一種海帶降解菌及其制備海帶汁的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一株具有海帶降解活性的海帶降解菌株。所述菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，分類(lèi)命名為T(mén)amlana?alginolytica，保藏號(hào)為CGMCCNo.5324。提供的菌株能夠產(chǎn)生具有多種多糖降解活性的胞外復(fù)合酶系，能夠?qū)崿F(xiàn)海帶的深度降解。本發(fā)明提供了兩種無(wú)需添加浸提介質(zhì)，不需加熱保溫輔助的海帶汁制取工藝，即以海帶塊為原料的菌處理工藝和以海帶粉為原料的酶處理工藝，兩者均能在溫和條件下通過(guò)生物降解作用將海帶多糖降解為還原性的寡糖或單糖，同時(shí)達(dá)到脫腥的效果。本發(fā)明提高了原料的綜合利用率和食用品質(zhì)，為海帶的精深加工提供了技術(shù)支持，在海帶飲品的開(kāi)發(fā)方面具有極大的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種海帶降解菌及其制備海帶汁的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境微生物【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一株海洋細(xì)菌alginolyticaZJU HZ22,菌株保藏號(hào)為CGMCC N0.5324，及其在海帶汁生物制取中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]海帶養(yǎng)殖是西北太平洋海域，主要包括中國(guó)、日本、韓國(guó)等國(guó)家的特色海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，目前，我國(guó)的海帶年產(chǎn)量已達(dá)80萬(wàn)噸(干重)以上，居世界首位，而日韓兩國(guó)的養(yǎng)殖規(guī)模僅在每年20萬(wàn)和10萬(wàn)噸(干重)左右。但是，相比于養(yǎng)殖上的優(yōu)勢(shì)，我國(guó)的海帶加工水平卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于日韓兩國(guó)，主要表現(xiàn)在:1.原料綜合利用率低，目前我國(guó)的海帶綜合利用率尚不足30%，約2/3的海帶活性成分未被開(kāi)發(fā)，而在海帶加工技術(shù)發(fā)達(dá)的日本和韓國(guó)，其海帶綜合利用率已達(dá)80%以上；2.成形產(chǎn)品的品種單一且技術(shù)含量低，迄今我國(guó)的海帶食品僅幾十種，且基本局限于海帶結(jié)、海帶絲等初級(jí)加工品，而在日本，目前已形成130多個(gè)系列、300多個(gè)品種的海帶食品和保健品。綜上所述，我國(guó)的海帶產(chǎn)業(yè)存在著無(wú)法將自身的原料優(yōu)勢(shì)有效地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)的不平衡發(fā)展趨勢(shì)，其本質(zhì)原因在于我國(guó)海帶加工的工藝技術(shù)更新滯后，缺乏創(chuàng)新，因此，立足于海帶的天然食用價(jià)值，以現(xiàn)代生物技術(shù)為核心研發(fā)相應(yīng)的海帶精深加工工藝，是解決上述問(wèn)題的關(guān)鍵所在。
[0003]海帶富含碳水化合物，占藻體干重的44-56%，包括褐藻膠(22-26%)，甘露醇(11-18%)，粗纖維(9.8%左右)以及海帶淀粉(1%)、褐藻糖膠(0.3-1.5%)等，其中，褐藻膠是最主要的海帶營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，褐藻膠具有多種生理學(xué)活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和病毒、抗氧化、降血脂和血糖、抗凝血和血栓、抗輻射等，而褐藻膠寡糖更是極好的食品原材料和添加劑，具有整腸、解毒、降血糖血脂、抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等保健功能。由此可見(jiàn)，褐藻膠也是最重要的海帶功能成分。然而，現(xiàn)代生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，褐藻膠是一類(lèi)結(jié)構(gòu)多糖，存在于海帶藻體最堅(jiān)固的部分——細(xì)胞壁中，其特異性降解酶主要來(lái)源于海洋生物，人體自身的消化系統(tǒng)，包括腸道微生物均不具備降解褐藻膠的能力，無(wú)法從具有天然藻體結(jié)構(gòu)的海帶食品中有效地獲取和吸收。因此，借助工藝技術(shù)破解藻體結(jié)構(gòu)，提取功能成分，也即進(jìn)行“體外預(yù)消化”，是海帶精深加工的重要內(nèi)容。
