專利名稱：一株具有脫氮除磷雙重能力的反硝化聚磷菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株具有完全反硝化酶系的兼性厭氧反硝化聚磷菌的培養(yǎng)及其應(yīng)用，屬于環(huán)境微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，水環(huán)境污染已成為社會(huì)各界關(guān)注的主要問題。目前國內(nèi)水環(huán)境的主要污染物包括有機(jī)物和總氮、總磷等無機(jī)污染物，其中對水體危害最大的為總氮和總磷，大量的氮磷 進(jìn)入水體會(huì)造成水環(huán)境的急劇惡化，其主要危害在于水體的富營養(yǎng)化，近十年來我國富營養(yǎng)化水體的比例從50%增長到了 55 %，而貧營養(yǎng)化的水體比例由
3.2%減少到0.53%。水體富營養(yǎng)化促使藻類的大量繁殖，藻類在過度繁殖之后，又大量衰敗死亡，為異養(yǎng)微生物的生長提供了豐富的基質(zhì)，好氧微生物的大量繁殖，很快耗盡了水體中的溶解氧，嚴(yán)重影響魚類的生長繁殖；藻類大量繁殖還能造成供水系統(tǒng)癱瘓和自來水水質(zhì)惡化，近年來太湖水華最為典型，其造成了飲用水的短缺；同時(shí)許多藻類還能產(chǎn)生毒素，嚴(yán)重影響了人類健康生活；另外水體的富營養(yǎng)化將加速湖泊的衰亡，促進(jìn)其向沼澤生態(tài)演變。因此，如何高效、經(jīng)濟(jì)的脫氮除磷已經(jīng)成為目前水污染防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究方向。水環(huán)境中的氮磷污染主要因素歸結(jié)為人類社會(huì)活動(dòng)，其主要來源包括城市生活污水、工業(yè)廢水以及農(nóng)業(yè)灌溉殘留廢水等。氮在水體中主要有有機(jī)氮和無機(jī)氮兩種存在形態(tài):有機(jī)氮有蛋白質(zhì)、多膚、氨基酸和尿素等，這一形態(tài)的氮主要來源于生活污水、農(nóng)業(yè)廢棄物(植物秸桿、牲畜糞便等)和某些工業(yè)廢水(如羊毛加工、制革、印染、食品加工等)；無機(jī)氮形態(tài)主要為氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮(統(tǒng)稱氮化合物)，其主要來源為工業(yè)廢水，以及無機(jī)氮之間的形態(tài)轉(zhuǎn)換。磷在水體中存在的主要形態(tài)為磷酸鹽(簡稱磷或總磷)，據(jù)其物理特性分為溶解性和顆粒性兩類，按化學(xué)特性則可分成正磷酸鹽、聚合磷酸鹽和有機(jī)磷酸鹽，其主要來源為生活污水和農(nóng)業(yè)廢水。污水生物脫氮的基本原理就是在將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的基礎(chǔ)上，先利用好氧段經(jīng)硝化作用，由硝化細(xì)菌和亞硝化細(xì)菌的協(xié)同作用，將NH3轉(zhuǎn)化為NO1 和iVR —N。在
缺氧條件下通過反硝化作用將將NO; -N (經(jīng)反亞硝化)和-TV(經(jīng)反硝化)還原為氮
氣，溢出水面釋放到大氣，參與自然界氮的循環(huán)。水中含氮物質(zhì)大量減少，降低出水的潛在危險(xiǎn)性，達(dá)到從廢水中脫氮的目的。廢水在生物處理中，在厭氧條件下，聚磷菌的生長受到抑制，為了自身的生長便釋放出其細(xì)胞中的聚磷酸鹽，同時(shí)產(chǎn)生利用廢水中簡單的溶解性有機(jī)基質(zhì)所需的能量，稱該過程為磷的釋放。進(jìn)入好氧環(huán)境后，活力得到充分恢復(fù)，在充分利用基質(zhì)的同時(shí)，從廢水中攝取大量溶解態(tài)的正磷酸鹽，從而完成聚磷的過程。將這些攝取大量磷的微生物從廢水中去除，即可達(dá)到除磷的目的。由于聚磷菌和反硝化細(xì)菌對有機(jī)碳源的競爭，目前很多脫氮除磷工藝不能同時(shí)達(dá)到脫氮與除磷的最佳效果，為此，許多研究者開發(fā)了各種新材料、新技術(shù)、新設(shè)備，衍生出許多新的生物脫氮除磷工藝以期同時(shí)實(shí)現(xiàn)最大程度的脫氮與除磷，然而始終不能從根本上解決這一難題。因此，要同時(shí)實(shí)現(xiàn)脫氮與除磷的最佳效果，必須轉(zhuǎn)變思路，不僅只是從研發(fā)工藝以及調(diào)整運(yùn)行參數(shù)等方面研究，還必須從微生物學(xué)的角度研究探討生物脫氮除磷的機(jī)理和效能。目前已有研究者發(fā)現(xiàn)了具有同時(shí)脫氮與除磷效能的微生物菌群，統(tǒng)稱為反硝化聚磷菌(DPB)，確定了這是一類能夠在厭氧條件下，分解體內(nèi)聚磷，并吸收易降解有機(jī)物以聚-￠-羥丁酸(PHB)形式儲(chǔ)存在菌體內(nèi)，在缺氧條件下，分解體內(nèi)PHB，并以硝酸鹽氮為電子受體進(jìn)行攝磷的微生物菌群，利用DPB的生物特性，成功地解決了傳統(tǒng)生物脫氮除磷工藝中脫氮菌與聚磷菌競爭碳源的問題。