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一種基于單核苷酸多態(tài)性位點的孕婦血漿中胎兒dna含量的測定方法

文檔序號:423863閱讀:234來源:國知局
專利名稱:一種基于單核苷酸多態(tài)性位點的孕婦血漿中胎兒dna含量的測定方法
技術領域
本發(fā)明屬于生物技術領域,涉及一種基于單核苷酸多態(tài)性位點的孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法,還涉及該測定方法的應用,如產(chǎn)前檢測。
背景技術
當前,產(chǎn)前檢測越來越受到人們的關注,產(chǎn)前檢測是減少出生缺陷兒的有效措施之一。但是傳統(tǒng)的侵入性診斷技術對母親和胎兒都會造成一定的風險,因而在臨床上限制了其運用。近年來,無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷受到越來越多的關注,而孕婦血漿中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)無疑為無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷開辟了新的途徑。因此,圍繞孕婦血漿游離DNA的研究越來越多,也發(fā)展出了許多潛在的臨床應用。比如,母體血漿中胎兒DNA含量的異常與許多妊娠相關的疾病有關,包括先兆子癇、早產(chǎn)、產(chǎn)前出血、侵入性胎盤形成、胎兒唐氏綜合癥和其他胎兒染色體非整倍性。因此,母親血漿的胎兒DNA分析可以作為監(jiān)測胎兒健康的潛在標志物之一。然而,由于母親血漿中胎兒游離DNA的含量只占總數(shù)的5%_30%,是處于一種高母體DNA的背景下,使得我們在進行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的過程中常常會因為胎兒游離DNA的含量過低而呈現(xiàn)假陰性的結果。為了同母親來源的游離DNA區(qū)分,目前選取胎兒游離DNA標記物主要來自Y染色體遺傳位點,這使得胎兒游離DNA含量的檢測局限在懷男性胎兒的孕婦當中。因此,開發(fā)一種能夠廣泛應用的檢測孕婦血漿中胎兒DNA含量的新技術,是一項意義深遠的工作。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、準確度高、應用廣泛的孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法。技術方案:本發(fā)明提供的一種基于單核苷酸多態(tài)性位點的孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法,包括以下步驟:步驟一,單核苷酸多態(tài)性位點的篩選:從美國國立生物技術信息中心(NCBI)的單核苷酸多態(tài)性位點庫(dbSNP)中初步篩選出滿足以下條件的單核苷酸多態(tài)性位點:(I)小等位基因頻率(MAF)在0.4-0.5之間;(2)包含該多態(tài)性位點的DNA片段長度為50_70bp ;(3)位點上下游距離位點l_60bp之間不包含任何單核苷酸多態(tài)性位點;(4)包含該多態(tài)性位點的DNA片段不是位于基因組變異數(shù)據(jù)庫中拷貝數(shù)變異范圍之內(nèi);(5)該多態(tài)性位點所處的片段 在人類基因組范圍內(nèi)是特異的,保證該片段在人類基因組上是唯一的;
(6)包含該多態(tài)性位點的DNA片段之間是相互兼容的,即該多態(tài)性位點的DNA片段之間,沒有超過8bp的互補序列,同時各個多態(tài)性位點的DNA片段的GC含量應該在45-55%之間。步驟一中,單核苷酸多態(tài)性位點的篩選可利用軟件完成,包括以下步驟:(以下步驟根據(jù)附

