專利名稱：用于檢測火雞出血性腸炎病毒的lamp引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測火雞出血性腸炎病毒(HEV)的 LAMP 引物。
背景技術(shù)：
LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)技術(shù)是由 Notomi 等在 2000年發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。該方法采用特異地識別靶序列上六個區(qū)域的四條引物(兩條外引物，兩條內(nèi)引物)及具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在60 65°C進(jìn)行核酸的指數(shù)級擴(kuò)增，其擴(kuò)增效率可達(dá)到IO9 IOltl個拷貝數(shù)量級；整個反應(yīng)僅需50min，在擴(kuò)增反應(yīng)中副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀與SYBR Green I或鈣黃綠素結(jié)合，產(chǎn)生黃綠色熒光，不需要借助其他儀器便可辨別實(shí)驗結(jié)果。LAMP技術(shù)具有簡便、快速、準(zhǔn)確、廉價、易檢測等特點(diǎn)。目前，國內(nèi)外尚未見采用LAMP引物檢測HEV的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種用于檢測火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種用于檢測火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物，其核苷酸序列如下所示:F3:5’ GCAATTTTATGAATATGGGTGAA3’ ；B3:5， TGAAGCAGTTCCAGTAGC3，；FIP:5’ CAGGCATTGGATCAACATTAAATGTGACTGACCTTGGACAGAG3’ ；BIP:5’ AGTGTTTTTGATTGTGTTAGGGTCAAAAAGGAGTTCTGAAATAAGCT3，。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:(I)本發(fā)明以4條精確設(shè)計的引物嚴(yán)格識別靶核苷酸序列上的6個獨(dú)立區(qū)域，從而避免反應(yīng)混合物中存在的非靶序列的影響，特異性高。(2)本發(fā)明的擴(kuò)增模板量為100拷貝，比常規(guī)PCR檢測高I 2數(shù)量級，靈敏性比較聞。(3)本發(fā)明的LAMP不需通過溫度循環(huán)變化來擴(kuò)增，免除變溫過程耗費(fèi)的時間，使反應(yīng)在30 60min就能將幾個拷貝的靶基因高效擴(kuò)增，反應(yīng)時間短。(4)本發(fā)明的設(shè)備簡單，不需凝膠成像系統(tǒng)，只需一臺普通水浴鍋或者濁度儀，且檢測結(jié)果可肉眼直接觀察，易于判定。


圖1是實(shí)施例1的火雞出血性腸炎病毒的LAMP濁度檢測結(jié)果。圖2是實(shí)施例1的火雞出血性腸炎病毒的LAMP可視化檢測結(jié)果；其中:A為SYBRgreen I的可視化檢測結(jié)果；B為鈣黃綠素可視化檢測結(jié)果；C為SYBR green I反應(yīng)后在紫外燈下的熒光效應(yīng)結(jié)果；代表陰性反應(yīng)，“+”代表陽性反應(yīng)。圖3是實(shí)施例2的酶切電泳鑒定LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)果圖；其中:M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000的電泳鑒定結(jié)果圖；NC為陰性對照的電泳鑒定結(jié)果圖；1為HEV LAMP陽性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定結(jié)果圖；2為HEV LAMP陽性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Tsp45I酶切產(chǎn)物的電泳鑒定結(jié)果圖。圖4是實(shí)施例3的不同濃度的火雞出血性腸炎病毒的LAMP濁度檢測結(jié)果；其中:A為IO5拷貝/管的陽性質(zhì)粒的LAMP濁度檢測結(jié)果；B為IO4拷貝/管的陽性質(zhì)粒的LAMP濁度檢測結(jié)果；C為IO3拷貝/管的陽性質(zhì)粒的LAMP濁度檢測結(jié)果；D為IO2拷貝/管的陽性質(zhì)粒的LAMP濁度檢測結(jié)果。