專利名稱：一種三液相脂肪酶催化體系水解脂類生產(chǎn)脂肪酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程與食品技術(shù)領(lǐng)域，涉及到酶的分離與應(yīng)用技術(shù)，特別涉及到從粗酶液中分離脂肪酶以及脂肪酶水解脂類生產(chǎn)脂肪酸的方法。
背景技術(shù)：
作為油脂化工領(lǐng)域最重要的基礎(chǔ)原料，脂肪酸廣泛應(yīng)用于肥皂、表面活性劑、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。目前，脂肪酸的年產(chǎn)量超過350萬噸，其主要的工業(yè)生產(chǎn)途徑是通過油脂水解產(chǎn)生的。前者需要高溫高壓，能耗大，副產(chǎn)物多，而且不適用于含有羥基脂肪酸、多不飽和脂肪酸酸、熱敏性脂肪酸等油脂的水解；而堿水解不但能耗大，而且需要消耗大量的酸、堿及水資源。另外，前兩種方法均會(huì)副產(chǎn)大量低濃度甘油20%)，需要大量的能耗和額外的設(shè)備投資加以回收。酶水解不但具有條件溫和、能耗低、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，而且能夠選擇性水解不同結(jié)構(gòu)和位置的脂肪酸，因而受到了廣泛的重視。最近幾十年，科學(xué)家在脂肪酶水解油酯產(chǎn)脂肪酸作了一系列的嘗試，例如，Rafael等用固定化脂肪酶的方法從大豆油中水解生產(chǎn)脂肪酸，但是，該工藝需要兩種固定化酶的協(xié)同才能有效，并且酶用量 大，需利用正己烷洗滌的方式才能恢復(fù)酶的水解效果，導(dǎo)致了其成本巨大，工業(yè)應(yīng)用困難等難題(Process Biochemistry, 2011,46:682 - 688XRathod等研究了不同添加劑對脂肪酶水解植物油的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有合適的添加劑能夠促進(jìn)脂肪酶的水解反應(yīng)，并且經(jīng)過四次反應(yīng)后，酶活降低了 80%。(Biochemical Engineering Journal,2009,47:93 - 99)?？傮w而言，脂肪酶過高的價(jià)格，連續(xù)化生產(chǎn)困難，產(chǎn)物抑制帶來的反應(yīng)效率低、反應(yīng)時(shí)間長等問題制約了該方法的大規(guī)模應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對目前酶法水解脂類生產(chǎn)脂肪酸過程中，存在的脂肪酶分離成本高，連續(xù)化生產(chǎn)困難，產(chǎn)物抑制帶來的反應(yīng)效率低、反應(yīng)時(shí)間長等問題，提供了一種從粗酶液中分離脂肪酶以及脂肪酶水解脂類生產(chǎn)脂肪酸的方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種三液相脂肪酶催化體系水解脂類生產(chǎn)脂肪酸的方法，包含以下步驟:(I)配置脂肪酶濃度為5_20000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性無機(jī)鹽、醇類或酮類親水性有機(jī)物和脂類，配成三液相體系；所述無機(jī)鹽、親水性有機(jī)物和脂類與酶液的質(zhì)量比分別為 0.1-1,0.08-1 和 0.05-5 ；(2)將配置好的三液相體系置于攪拌釜中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，靜置或離心至分為上中下三層，收集上層產(chǎn)物即為脂肪酸相，中層為富酶相，下層為富甘油相。上層的脂肪酸相，經(jīng)過加熱或吸附除水后，即可作為產(chǎn)品采出；中層的富酶相，可直接作為下次反應(yīng)應(yīng)用，也可經(jīng)超濾或吸附的方法得到純酶產(chǎn)品；下層的富甘油相，經(jīng)溶劑析出或降溫結(jié)晶等方式除鹽后，可得甘油水溶液。優(yōu)選地，步驟(2)所述反應(yīng)攪拌轉(zhuǎn)速30_500rpm，所述反應(yīng)溫度為5_80°C，所述反應(yīng)時(shí)間為0.5-120h。優(yōu)選地，步驟(2)所述反應(yīng)攪拌轉(zhuǎn)速50-300rpm，所述反應(yīng)溫度為20_80°C，所述反應(yīng)時(shí)間為l_48h。優(yōu)選地，所述可溶性無機(jī)鹽是氯化鈉、硫酸銨、碳酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸鉀、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀中的一種或兩種以上。優(yōu)選地，所述親水性有機(jī)物為聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、乙二醇或丙酮。