll9、yl23與靶細胞QBC-939細胞的結合能力很強，解離常數(shù)均在納摩爾級別。表1:解離常數(shù)結果 ^_
權利要求
1.一種核酸適配體，所述核酸適配體的核苷酸序列包含以下序列1、序列2中任意一條序列所示的DNA片段: 序列1:5，-AGAAGGATGGAGAGGAGCACACAATTGGGCGGGGTGTTGACGGGGGAGTTTAAAGAAGTGGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’ ； 序列2:5，-AGAAGGATGGAGAGGAGCACCTAAGCGGGGTTCGAAGTATTCTTATCTTTGCCTGGATTGTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3’。
2.根據(jù)權利要求1所述的核酸適配體，其特征在于:所述核酸適配體的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。
3.根據(jù)權利要求 1或2所述的核酸適配體，其特征在于:所述核酸適配體的核苷酸序列上結合有生物素、地高辛、熒光物質、納米發(fā)光材料或酶標記。
4.一種核酸適配體，其特征在于:所述核酸適配體的核苷酸序列包括以下三種序列中的任意一種: (O與權利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列的同源性在60%以上； (2)與權利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列進行雜交的序列； (3)權利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列轉錄的RNA序列。
5.一種核酸適配體衍生物，其特征在于:所述衍生物是權利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是權利要求1或2或3中所述核酸適配體改造成的相應肽核酸。
6.一種如權利要求1所述的核酸適配體的篩選方法，包括以下步驟: (1)合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物:隨機文庫 RS40:5’ -AGAAGGATGGAGAGGAGCAC(40N)GTCCTCGTCTCCTTCCTACT ； .5，引物:5，-FAM-AGAAGGATGGAGAGGAGCAC-3’ ； .3，引物:5，-Biotin-GTCCTCGTCTCCTTCCTACT-3，； (2)Cel1-SELEX篩選:培養(yǎng)人膽管癌細胞株QBC-939細胞至基本鋪滿瓶底，去除培養(yǎng)基后用緩沖液洗滌，然后與上述隨機序列在冰上孵育后，棄溶液；再將上述隨機文庫溶解、恒溫振蕩后與經(jīng)前述處理后的QBC-939細胞在冰上孵育；孵育完成后棄掉孵育瓶內的液體，并用緩沖液沖洗孵育瓶，然后用無菌水刮取孵育瓶內的QBC-939細胞并置于沸水浴中加熱，加熱完成后再離心取上清，即為篩選所得的QBC-939特異核酸適配體文庫； (3)PCR擴增文庫:將步驟(2)中篩選所得的QBC-939特異核酸適配體文庫進行常規(guī)PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物； (4)制備DNA單鏈文庫:將鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微球離心去上清，再將步驟(3)中PCR擴增所得的雙鏈DNA與瓊脂糖微球在常溫下孵育，通過雙鏈DNA上的生物素與瓊脂糖微球上的鏈霉親和素的親和作用將雙鏈DNA充分捕獲到瓊脂糖微球表面，洗滌后加入堿液至瓊脂糖微球中，常溫下反應、離心、收集上清；將上清液過除鹽柱后收集滴下的溶液，此即為DNA單鏈文庫； (5)重復篩選:將步驟(4)得到的DNA單鏈文庫替代步驟(2)中的隨機文庫，并重復上述步驟(2) (4)的過程至少一次；(6)陰性篩選:培養(yǎng)人肝癌細胞SMMC-7721至基本鋪滿瓶底，去除培基后用緩沖液洗滌，然后與無關序列在冰上孵育后，棄溶液；再將步驟(5)后篩選得到的DNA單鏈文庫溶解、恒溫振蕩后與經(jīng)前述處理后的人肝癌細胞SMMC-7721在冰上孵育，孵育完成后收集細胞孵育后的溶液； (7)多輪篩選:將步驟(6)所收集的溶液替代步驟(5)中的DNA單鏈文庫，繼續(xù)重復上述步驟(5) 步驟(6)的操作過程至少一次；重復篩選過程中用流式細胞術監(jiān)測DNA單鏈文庫對QBC-939細胞識別能力的增強情況，直至DNA單鏈文庫對QBC-939細胞的識別能力滿足要求后，將所得產(chǎn)物經(jīng)克隆測序分析，最終得到核酸適配體。
7.根據(jù)權利要求6所述的篩選方法，其特征在于，所述PCR擴增時的工藝條件為:94°C3min,94°C 30sec,58.5°C 30sec,72°C 30sec，經(jīng) 13 輪循環(huán)輪數(shù)，72°C 3min。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的篩選方法，其特征在于:所述步驟(2)中，與隨機序列在冰上孵育的時間控制在15min，與所述QBC-939細胞在冰上孵育的時間控制在30min，所述沸水浴中的加熱時間控制在IOmin ;所述步驟(4)中，與瓊脂糖微球在常溫下孵育的時間控制在0.5h,加入堿液后的反應時間控制在15min。
9.一種如權利要求1 4中任一項所述的核酸適配體或者如權利要求5所述的核酸適配體衍生物在識別人膽管癌細胞株QBC-939或者制備檢測人膽管癌細胞株QBC-939的試劑盒中的應 用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種核酸適配體，其序列包含序列1、序列2中任意一條序列所示的DNA片段。本發(fā)明的核酸適配體還可以是各種同源性較高的類似序列或由本發(fā)明序列得到的衍生物。本發(fā)明還公開了該核酸適配體的篩選方法，先合成隨機單鏈DNA文庫和引物，再Cell-SELEX篩選，PCR擴增文庫，制備DNA單鏈文庫，最后經(jīng)重復篩選、陰性篩選和多輪篩選得到核酸適配體。本發(fā)明的核酸適配體及其衍生物可在識別人膽管癌細胞株QBC-939或者制備檢測人膽管癌細胞株QBC-939的試劑盒中應用，具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性、無免疫原性、能夠化學合成、分子量小、穩(wěn)定、易于保存和標記等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/04GK103205431SQ20131009911
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月26日 優(yōu)先權日2013年3月26日
發(fā)明者王柯敏, 羊小海, 葉玲, 郭秋平, 譚譽宇, 何曉曉 申請人:湖南大學