[0004]目前，我國(guó)以去除藻體結(jié)構(gòu)為目的的海帶預(yù)處理手段多為浸汁法，包括機(jī)械切分、打漿、浸提等主要步驟，其中，浸提方法略有變化，采用的浸提介質(zhì)包括水、酸、酒精、堿液(如蘇打)等，工藝上多需要加熱保溫處理，同時(shí)還需要附加一定的脫腥處理，諸如添加助劑浸泡，添加氣味濃郁的輔料掩蔽，采用活性炭吸附，以及通過(guò)酵母的短時(shí)發(fā)酵作用(30-60min)脫腥?；谏鲜龇椒ǖ闹迫〖夹g(shù)主要是從宏觀角度破壞肉眼可見(jiàn)的藻體結(jié)構(gòu)，但從微觀角度而言，多糖類(lèi)物質(zhì)的降解程度依然有限，其最直接的證據(jù)即在于需要額外的脫腥處理，因?yàn)楹衷迥z本身即是腥味的主要來(lái)源。2007年，胡志和等對(duì)酶解制取海帶汁的方法進(jìn)行了研究和報(bào)道，即通過(guò)添加纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶對(duì)海帶粉進(jìn)行處理，再加水浸提獲取海帶汁，這是國(guó)內(nèi)首次也是唯一一個(gè)利用酶解技術(shù)制取海帶汁的報(bào)道，但其未針對(duì)海帶中含量最高的褐藻膠進(jìn)行酶解處理，其中的重要原因在于，目前上市的褐藻膠裂解酶制劑極少，同時(shí)極其昂貴。2011年，日本的Wakabayashi等獲得了一株能夠完全降解裙帶菜的縛MMicrobulbifer sp.6532A,雖然該研究的初衷并不在于海藻的深加工技術(shù)開(kāi)發(fā),但卻提供了一種新的深加工技術(shù)的研發(fā)思路，即可利用降藻微生物合成的天然復(fù)合酶系深度降解海帶生物質(zhì)，從而高效制取海帶汁。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株具有海帶降解活性的海帶降解菌株。本發(fā)明涉及的菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，分類(lèi)命名為細(xì)a
菌株名為ZJU HZ22,保藏號(hào)為CGMCC N0.5324，保藏日期為2011年10月14日。該菌株分離自東海舟山海域的表層海水及浮游海藻樣品，分離過(guò)程如下:首先通過(guò)搖瓶水平的定向培養(yǎng)從樣品中富集具有降藻活性的菌群，進(jìn)而通過(guò)平板分離獲得純培養(yǎng)菌株，最后再通過(guò)搖瓶水平的定向篩選和馴化獲取目標(biāo)菌株。最終選育所得的菌株以alginolytica ZJU HZ22 (CGMCC N0.5324)為代表，其能夠在7.5升發(fā)酵罐水平穩(wěn)定地合成胞外復(fù)合酶，并通過(guò)酶解作用深度降解海帶。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由所述菌株制備海帶汁的方法，即以粗制海帶塊為原料，利用菌株主導(dǎo)的生物降解作用直接消解藻體結(jié)構(gòu)，獲取海帶汁。通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn):
(1)原料預(yù)處理:普通干海帶，適當(dāng)浸泡清洗后切塊(約1.5 cmX 1.5 cm)、烘干；
(2)菌株種子液制備:培養(yǎng)基為含10g/Ι干海帶塊的降解培養(yǎng)基，裝液量200 ml/250ml，接種后28°C，120 rpm條件下培養(yǎng)4天左右，可通過(guò)海帶塊的降解程度來(lái)判斷種子液是否成熟；
(3)海帶汁制取:在7.5 L發(fā)酵罐中加入4.5 L降解培養(yǎng)基，另加干海帶塊40 g，聚醚(消泡劑)2.5 ml，121°C，20 min滅菌。充分冷卻后按1%接種量接種，連接控制系統(tǒng)后，自動(dòng)控制參數(shù)分別設(shè)定為:溫度28°C，攪拌轉(zhuǎn)速300 rpm,通氣量2.5 LPM,持續(xù)培養(yǎng)100小時(shí)以上。發(fā)酵液經(jīng)10000 rpmX15 min離心去除菌體和少量海帶殘?jiān)?，所得上清液即海帶汁?br> [0007]步驟(2) (3)中所述的降解培養(yǎng)基配方為:氯化鈉7.8 g，七水合硫酸鎂8.2 g，氯化鉀0.5 g，氯化鈣0.97 g，酵母抽提物0.1 g，去離子水1000 ml (無(wú)需調(diào)pH)。