為了使脂類水解效果盡可能達(dá)到最佳，脂肪酸盡可能分配至上相，脂肪酶盡可能保留至中間相，甘油盡可能保留在下相，可以調(diào)節(jié)體系的PH值。優(yōu)選地，所述三液相溶液的PH值為3-13。更優(yōu)選地，所述三液相溶液的pH值為6-8。優(yōu)選地，所述步驟(I)和(2)的操作在低于親水性有機(jī)物易揮發(fā)的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，所述脂肪酶濃度為50-2000U/mL。優(yōu)選地，所述無機(jī)鹽、親水性有機(jī)物和脂類與酶液質(zhì)量比分別為0.2-0.8,0.2-0.8和 0.2_4。上述脂肪酶催化反應(yīng)中，脂肪酶可以來自天然，也可以通過人工發(fā)酵產(chǎn)生；可以是發(fā)酵液，可以是經(jīng)簡單純化后的粗酶，也可是經(jīng)純化后純酶。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下有益效果:(I)本發(fā)明利用三液相體系萃取粗酶液中的脂肪酶直接水解生產(chǎn)脂肪酸，既可大幅降低酶的生產(chǎn)成本； 又可解決甘油和酶分離能耗大、成本高、污染大等問題。(2)本發(fā)明工藝得以簡化，分離時(shí)間短，成本降低，經(jīng)濟(jì)可行。具體表現(xiàn)在:利用三液相體系可將脂肪酸分配在上相，脂肪酶分配在中相，甘油富集在下相的特性，既有利于酶的純化與回收，也有利于解除產(chǎn)物的抑制，提高催化效率，從而大幅降低酶的損耗與純化成本。該方法具有能耗小、原料利用率高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，解決了現(xiàn)有酶水解法生產(chǎn)脂肪酸難于工業(yè)化的技術(shù)難題。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。本實(shí)施例中本實(shí)施例中所用脂肪酶中，TL-100L、PL20000L購于Novozyme公司，AY-30購于Amano公司，Tl脂肪酶系通過實(shí)驗(yàn)室克隆來源于Malassezia globosa中的一段基因序列(GenBank accession number AY260764),并在畢赤酵母X33中的表達(dá),經(jīng)搖瓶發(fā)酵、離心、超濾等步驟得到。實(shí)施例1取適量脂肪酶AY30置于錐形瓶中，加入10倍體積的水，混勻后，取1.2g粗酶液(410U/ml)，加入0.4g的硫酸銨，混勻后加入0.4g聚乙二醇400和0.4g橄欖油，裝入具塞三角瓶中混合均勻，并置于轉(zhuǎn)速為200rpm的恒溫?fù)u床上，控制在37°C下反應(yīng)24h。另取1.2g粗酶液，加入0.4g橄欖油，并用水稀釋至相同體積，在相同條件下反應(yīng)作為對照。反應(yīng)結(jié)束后，靜置0.5h，實(shí)驗(yàn)組分為三相，對照組分為兩相，分別取上相測其脂肪酸含量，取三液相中相測量其酶活，取中，下相測量其甘油分配情況，可得橄欖油水解率可達(dá)96.6%，比對照組提高了 129%，脂肪酶主要分配于中相，分配系數(shù)可達(dá)4.72，甘油主要分配于下相，脂肪酶與甘油的選擇性系數(shù)可達(dá)7.58。實(shí)施例2取適量脂肪酶TL100L置于錐形瓶中，加入10倍體積的水，混勻后，取1.2g粗酶液(1300U/ml)，加入0.4g的硫酸銨，混勻后加入0.4g聚乙二醇600和0.4g橄欖油，裝入具塞三角瓶中混合均勻，并置于轉(zhuǎn)速為200rpm的恒溫?fù)u床上，控制在37°C下反應(yīng)36h。另取1.2g粗酶液和0.4g橄欖油，并用水稀釋至相同體積，在相同條件下反應(yīng)作為對照。反應(yīng)結(jié)束后，靜置0.5h，實(shí)驗(yàn)組分為三相，對照組分為兩相，分別取上相測其脂肪酸含量，取三液相中相測量其酶活，取中，下相測量其甘油分配情況，可得橄欖油水解率可達(dá)86.6%，比對照組提高了 76.4%，脂肪酶主要分配于中相，分配系數(shù)可達(dá)7.89，甘油主要分配于下相，脂肪酶與甘油的選擇性系數(shù)可達(dá)12.08。實(shí)施例3取適量脂肪酶PL20000L置于錐形瓶中，加入10倍體積的水，混勻后，取1.2g粗酶液(920U/ml)，加入0.4g的硫酸銨，混勻后加入0.4g聚乙二醇2000和0.4g橄欖油，裝入具塞三角瓶中混合均勻，并置于轉(zhuǎn)速為200rpm的恒溫?fù)u床上，控制在37°C下反應(yīng)36h。另取