圖5是實(shí)施例3的不同濃度的火雞出血性腸炎病毒的LAMP在SYBR green I反應(yīng)后于可見光下的熒光效應(yīng)結(jié)果；其中:A為IO5拷貝/管的陽性質(zhì)粒的LAMP在SYBR greenI反應(yīng)后于可見光下的熒光效應(yīng)結(jié)果；B為IO4拷貝/管的陽性質(zhì)粒的LAMP在SYBR greenI反應(yīng)后于可見光下的熒光效應(yīng)結(jié)果；C為IO3拷貝/管的陽性質(zhì)粒的LAMP在SYBR greenI反應(yīng)后于可見光下的熒光效應(yīng)結(jié)果；D為IO2拷貝/管的陽性質(zhì)粒的LAMP在SYBR greenI反應(yīng)后于可見光下的熒光效應(yīng)結(jié)果；E為IO1拷貝/管的陽性質(zhì)粒的LAMP在SYBR greenI反應(yīng)后于可見光下的熒光效應(yīng)結(jié)果；F為10°拷貝/管的陽性質(zhì)粒的LAMP在SYBR greenI反應(yīng)后于可見光下的熒光效應(yīng)結(jié)果；G為陰性反應(yīng)的LAMP在SYBR green I反應(yīng)后于可見光下不出現(xiàn)熒光效應(yīng)結(jié)果；H為陰性反應(yīng)的LAMP在SYBR green I反應(yīng)后于可見光下的不出現(xiàn)熒光效應(yīng)結(jié)果。圖6是效果實(shí)施例的火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物濁度特異性檢測結(jié)果；其中:A為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對EDSV毒株DNA的濁度特異性檢測結(jié)果；B為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對IBDV毒株cDNA的濁度特異性檢測結(jié)果；C為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對ALV-J毒株cDNA的濁度特異性檢測結(jié)果；D為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對AIV毒株cDNA 的濁度特異性檢測結(jié)果；E為火雞出血性腸炎病毒的LAMP弓I物對ARV毒株cDNA的濁度特異性檢測結(jié)果；F為火雞出血性腸炎病毒的LAMP弓丨物對HEV毒株DNA的濁度特異性檢測結(jié)果。圖7是效果實(shí)施例的火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物熒光顯色特異性檢測結(jié)果；其中:A為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對EDSV毒株DNA在SYBR green I反應(yīng)后于可見光下不出現(xiàn)熒光效應(yīng)結(jié)果；B為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對IBDV毒株cDNA在SYBR green I反應(yīng)后于可見光下不出現(xiàn)熒光效應(yīng)結(jié)果；C為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對ALV-J毒株cDNA在SYBR green I反應(yīng)后于可見光下不出現(xiàn)熒光效應(yīng)結(jié)果；D為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對AIV毒株cDNA在SYBR green I反應(yīng)后于可見光下不出現(xiàn)熒光效應(yīng)結(jié)果；E為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對ARV毒株cDNA在SYBR green I反應(yīng)后于可見光下不出現(xiàn)熒光效應(yīng)結(jié)果；F為火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物對HEV毒株DNA在SYBR green I反應(yīng)后于可見光下的熒光效應(yīng)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1(I)材料:Bst DNA 聚合酶(Bst DNA ploymerse large fragment, New EnglandBiolab公司);甜菜堿(Betaine, Sigma公司);病毒DNA提取試劑盒(OMEGA公司，D3892-01);電泳用SYBR Green I (Invitrogen公司)；|丐黃綠素(Calcein, Sigma公司)；三聯(lián)水浴鍋(溫度可達(dá)70°C即可)。