[0008]上述方法是以菌株T1aWaft3ZJU HZ22 (CGMCC N0.5324)直接降解海帶塊。該方法的原理是利用微生物的體外降解作用實(shí)現(xiàn)海帶藻體的溶解以及海帶大分子營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的水解，即在以海帶塊為單一碳源和能源物質(zhì)的培養(yǎng)體系中，微生物出于自身生長(zhǎng)的需要而大量合成具有針對(duì)性的胞外降解酶系，目的是將具有天然結(jié)構(gòu)的海帶生物質(zhì)(以海藻多糖為主)降解成能夠跨膜的小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(以海藻寡糖和單糖為主)，這一過(guò)程中，除了其自身吸收利用以外，通常會(huì)在培養(yǎng)液中囤積多余的降解產(chǎn)物。因此，在微生物制取工藝中，菌株生長(zhǎng)，降解酶活性以及海帶降解程度之間存在著兩兩的耦合關(guān)系，分別以圖2-4中的耦合曲線(xiàn)表征，其中，以0D_值代表細(xì)胞生物量，以褐藻膠裂解酶代表胞外復(fù)合酶系，以還原糖濃度代表海帶降解程度。由圖中曲線(xiàn)可以看出，在菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期(8-50小時(shí))，由于對(duì)小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求旺盛，因此，由菌體主導(dǎo)的降解作用十分活躍，具體表現(xiàn)為褐藻膠裂解酶活性及還原糖濃度均呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)。至生長(zhǎng)穩(wěn)定期時(shí)(50-105小時(shí))，細(xì)胞的增殖速度下降，凋零速度增加，同時(shí)，細(xì)胞主動(dòng)分泌的降解酶減少，而由于死亡細(xì)胞的溶解作用，被釋放的胞內(nèi)降解酶增加，兩者間此消彼長(zhǎng)，不斷變化，使得生物量及酶活均相應(yīng)地呈現(xiàn)不規(guī)則的波動(dòng)。此外，由于對(duì)小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求降低，因此，由菌體主導(dǎo)的降解作用減弱，具體表現(xiàn)為還原糖濃度的遞增趨勢(shì)減緩，并逐漸達(dá)到一個(gè)較為穩(wěn)定的值，此即所制取海帶汁中的還原糖終濃，約為初始還原糖濃度(來(lái)自于121 °C，30 min滅菌過(guò)程中的非酶促水解作用)的5-6倍。
[0009]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種由所述菌株所產(chǎn)的胞外復(fù)合酶制備海帶汁的方法，是以細(xì)制海帶粉為原料，利用復(fù)合酶催化的生物降解反應(yīng)進(jìn)一步消解藻體結(jié)構(gòu)，獲取海帶汁。通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn):
(O原料預(yù)處理:普通干海帶，適當(dāng)浸泡清洗后烘干，利用高速粉碎機(jī)制備成海帶粉；
(2)酶液制備:酶液發(fā)酵步驟同前一個(gè)方法中的步驟(1)(2) (3)，只是發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)間控制在96小時(shí)左右；發(fā)酵液經(jīng)10000 rpm X 15 min離心后收集上清液，冰浴預(yù)冷后，置于4°C層析柜中的磁力攪拌器上，邊適度攪拌(以不起泡為準(zhǔn))，邊緩慢加入硫酸銨，使其快速、充分地溶解，至硫酸銨飽和后，繼續(xù)攪拌過(guò)夜；上述鹽析液經(jīng)4°C，12000 rpm X 15 min離心后收集沉淀，用適量無(wú)菌的基礎(chǔ)鹽溶液溶解，制備成濃縮的復(fù)合酶液；
(3)海帶汁制取:在7.5 L發(fā)酵罐中加入4.5 L基礎(chǔ)鹽溶液，另加海帶粉40 g，121°C,20 min滅菌，充分冷卻后加入步驟(2)制備的全部濃縮復(fù)合酶液，連接控制系統(tǒng)后，自動(dòng)控制參數(shù)分別設(shè)定為:溫度28°C，攪拌轉(zhuǎn)速80 rpm,持續(xù)溫育70小時(shí)左右。發(fā)酵液經(jīng)10000rpm X 15 min離心去除殘余海帶粉后,所得上清液即海帶汁。