圖1得到,然而,該步驟及附圖1并未顯示篩選出該多態(tài)性位點的DNA片段長度為50-70bp ;此外,附圖1上兩端50_60bp不包含SNP位點請根據(jù)之前修改的權I修改)(1)從美國國立生物技術信息中心(NCBI)的單核苷酸多態(tài)性位點庫(dbSNP)中依據(jù)小等位基因頻率數(shù)值過濾,提取出小等位基因頻率在0.4-0.5之間的單核苷酸多態(tài)性位點,提取出的片段長度為50-70bp ;(2)將步驟(I)得到的單核苷酸多態(tài)性位點與人類基因組比較,提取出在人類基因組上是唯一的單核苷酸多態(tài)性位點;(3)過濾步驟(2)得到的單核苷酸多態(tài)性位點,提取出位點上下游距離位點l-60bp之間不包含任何單核苷酸多態(tài)性位點的單核苷酸多態(tài)性位點;(4)將步驟(3)得到的單核苷酸多態(tài)性位點與美國國立生物技術信息中心(NCBI)的基因組變異數(shù)據(jù)庫(DGV)中拷貝數(shù)變異(CNV)信息進行比較,過濾掉包含拷貝數(shù)變異(CNV)信息的單核苷酸多態(tài)性位點;(5)將步驟(4)得到的單核苷酸多態(tài)性位點與BWA索引數(shù)據(jù)庫比較,并過濾,使剩余的單核苷酸多態(tài)性位點的DNA片段之間是相互兼容的,即該多態(tài)性位點的DNA片段之間,沒有超過8bp的互補序列,同時各個多態(tài)性位點的DNA片段的GC含量應該在45-55%之間。步驟二,血漿中位點DNA的提取:提取待測血漿中游離DNA,并分離出包括步驟一獲得的位點序列的游離DNA片段:首先根據(jù)篩選出的位點設計探針;將探針綁定到生物磁珠上;將樣品DNA加入到帶有探針的生物磁珠中,使DNA與探針雜交;洗去多余的DNA模板;將綁定的樣品DNA從生物磁珠上洗脫下來。步驟三,PCR擴增反應:對步驟一中獲得的單核苷酸多態(tài)性位點序列設計PCR引物,并利用聚合酶鏈反應(PCR)擴增步驟二分離的游離DNA片段,得PCR擴增產(chǎn)物;步驟四,胎兒DNA量的計算:對步驟三獲得PCR擴增產(chǎn)物測序,并統(tǒng)計分析每個位點的測序片段量,根據(jù)不同等位基因之間的比率,計算胎兒DNA的量。其中,步驟二中,所述待測血漿由以下方法獲得:抽取5-10ml孕婦外周血,離心分離獲得血漿。其中,步驟二中,包括步驟一獲得的位點序列的游離DNA片段的分離方法,包括以下步驟:( 1)根據(jù)步驟一獲得的位點序列設計探針;(2)將探針綁定到生物磁珠上;(3)將提取的待測血漿中游離DNA加入到帶有探針的生物磁珠中,使DNA與探針雜交;(4)用商品化磁珠試劑盒中的清洗液洗去多余的DNA ;(5)用商品化磁珠試劑盒中的洗脫液將綁定的樣品DNA從生物磁珠上洗脫下來。有益效果:本發(fā)明提供的孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法,操作方法簡單,采用基于單核苷酸多態(tài)性位點的擴增,避免了使用Y染色體遺傳位點標記難以測定孕女胎的孕婦血漿中胎兒游離DNA的含量,應用廣泛、準確度高。該方法通過篩選獲得特定單核苷酸多態(tài)性位點,能夠準確測定胎兒DNA的含量,避免母親來源的游離DNA影響出現(xiàn)假陰性的結果,準確性高。同時,本發(fā)明可采用第二代高通量測序平臺,準確度高、數(shù)據(jù)量大、極大的降低了成本。說明書附1為本發(fā)明單核苷酸多態(tài)性位點的篩選方法的流程圖。圖2為本發(fā)明孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法的流程圖。圖3為本發(fā)明孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定結果。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例,可以更好地理解本發(fā)明。