(2)用于檢測火雞出血性腸炎病毒(HEV)的LAMP引物的制備:I)通過NCBI (美國國立生物信息中心)上已公布的HEV (Hemorrhagic EnteritisVirus)的Virginia Avirulent Strain (AY849321)的病毒全基因序列，與國外其他幾株(AC_000016, NC_001958, AF074946) HEV全基因序列進(jìn)行同源性比較，確定火雞出血性腸炎病毒基因組的特異序列區(qū)，特異序列區(qū)為240bp ；2)特異序列在線提交 Primer Explorer (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index, html)生成LAMP弓丨物，得到如下引物:F3:5’ GCAATTTTATGAATATGGGTGAA3’ ；B3:5， TGAAGCAGTTCCAGTAGC3，；FIP:5’ CAGGCATTGGATCAACATTAAATGTGACTGACCTTGGACAGAG3’ ；BIP:5’ AGTGTTTTTGATTGTGTTAGGGTCAAAAAGGAGTTCTGAAATAAGCT3’ ；3)生成的LAMP引物(F3和B3，BIP和FIP)，送上海英俊生物技術(shù)有限公司合成；(3) LAMP反應(yīng)體系:引物稀釋成25pmol/μ L ;25 μ L反應(yīng)體系中，各成分的量如表I和表2 ；
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運(yùn)用上述引物檢測火雞出血性腸炎病毒的方法，包括如下步驟:I)實(shí)驗條件參考 Notomi 等建立的 LAMP 方法(Notomi T, Okayama H, MasubuchiH, et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic AcidsRes.，2000，28(12):E63)加以改進(jìn)，以制備的病毒DNA為模板，LAMP的反應(yīng)體系25μ L，添加各組分的體積見表I和表2 ;反應(yīng)在62°C水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)時間為50min，反應(yīng)結(jié)束后于85°C滅活8min ；2)反應(yīng)結(jié)果的判定:A、實(shí)時濁度判定:用LA-320C濁度儀對LAMP副產(chǎn)物焦磷酸鎂的形成每6s進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，當(dāng)濁度超過閾值(0.1)形成明顯擴(kuò)增時判斷為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)；結(jié)果如圖1所示，陽性反應(yīng)濁度在超過30分鐘時曲線呈明顯擴(kuò)增狀態(tài)；B:反應(yīng)前，在體系中加入SYBR green I或者鈣黃綠素，若反應(yīng)為陽性，則可見光下反應(yīng)管呈現(xiàn)黃綠色；若反應(yīng)為陰性，則可見光下反應(yīng)管呈現(xiàn)橘紅色；且陽性反應(yīng)在紫外燈下會產(chǎn)生熒光效應(yīng)。結(jié)果如圖2所示，A為體系中加入SYBR green I陽性反應(yīng)在可見光下反應(yīng)管呈現(xiàn)黃綠色，陰性反應(yīng)在可見光下反應(yīng)管呈現(xiàn)橘紅色；B為體系中加入鈣黃綠素(Calcein)陽性反應(yīng)在可見光下反應(yīng)管呈現(xiàn)黃綠色，陰性反應(yīng)在可見光下反應(yīng)管呈現(xiàn)橘紅色；C為加入SYBR green I陽性反應(yīng)在紫外燈下會產(chǎn)生熒光效應(yīng)，而陰性反應(yīng)管則無熒光效應(yīng)。表I環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)反應(yīng)體系I
權(quán)利要求
1.一種用于檢測火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物，其特征在于核苷酸序列如下所示:F3:5’ GCAATTTTATGAATATGGGTGAA3’ ；B3:5， TGAAGCAGTTCCAGTAGC3，；FIP:5’ CAGGCATTGGATCAACATTAAATGTGACTGACCTTGGACAGAG3’ ；BIP:5’ AGTGTTTTTGATT·GTGTTAGGGTCAAAAAGGAGTTCTGAAATAAGCT3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測火雞出血性腸炎病毒的LAMP引物。該LAMP引物由一對外圍引物和一對內(nèi)引物組成，其核苷酸序列如SEQ NO.1～4所示。該引物特異性強(qiáng)，能嚴(yán)格識別靶核苷酸序列上的6個獨(dú)立區(qū)域，從而避免反應(yīng)混合物中存在的非靶序列的影響；擴(kuò)增模板量低至10拷貝，靈敏性高。本發(fā)明的LAMP不需通過溫度循環(huán)變化來擴(kuò)增，反應(yīng)在30～60min就能將幾個拷貝的靶基因高效擴(kuò)增，反應(yīng)時間短；而且設(shè)備簡單，檢測結(jié)果可肉眼直接觀察，易于判定。
文檔編號C12Q1/70GK103243173SQ20131007906
公開日2013年8月14日 申請日期2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月12日
發(fā)明者曹偉勝, 劉雪美, 廖明, 徐成剛 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)