[0010]步驟 (2) (3)中所述的基礎(chǔ)鹽溶液配方為:氯化鈉7.8 g，七水合硫酸鎂8.2 g，氯化鉀0.5 g，氯化鈣0.97 g，去離子水1000 ml (無(wú)需調(diào)pH)。
[0011]上述方法是在無(wú)菌體系中，以來(lái)源于菌株alginolytica ZJU HZ22(CGMCC N0.5324)的胞外復(fù)合酶濃縮液直接對(duì)海帶粉進(jìn)行降解。該方法采用硫酸銨沉淀法濃縮菌株ZJU HZ22發(fā)酵液中的胞外酶，根據(jù)酶活測(cè)定結(jié)果，濃縮酶液具有褐藻膠裂解酶、纖維素酶、淀粉酶以及果膠酶的活性，并以褐藻膠裂解酶的活性最高。同時(shí)，為了提高酶促效率，將海帶塊洗凈、烘干、機(jī)械研磨成粉后加入。同樣以褐藻膠裂解酶代表胞外復(fù)合酶系，以還原糖濃度代表海帶降解程度，參見(jiàn)圖5，前48小時(shí)，反應(yīng)體系中的還原糖濃度呈明顯上升趨勢(shì)，并于此后緩慢趨于平穩(wěn)，至70小時(shí)溫育結(jié)束時(shí)，還原糖濃度約為初始值的4倍。從理論上分析，酶處理體系中的還原糖濃度應(yīng)呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)直至酶完全失活，但圖5中顯示，在溫育52小時(shí)左右時(shí)，體系中的還原糖濃度即達(dá)到最高值，而此時(shí)乃至溫育結(jié)束時(shí)的褐藻膠裂解酶活性均保持在初始水平，并沒(méi)有明顯下降。上述現(xiàn)象說(shuō)明，在實(shí)際反應(yīng)體系中，酶解產(chǎn)物達(dá)到一定濃度時(shí)即對(duì)酶產(chǎn)生反饋抑制作用，從而使體系中的酶解效率降低，還原糖濃度達(dá)到極限值。
[0012]本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供所述菌株在海帶汁生物制取中的應(yīng)用。
[0013]綜上所述，本發(fā)明提供的菌株alginolytica ZJU HZ22 (CGMCC N0.5324)能夠產(chǎn)生具有多種多糖降解活性的胞外復(fù)合酶系，能夠?qū)崿F(xiàn)海帶的深度降解。在此基礎(chǔ)之上，本發(fā)明提供了兩種無(wú)需添加浸提介質(zhì)，也不需加熱保溫輔助的海帶汁制取工藝，即以海帶塊為原料的菌處理工藝和以海帶粉為原料的酶處理工藝，兩者均能在溫和條件下通過(guò)生物降解作用將海帶多糖降解為還原性的寡糖或單糖，同時(shí)達(dá)到脫腥的效果，在國(guó)內(nèi)外尚屬首次報(bào)道。
[0014]本發(fā)明以一株海洋細(xì)菌及其所產(chǎn)生的胞外復(fù)合酶系為技術(shù)核心，通過(guò)生物降解作用制取海帶汁，不僅達(dá)到了去除藻體結(jié)構(gòu)的目的，更使提取液在海帶原有營(yíng)養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加了活性寡糖和可發(fā)酵單糖的成分，提高了原料的綜合利用率和食用品質(zhì)，在進(jìn)一步開(kāi)發(fā)海帶飲品方面具有重大的應(yīng)用潛力和前景。
[0015]本發(fā)明成功選育了降藻菌株CGMCC N0.5324，并將生物技術(shù)引入到了傳統(tǒng)的以物化方法為基礎(chǔ)的海帶汁浸提工藝中，使得浸提深度從傳統(tǒng)的表觀藻體結(jié)構(gòu)的消解加深至大分子結(jié)構(gòu)多糖的降解，獲取的海帶汁在海帶天然營(yíng)養(yǎng)的基礎(chǔ)上增添了活性寡糖和可發(fā)酵單糖的成分，提高了原料的綜合利用率和食用品質(zhì)，為海帶的精深加工提供了技術(shù)支持，在新型海帶飲品的開(kāi)發(fā)方面具有極大的應(yīng)用潛力和前景。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1是菌株CGMCC N0.5324的海帶降解效果圖(A:無(wú)菌空白對(duì)照:B:對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期的海帶殘留；C:對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的海帶殘留；D:穩(wěn)定期的海帶殘留)。
[0017]圖2是菌處理工藝中細(xì)胞生物量和還原糖濃度間的兩兩耦合關(guān)系。