然而,本領域的技術人員容易理解,實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發(fā)明,而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。本發(fā)明所使用的試劑及軟件分別為:試劑:QiAamp Blood Mini Kit (Qiagen)提取 DNA 試劑盒Taq DNA聚合酶 購自MBI公司dNTPs 購自 Τ0Υ0Β0 公司探針、引物由上海生物工程公司合成TruSeq DNA HT Sample Prep Kit Support (iIlumina)測序試劑盒ddH20普通重蒸水(自制)dNTP Τ0Υ0Β0 公司Buffer Takara 公司20 μ M正向引物上海生物工程公司20 μ M反向引物上海生物工程公司DNA聚合酶MBI公司IOngDNA提取的孕婦外周血血漿DNA軟件:自編peri 腳本,BWA實施例1基于單核苷酸多態(tài)性位點的孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法,包括以下步驟:步驟一,單核苷酸多態(tài)性位點的篩選:從美國國立生物技術信息中心(NCBI)的單核苷酸多態(tài)性位點庫(dbSNP)中初步篩選出滿足以下條件的單核苷酸多態(tài)性位點:(I)小等位基因頻率(MAF)在0.4-0.5之間;(2)包含該多態(tài)性位點的DNA片段長度為50_70bp ;(3)位點上下游距離位點l_60bp之間不包含任何單核苷酸多態(tài)性位點;(4)包含該位點的50_70bp的DNA片段不是位于基因組變異數(shù)據(jù)庫中拷貝數(shù)變異范圍之內(nèi);
(5)該位點所處的片段在人類基因組范圍內(nèi)是特異的,保證該片段在人類基因組上是唯一的;(6)包含該多態(tài)性位點的50_70bp的DNA片段之間是相互兼容的,也就是這50-70bp的DNA片段之間,沒有超過8bp的互補序列,同時各個片段的GC含量應該在45-55%之間。單核苷酸多態(tài)性位點的篩選可利用軟件完成,包括以下步驟:(以下步驟根據(jù)附圖1得到,然而,該步驟及附圖1并未顯示篩選出該多態(tài)性位點的DNA片段長度為50-70bp ;此外,附圖1上兩端50_60bp不包含SNP位點請根據(jù)之前修改的權I修改)(I)從美國國立生物技術信息中心(NCBI)的單核苷酸多態(tài)性位點庫(dbSNP)中依據(jù)小等位基因頻率數(shù)值過濾,提取出小等位基因頻率在0.4-0.5之間的單核苷酸多態(tài)性位點,提取出的片段長度為50-70bp(2)將步驟(I)得到的單核苷酸多態(tài)性位點與人類基因組比較,提取出在人類基因組上是唯一的單核苷酸多態(tài)性位點;(3)過濾步驟(2)得到的單核苷酸多態(tài)性位點,提取出位點上下游距離位點l-60bp之間不包含任何單核苷酸多態(tài)性位點的單核苷酸多態(tài)性位點;(4)將步驟(3)得到的單核苷酸多態(tài)性位點與美國國立生物技術信息中心(NCBI)的基因組變異數(shù)據(jù)庫(DGV)中拷貝數(shù)變異(CNV)信息進行比較,過濾掉包含拷貝數(shù)變異(CNV)信息的單核苷酸多態(tài)性位點;(5)將步 驟(4)得到的單核苷酸多態(tài)性位點與BWA索引數(shù)據(jù)庫比較,并過濾,使剩余的單核苷酸多態(tài)性位點的DNA片段之間是相互兼容的,即該多態(tài)性位點的DNA片段之間,沒有超過8bp的互補序列,同時各個多態(tài)性位點的DNA片段的GC含量應該在45-55%之間。