1.2g粗酶液和0.4g橄欖油，并用水稀釋至相同體積，在相同條件下反應(yīng)作為對照。反應(yīng)結(jié)束后，靜置0.5h，實(shí)驗(yàn)組分為三相，對照組分為兩相，分別取上相測其脂肪酸含量，取三液相中相測量其酶活，取中，下相測量其甘油分配情況，可得橄欖油水解率可達(dá)89.6%，比對照組提高了 89%，脂肪酶主要分配于中相，分配系數(shù)可達(dá)7.39，甘油主要分配于下相，脂肪酶與甘油的選擇性系數(shù)可達(dá)11.87。實(shí)施例4取適量脂肪酶Tl 置于錐形瓶中，加入10倍體積的水，混勻后，取1.3g粗酶液(180U/ml)，加入0.3g的硫酸鈉，混勻后加入0.4g聚乙二醇400和0.4g橄欖油，裝入具塞三角瓶中混合均勻，并置于轉(zhuǎn)速為200rpm的恒溫?fù)u床上，控制在37°C下反應(yīng)36h。另取1.3g粗酶液和0.4g橄欖油，并用水稀釋至相同體積，在相同條件下反應(yīng)作為對照。反應(yīng)結(jié)束后，靜置0.5h，實(shí)驗(yàn)組分為三相，對照組分為兩相，分別取上相測其脂肪酸含量，取三液相中相測量其酶活，取中，下相測量其甘油分配情況，可得橄欖油水解率可達(dá)26.0%，比對照組提高了 130%，脂肪酶主要分配于中相，分配系數(shù)可達(dá)3.48，甘油主要分配于下相，脂肪酶與甘油的選擇性系數(shù)可達(dá)4.51。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種三液相脂肪酶催化體系水解脂類生產(chǎn)脂肪酸的方法，其特征在于，包含以下步驟: (1)配置脂肪酶濃度為5-20000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性無機(jī)鹽、醇類或酮類親水性有機(jī)物和脂類，配成三液相體系；所述無機(jī)鹽、親水性有機(jī)物和脂類與酶液的質(zhì)量比分別為 0.1-1,0.08-1 和 0.05-5 ； (2)將配置好的三液相體系置于攪拌釜中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，靜置或離心至分為上中下三層，收集上層產(chǎn)物即為脂肪酸相。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述反應(yīng)攪拌轉(zhuǎn)速30-500rpm，所述反應(yīng)溫度為5-80°C，所述反應(yīng)時(shí)間為0.5-120h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述反應(yīng)攪拌轉(zhuǎn)速50-300rpm，所述反應(yīng)溫度為20-80°C，所述反應(yīng)時(shí)間為l_48h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述可溶性無機(jī)鹽是氯化鈉、硫酸銨、碳酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸鉀、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀中的一種或兩種以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述親水性有機(jī)物為聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、乙二醇或丙酮。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶來自天然或者通過人工發(fā)酵產(chǎn)生；或是發(fā)酵液，或是經(jīng)簡單純化后的粗酶，或是經(jīng)純化后純酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述三液相溶液的pH值為3-13。
8.根據(jù)權(quán)利要 求7所述的方法，其特征在于，所述三液相溶液的pH值為6-8。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述脂肪酶濃度為50-2000U/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述無機(jī)鹽、親水性有機(jī)物和脂類與酶液質(zhì)量比分別為0.2-0.8,0.2-0.8和0.2-4。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種三液相脂肪酶催化體系水解脂類生產(chǎn)脂肪酸的方法，包含以下步驟(1)配置脂肪酶濃度為5-20000U/mL的酶液，向酶液中添加可溶性無機(jī)鹽、醇類或酮類親水性有機(jī)物和脂類，配成三液相體系；(2)將配置好的三液相體系置于攪拌釜中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，靜置或離心至分為上中下三層，收集上層產(chǎn)物即為脂肪酸相。本發(fā)明利用三液相體系萃取粗酶液中的脂肪酶直接水解生產(chǎn)脂肪酸，既可大幅降低酶的生產(chǎn)成本；又可解決甘油和酶分離能耗大、成本高、污染大等問題。
文檔編號C12P7/64GK103184245SQ20131006727
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者王永華, 李志剛, 楊博, 王衛(wèi)飛 申請人:華南理工大學(xué)