[0018]圖3是菌處理工藝中細(xì)胞生物量和褐藻膠裂解酶間的兩兩耦合關(guān)系。
[0019]圖4是菌處理工藝中還原糖濃度和褐藻膠裂解酶間的兩兩耦合關(guān)系。
[0020]圖5是酶處理工藝中的還原糖濃度以及酶活的變化。
[0021]圖6是兩種生物處理工藝的比較。
【具體實(shí)施方式】
[0022]本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0023]實(shí)施例1 'W^Tamlana alginolytica ZJU HZ22 (CGMCC N0.5324)的選育 菌株分離自2010年8月采集的東海舟山海域的表層海水及浮游海藻樣品。藻體適當(dāng)
研磨后與海水樣品一起加入無(wú)菌搖瓶，同時(shí)補(bǔ)充無(wú)菌的新鮮海帶塊(約1.5 cmX1.5 cm,10塊)以及蛋白胨/酵母抽提物的混合濃縮液(終濃度均為I g/Ι)，于空氣浴搖床(28°C，120 rpm)培養(yǎng)，定時(shí)觀察富集液濁度以及海帶塊的變化。待富集液混濁后，選擇陽(yáng)性搖瓶(即出現(xiàn)海帶塊碎裂或變小現(xiàn)象)，按10%接種量轉(zhuǎn)接寡營(yíng)養(yǎng)2216培養(yǎng)基(含新鮮海帶塊200g/Ι)，于相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，并如上所述連續(xù)傳代，目的是選擇性地富集具有穩(wěn)定降藻活性的菌群。以梯度稀釋涂布法在2216平板上對(duì)上述定向富集液進(jìn)行菌株分離，挑選不同形態(tài)的菌落，分別以劃線(xiàn)法在2216平板上進(jìn)行菌株純化，每株菌經(jīng)16S rDNA分子鑒定后以甘油管以及凍干管形式保藏。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，所獲得的11株菌分別分布在Pseudomonas ,Fla vobac terium ,Microbulbi fer ,Paracoccus, Rhodococcus 和 Tamlana 六個(gè)屬內(nèi)。
[0024]在搖瓶中對(duì)單菌株以及單菌株間的不同組合分別進(jìn)行降解活性的初篩。培養(yǎng)基依然采用含200 g/Ι新鮮海帶塊的寡營(yíng)養(yǎng)2216培養(yǎng)基，各菌株分別以寡營(yíng)養(yǎng)2216培養(yǎng)基(不含海帶)制備種子液，單菌直接按10%接種，組合則將種子液等體積混合后按10%接種，于28°C，120 rpm空氣浴搖床培養(yǎng)。根據(jù)海帶塊降解程度以及降解時(shí)間篩選目標(biāo)菌株或菌群。
[0025]采用含200 g/Ι新鮮海帶塊的降解培養(yǎng)基，對(duì)上述初篩過(guò)程獲得的菌株及菌群進(jìn)行復(fù)篩，同樣根據(jù)海帶塊降解程度以及降解時(shí)間篩選目標(biāo)菌株或菌群。
[0026]最終確定以alginolytica ZJU HZ22為功能菌株進(jìn)行進(jìn)一步的降解工藝研究，其降解效果參見(jiàn)圖1。該菌株已遞交至中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC N0.5324。
[0027]寡營(yíng)養(yǎng)2216培養(yǎng)基包含:蛋白胨I g，酵母抽提物I g，檸檬酸鐵0.1 g,氯化鈉19.45 g,六水合氯化鎂12.6 g,七水合硫酸鎂6.64 g,氯化鈣1.8 g,氯化鉀0.55 g,碳酸氫鈉0.16 g,溴化鉀0.08 g,六水合氯化銀57.00 mg,硼酸22.00 mg,九水合娃酸鈉9.30 mg,氟化鈉2.40 mg,硝酸銨2.40 mg,磷酸氫二鈉8.00 mg,去離子水1000 ml,pH 7.0。
[0028]平板分離采用的常規(guī)2216培養(yǎng)基，即將上述寡營(yíng)養(yǎng)配方中的蛋白胨含量增加至5g/Ι，其余成分不變。
[0029]復(fù)篩采用的低鹽、寡營(yíng)養(yǎng)的降解培養(yǎng)基包含:氯化鈉7.8 g，七水合硫酸鎂8.2 g，氯化鉀0.5 g，氯化鈣0.97 g，酵母抽提物0.1 g，去離子水1000 ml，無(wú)需調(diào)pH。
[0030]實(shí)施例2:菌株ZJU HZ22 (CGMCC N0.5324)的胞外降解酶系分析
分別采用平板定性分析和搖瓶定量分析。