步驟二,血漿中位點DNA的提取:抽取孕12周以上孕婦外周血5_10ml,用離心法進行血衆(zhòng)分離,分離出的血衆(zhòng)用QiAamp Blood Mini Kit試劑盒提取血衆(zhòng)中游離的DNA ;采取以下步驟:根據(jù)步驟一獲得的位點序列設計探針;將探針綁定到生物磁珠上;將提取的待測血漿中游離DNA加入到帶有探針的生物磁珠中,使DNA與探針雜交;用商品化磁珠試劑盒中的清洗液洗去多余的DNA ;再用試劑盒中的洗脫液將綁定的樣品DNA從生物磁珠上洗脫下來,。步驟三,PCR擴增反應:對步驟一中獲得的單核苷酸多態(tài)性位點序列設計PCR引物,并利用聚合酶鏈反應(PCR)擴增步驟二分離的游離DNA片段,得PCR擴增產(chǎn)物;聚合酶鏈反應條件:其中,PCR反應體系為15 μ 1,包括:ddH20 10.25 μ IdNTP 1.5μ IBuffer 1.5μ I (含 2OmM 鎂離子緩沖液)20 μ M 正向引物 0.3μ120 μ M 反向引物 0.3μ1DNA 聚合酶 0.15 μ IIOngDNA 1.0μ I
PCR 反應條件:(1)94 °C for4min, lcycle, (2)94 °C for30s,53 °C for50s,70°C forlmin, 32cycle, (3) 72°C for7min, lcycle ;在 PE9600 型 PCR 儀進行。步驟四,胎兒DNA量的計算:對步驟三獲得PCR擴增產(chǎn)物測序,可選用現(xiàn)有的第二代高通量測序技術,本發(fā)明采用了 illumina測序平臺。具體操作根據(jù)iIIumina測序流程進行:首先是文庫制備;包括末端修飾,加A到3’端,兩端加接頭,選擇加上接頭的DNA,擴增達到合適的上樣量;接著將模板雜交到flow cell上進行橋式擴增形成簇;最后對模板序列執(zhí)行測序。根據(jù)單核苷酸多態(tài)性位點等位基因的讀數(shù)統(tǒng)計,計算出母親和胎兒的游離DNA的比例。計算胎兒DNA含量時,所需考慮的位點信息如下:母親基因型為純合,胎兒基因型為雜合。胎兒DNA含量的計算方法如下:計算所有符合條件的位點(公式1),得到胎兒DNA含量列表,取該列表的中值(公式2);公式I =Zi=XiAXfYi)1:符合條件的某一位點;Xi:i位點上胎兒等位基因數(shù)量;Yi:i位點上母親等位基因數(shù)量;Zi:i位點上胎兒含量。

公式2: μ =Median (Z)μ:某一樣本的胎兒DNA含量,取Z列表的中值。由以上公式可計算出Median對應的胎兒DNA含量;通過上述技術流程分析了 25個男性胎兒樣本,其胎兒DNA含量已經(jīng)通過Y染色體標記計算出,將我們的測試結果與之比較,結果見圖3,Y軸為本發(fā)明方法的測試結果與通過Y染色體標記計算得到平均值之間的差值,由此可見,差值范圍在[-0.004,0.004]區(qū)間,說明本發(fā)明測定方法準確。
權利要求
1.一種基于單核苷酸多態(tài)性位點的孕婦血漿中胎兒DNAi量的測定方法,其特征在于:包括以下步驟: 步驟一,單核苷酸多態(tài)性位點的篩選:從單核苷酸多態(tài)性位點庫中初步篩選出滿足以下條件的單核苷酸多態(tài)性位點: Cl)小等位基因頻率在0.4-0.5之間; (2)包含該多態(tài)性位點的DNA片段長度為50-70bp; (3)位點上下游距離位點l_60bp之間不包含任何單核苷酸多態(tài)性位點; (4)包含該多態(tài)性位點的DNA片段不是位于基因組變異數(shù)據(jù)庫中拷貝數(shù)變異范圍之內(nèi); (5)該多態(tài)性位點所處的片段在人類基因組范圍內(nèi)是特異的; (6)包含該多態(tài)性位點的DNA片段之間是相互兼容的,即該多態(tài)性位點的DNA片段之間,沒有超過8bp的互補序列,同時各個多態(tài)性位點的DNA片段的GC含量應該在45-55%之間。