[0031]平板定性分析:以寡營(yíng)養(yǎng)2216培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加1%的海藻酸鈉、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉以及0.2%的果膠制備平板，從2216斜面上刮取適量的新鮮菌泥點(diǎn)種，28°C培養(yǎng)至形成明顯菌苔后進(jìn)行酶活檢測(cè)。其中，淀粉酶采用盧戈氏碘液鋪染，菌苔周?chē)霈F(xiàn)透明圈為陽(yáng)性；纖維素酶和果膠酶均采用0.2%剛果紅溶液鋪染，菌苔周?chē)霈F(xiàn)透明圈為陽(yáng)性；褐藻膠裂解酶采用新鮮配制的2%氯化鈣溶液鋪染，菌苔周?chē)霈F(xiàn)透明圈為陽(yáng)性。
[0032]搖瓶定量分析:以降解培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，按照200 g/Ι添加新鮮海帶塊，在28°C，120 rpm條件下培養(yǎng)至海帶塊無(wú)明顯殘余(4天左右),按10%接種量轉(zhuǎn)接相同培養(yǎng)基，同樣在28°C，120 rpm條件下培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯降解現(xiàn)象時(shí)(海帶塊明顯變小變圓)，離心取上清液，此即為胞外復(fù)合酶的粗酶液。采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測(cè)定酶活，反應(yīng)體系為:1 ml粗酶液+ I ml 0.8%底物溶液(以1/15N KH2P04/Na2HP04緩沖液現(xiàn)配，pH 7.5)混合，于28°C水浴溫育10 11^11，加入1.5 ml DNS試劑混勻后立即放入沸水浴處理10 min,冷卻后加去離子水定容至20 ml，混勻后于540 nm處測(cè)定吸光度。以失活酶液(沸水浴預(yù)處理20 min)作為陰性對(duì)照。每分鐘催化底物降解生成I μ g還原糖所需的酶量定義為I個(gè)酶活力單位(U)。
[0033]結(jié)果表明，平板定性分析中，菌株alginolytica ZJU HZ22 (CGMCC N0.5324)的果膠酶、淀粉酶、纖維素酶均顯示陰性，僅褐藻膠裂解酶為陽(yáng)性。而搖瓶定量分析中，四種酶均能檢測(cè)到酶活，分別為1000-1200 U/ml (褐藻膠裂解酶)，200-400 U/ml (纖維素酶、果膠酶)以及100-200 U/ml (淀粉酶)。
[0034]實(shí)施例3:海帶汁的菌制取工藝
取市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的普通干海帶，適當(dāng)浸泡清洗后切塊(約1.5 cmX1.5 cm)、烘干備用。
[0035]種子培養(yǎng)基為含10 g/Ι干海帶塊的降解培養(yǎng)基，裝液量200 ml/250 ml，28°C，120rpm條件下培養(yǎng)4天左右，可通過(guò)海帶塊的降解程度來(lái)判斷種子液是否成熟。無(wú)明顯海帶塊殘余的種子液按1%接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐。[0036]7.5 L發(fā)酵罐中加入4.5 L降解培養(yǎng)基，另加干海帶塊40 g，聚醚(消泡劑)2.5 ml,121°C，20 min滅菌。充分冷卻后接種，各自動(dòng)控制參數(shù)分別設(shè)定為:溫度28°C，攪拌轉(zhuǎn)速300印111，通氣量2.5 LPM0定時(shí)取樣，測(cè)定OD6tltl，剩余樣品經(jīng)10000 rpmX15 min離心去除菌體和少量海帶殘?jiān)蠹吹煤е?，測(cè)定其糖濃度以及褐藻膠裂解酶酶活等指標(biāo)。
[0037]酶活測(cè)定方法同實(shí)施例2，還原糖測(cè)定采用DNS法，降解液離心后取上清，即得海帶汁，于20 ml定容管中將2 ml海帶汁和1.5 ml DNS試劑混勻后，浸入沸水浴中處理10min，取出冷卻至室溫，并用去離子水定容至20 ml，顛倒混勻后于540 nm下測(cè)定吸光度?？偺菧y(cè)定采用苯酹硫酸法，于20 ml定容管中先后加入2 ml海帶汁以及I ml 9 %的苯酹溶液(提前配制90 %苯酚母液，使用前稀釋至9 %)，立刻快速地加入5 ml濃硫酸，顛倒混勻后室溫放置30 min，使其充分反應(yīng)并冷卻，再用去離子水定容至20 ml，顛倒混勻后冷卻至室溫，于485 nm下測(cè)定吸光度。上述糖濃度的測(cè)定均以降解培養(yǎng)基為空白對(duì)照。
[0038]在上述工藝條件下，目前達(dá)到的工藝指標(biāo)為:菌株alginolytica ZJUHZ22 (CGMCC N0.5324)于50小時(shí)左右達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期，還原糖濃度于75小時(shí)左右達(dá)到最高值，總糖濃度變化較大，總體呈現(xiàn)波動(dòng)上升的趨勢(shì)，所得海帶汁的還原糖濃度約為0.8-1.0 g/Ι，總糖濃度約為3.0-3.5 g/Ι，無(wú)藻腥味。
[0039]實(shí)施例4:菌株ZJU HZ22 (CGMCC N0.5324)胞外復(fù)合酶的發(fā)酵制備
發(fā)酵方法同實(shí)施例3的海帶汁菌制取法，發(fā)酵罐培養(yǎng)至約96小時(shí)時(shí)停止，4.5 L發(fā)酵液經(jīng)10000 rpm X 15 min離心后收集上清液，冰浴預(yù)冷后，置于4°C層析柜中的磁力攪拌器上，邊適度攪拌(以不起泡為準(zhǔn))，邊緩慢加入硫酸銨，使其快速、充分地溶解，至硫酸銨飽和后，繼續(xù)攪拌過(guò)夜。上述鹽析液經(jīng)4°C, 12000 rpm X 15 min離心后收集沉淀,用適量無(wú)菌的基礎(chǔ)鹽溶液溶解，制備成濃縮的復(fù)合酶液，以褐藻膠裂解酶酶活為檢測(cè)指標(biāo)，約為2000-3000 U/mlο
[0040]基礎(chǔ)鹽溶液配方:氯化鈉7.8 g，七水合硫酸鎂8.2 g，氯化鉀0.5 g，氯化鈣0.97g，去離子水1000 ml,無(wú)需調(diào)pH。
[0041]實(shí)施例5:海帶汁的酶制取工藝
取市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的普通干海帶，適當(dāng)浸泡清洗后烘干，利用高速粉碎機(jī)制備海帶粉備用。
[0042]7.5 L發(fā)酵罐中加入4.5 L基礎(chǔ)鹽溶液，另加海帶粉40 g，121°C，20 min滅菌。充分冷卻后加入按實(shí)施例4方法制備的濃縮酶液，各自動(dòng)控制參數(shù)分別設(shè)定為:溫度28°C，攪拌轉(zhuǎn)速80 rpm (保持海帶粉懸浮即可)。定時(shí)取樣,經(jīng)10000 rpmX 15 min離心去除殘余海帶粉后即得海帶汁，測(cè)定其糖濃度以及褐藻膠裂解酶酶活等指標(biāo)，具體方法同實(shí)施例3。
[0043]在上述工藝條件下，目前達(dá)到的工藝指標(biāo)為:發(fā)酵罐溫育50小時(shí)左右還原糖濃度接近或達(dá)到峰值，同時(shí)，酶活沒(méi)有明顯下降的趨勢(shì)，所得海帶汁的還原糖濃度約為0.8-1.2g/Ι，總糖濃度約為3.6-3.9 g/Ι,無(wú)明顯藻腥味。
[0044]實(shí)施例6:兩種制取工藝的論證和比較
采用實(shí)施例3的工藝方法，僅把原料由海帶塊變?yōu)楹Х郏瑫r(shí)分別接種和不接種菌株CGMCC N0.5324進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，前者對(duì)應(yīng)的是海帶粉的菌降解工藝，而后者對(duì)應(yīng)的則是無(wú)任何生物降解作用的空白對(duì)照，結(jié)合實(shí)施例5所述的海帶粉的酶降解工藝進(jìn)行橫向比較，結(jié)果如圖6所示。首先，空白對(duì)照溫育至36小時(shí)時(shí)，體系中的還原糖濃度依然停留在本底水平(0.11 g/Ι,主要來(lái)自于121°C,30 min滅菌過(guò)程中的非酶促水解作用),而同一時(shí)間的菌降解液中，還原糖濃度已達(dá)到峰值(約0.24 g/Ι)，酶降解液中的還原糖濃度則仍然處于上升階段(約0.75 g/Ι)，由此可以論證兩種生物處理工藝的有效性。其次，當(dāng)均以海帶粉為原料時(shí)，無(wú)論采用菌處理，還是酶處理，所制取的海帶汁中的還原糖濃度均呈現(xiàn)相近的變化規(guī)律，即上升至最高值后保持穩(wěn)定，而兩者間最大的差異在于，酶處理工藝的還原糖得率約為菌處理工藝的4倍，其中的主要原因在于，菌在降解底物的同時(shí)會(huì)消耗降解產(chǎn)物以滿(mǎn)足自身生長(zhǎng)代謝的需要。[0045]此外，就菌降解工藝而言，原料的預(yù)處理對(duì)于還原糖得率有較大影響。當(dāng)用海帶塊為原料時(shí)(圖2或4)，所獲得的還原糖濃度要明顯高于以海帶粉為原料(圖6)。其中的原因可能在于，相較于海帶粉，海帶塊不僅比表面積小，而且保持了更為完整的藻體結(jié)構(gòu)，這些不利因素造成了菌株的降解難度增加，因而促使其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增長(zhǎng)，并在生長(zhǎng)過(guò)程中合成過(guò)量的胞外降解酶系，使得培養(yǎng)液中還原糖的囤積效果更為明顯，當(dāng)菌株進(jìn)入穩(wěn)定期后就會(huì)在培養(yǎng)液中殘余更多的還原糖。