步驟二,血漿中包含位點序列游離DNA片段的提取:提取待測血漿中游離DNA,并分離出包括步驟一獲得的位點序列的游離DNA片段; 步驟三,PCR擴增反應:對步驟一中獲得的單核苷酸多態(tài)性位點序列設計PCR引物,并利用聚合酶鏈反應擴增步驟二分離的游離DNA片段,得PCR擴增產(chǎn)物; 步驟四,胎兒DNA量的 計算:對步驟三獲得PCR擴增產(chǎn)物測序,并統(tǒng)計分析每個位點的片段數(shù)量,根據(jù)不同等位基因之間的比率,計算胎兒DNA的量。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種基于單核苷酸多態(tài)性位點的孕婦血漿中胎兒DNA立量的測定方法,其特征在于:步驟一中,單核苷酸多態(tài)性位點的篩選可利用軟件完成,包括以下步驟: (1)從美國國立生物技術信息中心(NCBI)的單核苷酸多態(tài)性位點庫(dbSNP)中依據(jù)小等位基因頻率數(shù)值過濾,提取出小等位基因頻率在0.4-0.5之間的單核苷酸多態(tài)性位點,提取出的片段長度為50-70bp ; (2)將步驟(I)得到的單核苷酸多態(tài)性位點與人類基因組比較,提取出在人類基因組上是唯一的單核苷酸多態(tài)性位點; (3)過濾步驟(2)得到的單核苷酸多態(tài)性位點,提取出位點上下游距離位點l_60bp之間不包含任何單核苷酸多態(tài)性位點的單核苷酸多態(tài)性位點; (4)將步驟(3)得到的單核苷酸多態(tài)性位點與美國國立生物技術信息中心(NCBI)的基因組變異數(shù)據(jù)庫(DGV)中拷貝數(shù)變異(CNV)信息進行比較,過濾掉包含拷貝數(shù)變異(CNV)信息的單核苷酸多態(tài)性位點; (5)將步驟(4)得到的單核苷酸多態(tài)性位點與BWA索引數(shù)據(jù)庫比較,并過濾,使剩余的單核苷酸多態(tài)性位點的DNA片段之間是相互兼容的,即該多態(tài)性位點的DNA片段之間,沒有超過8bp的互補序列,同時各個多態(tài)性位點的DNA片段的GC含量應該在45-55%之間。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種基于單核苷酸多態(tài)性位點的孕婦血漿中胎兒DNAj量的測定方法,其特征在于:步驟二中,所述待測血漿由以下方法獲得:抽取5-10ml孕婦外周血,離心分離獲得血漿。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種基于單核苷酸多態(tài)性位點的孕婦血漿中胎兒DNAj量的測定方法,其特征在于:步驟二中,包括步驟一獲得的位點序列的游離DNA片段的分離方法,包括以下步驟: (1)根據(jù)步驟一獲得的位點序列設計探針; (2)將探針綁定到生物磁珠上; (3)將提取的待測血漿中游離DNA加入到帶有探針的生物磁珠中,使DNA與探針雜交; (4)用洗去多余的DNA; (5)將綁定的樣品DNA從生物磁珠上洗脫下來。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于單核苷酸多態(tài)性位點的孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法,包括單核苷酸多態(tài)性位點的篩選、血漿中位點DNA的提取、PCR擴增反應、胎兒DNA量的計算等步驟。該方法操作方法簡單,采用基于單核苷酸多態(tài)性位點的擴增,避免了使用Y染色體遺傳位點標記難以測定孕女胎的孕婦血漿中胎兒游離DNA的含量,應用廣泛、準確度高。
文檔編號C12Q1/68GK103215350SQ201310098730
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月26日 優(yōu)先權日2013年3月26日
發(fā)明者梁波, 孔令印 申請人:賽業(yè)(蘇州)生物信息技術有限公司
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