[0046]基于上述研究結(jié)果，本發(fā)明確定了兩種有效的海帶汁生物制取方法:即以海帶塊為原料的菌處理方法以及以海帶粉為原料的酶處理方法，兩者在7.5 L發(fā)酵罐中的還原糖得率基本相當(dāng)(圖2或4及圖5)。
【權(quán)利要求】
1.一種具有海帶降解活性的海帶降解菌株，所述菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，分類(lèi)命名為菌株名為ZJU HZ22,保藏號(hào)為CGMCC N0.5324，保藏日期為2011年10月14日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有海帶降解活性的海帶降解菌株制備海帶汁的方法，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn): (O原料預(yù)處理:取普通干海帶，浸泡清洗后切塊、烘干； (2)菌株種子液制備:培養(yǎng)基為含10g/Ι干海帶塊的降解培養(yǎng)基，裝液量200 ml/250ml，接種后28°C，120 rpm條件下培養(yǎng)4天，通過(guò)海帶塊的降解程度判斷種子液是否成熟； (3)海帶汁制取:在7.5 L發(fā)酵罐中加入4.5 L降解培養(yǎng)基，另加干海帶塊40 g，聚醚2.5 ml，12rC，20 min滅菌，充分冷卻后按1%接種量接種，連接控制系統(tǒng)后，自動(dòng)控制參數(shù)分別設(shè)定為:溫度28°C，攪拌轉(zhuǎn)速300 rpm，通氣量2.5 LPM，持續(xù)培養(yǎng)100小時(shí)以上，發(fā)酵液經(jīng)10000 rpmX15 min離心去除菌體和少量海帶殘?jiān)?，所得上清液即海帶汁? 步驟(2) (3)中所述的降解培養(yǎng)基配方為:氯化鈉7.8 g，七水合硫酸鎂8.2 g，氯化鉀0.5 g，氯化鈣0.97 g，酵母抽提物0.1 g，去離子水1000 ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有海帶降解活性的海帶降解菌株制備海帶汁的方法，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)原料預(yù)處理:取普通干海帶，適當(dāng)浸泡清洗后烘干，利用高速粉碎機(jī)制備成海帶粉； (2)酶液制備:酶液發(fā)酵步驟同權(quán)利要求1中的步驟(1)(2) (3)，只是發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)間控制在96小時(shí)；發(fā)酵液經(jīng)10000 rpm X 15 min離心后收集上清液，冰浴預(yù)冷后，置于4°C層析柜中的磁力攪拌器上，邊攪拌，邊緩慢加入硫酸銨，使其快速、充分地溶解，至硫酸銨飽和后，繼續(xù)攪拌過(guò)夜；上述鹽析液經(jīng)4°C, 12000 rpm X 15 min離心后收集沉淀,用無(wú)菌的基礎(chǔ)鹽溶液溶解，制備成濃縮的復(fù)合酶液； (3)海帶汁制取:在7.5 L發(fā)酵罐中加入4.5 L基礎(chǔ)鹽溶液，另加海帶粉40 g，121°C，20 min滅菌，充分冷卻后加入步驟(2)制備的全部濃縮復(fù)合酶液，連接控制系統(tǒng)后，自動(dòng)控制參數(shù)分別設(shè)定為:溫度28 °C，攪拌轉(zhuǎn)速80 rpm，持續(xù)溫育70小時(shí)左右，發(fā)酵液經(jīng)10000rpmX 15 min離心去除殘余海帶粉后,所得上清液即海帶汁； 步驟(2) (3)中所述的基礎(chǔ)鹽溶液配方為:氯化鈉7.8 g，七水合硫酸鎂8.2 g，氯化鉀0.5 g,氯化鈣0.97 g,去離子水1000 ml ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有海帶降解活性的海帶降解菌株在海帶汁生物制取中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A23L1/337GK103540540SQ201310065648
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月1日
【發(fā)明者】張心齊, 吳敏, 孫聰 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)