然而此類菌及其特性研究都處于初級階段，沒有系統(tǒng)的鑒定方法，也沒有方便快捷的培養(yǎng)馴化方式。探明反硝化聚磷細(xì)菌的種屬及特性，明確它們的營養(yǎng)條件和環(huán)境條件，將有助于廢水生物脫氮除磷工藝的研究、開發(fā)和應(yīng)用。細(xì)菌的反硝化聚磷作用是在各種還原酶的催化作用下完成的，各反應(yīng)酶系的活性高低受溫度、PH值等條件的影響。廢水生物處理中的反應(yīng)溫度，對微生物的生長、繁殖關(guān)系密切，溫度支配著酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、微生物生長速度以及化合物的溶解度等，因而對污染物的降解轉(zhuǎn)化起著關(guān)鍵作用?？疾鞙囟?、PH比等因素對反硝化菌株發(fā)揮高效反硝化活性的影響，進(jìn)而獲得高效反硝化聚磷菌株，實(shí)現(xiàn)廢水高效經(jīng)濟(jì)的脫氮除磷，對解決日益嚴(yán)重的水環(huán)境氮磷污染問題具有重要意義。許多細(xì)菌具有將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的酶，可實(shí)現(xiàn)第一步轉(zhuǎn)化，但要完成徹底脫氮，則要求細(xì)菌必須具有完整的反硝化酶系。探明反硝化聚磷細(xì)菌是否具有完整又高效的反硝化酶系是采用生物反硝化工藝脫氮除磷的先決條件。研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明細(xì)菌具有完整的反硝化酶系，能高效去除水體中的氮素，將硝態(tài)氮還原為氮?dú)馀懦鏊w，實(shí)現(xiàn)廢水的高效脫氮除磷，為解決日益嚴(yán)重的含氮磷廢水對環(huán)境的污染問題作出貢獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上問題，本 發(fā)明的目的是提供一株具有完整反硝化酶系的高效兼性厭氧反硝化聚磷細(xì)菌。該細(xì)菌具有完全的反硝化酶系，能夠徹底脫除水體中的氮磷的同時(shí)，不產(chǎn)生
NO、N2O等有害氣體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該反硝化聚磷菌的應(yīng)用及應(yīng)用方法，使該細(xì)菌表現(xiàn)出完全的反硝化除磷活性。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一株具有脫氮除磷雙重能力的反硝化聚磷菌，該菌株命名為假產(chǎn)堿假單胞菌CL-1, Pseudomonas pseudoalcaligenes CL-1,屬于假產(chǎn)喊假單胞菌，已于 2012 年 6 月 13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO:M2012225，保藏地址:中國武漢武漢大學(xué)。其菌學(xué)特征為:細(xì)胞呈短桿狀，革蘭氏陽性菌，菌落圓形、乳白色、中凸、有光澤、邊緣光滑透明。其最佳脫氮條件為:溫度25 30°C，pH7.0 8.0。在此條件下脫氮，無亞硝酸鹽積累。具有脫氮除磷雙重能力的反硝化聚磷菌在廢水處理中的應(yīng)用。具體應(yīng)用時(shí)，方法為:(I)使用前用LB培養(yǎng)基活化菌株:將斜面培養(yǎng)基上保存的假單胞菌CL-1用接種環(huán)刮取I環(huán)菌苔，接種入裝有IOOmL LB培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30°C搖床震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)12h，即可獲得菌液(OD6tltl=L 0 + 0.01)；(2)將活化后的菌液接種于待處理的含氮磷廢水中，投加量為受處理廢水體積的10%，pH值范圍在7.0 9.0之間，室溫靜置培養(yǎng)192h以上。前24h每隔8h取樣一次，之后每隔24h定時(shí)取樣檢測水樣中硝氮、總磷去除情況及亞硝酸鹽的積累情況。檢測方法TP:鑰酸鹽-紫外分光光度法；NO3--N:紫外分光光度法；本發(fā)明的菌株是利用雙泥法SBR對氧化溝活性污泥進(jìn)行培養(yǎng)馴化，篩選得到的一種具有高效脫氮除磷活性的反硝化聚磷細(xì)菌，可以通過反硝化作用脫除水體中的亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮，同時(shí)分解體內(nèi)聚磷，并吸收易降解有機(jī)物以PHB形式儲(chǔ)存在菌體內(nèi)，在缺氧條件下，分解體內(nèi)PHB，并以硝酸鹽氮為電子受體進(jìn)行攝磷。該菌株具有完全的反硝化能力，能夠?qū)⑾鯌B(tài)氮逐步還原為氮?dú)馀懦鏊w，適用于較高濃度亞硝酸鹽或硝酸鹽廢水的處理。使用該菌株處理廢水工藝簡單，脫氮徹底，效果穩(wěn)定，節(jié)約運(yùn)行成本。本發(fā)明中的脫氮是指水體中無機(jī)氮的去除，無機(jī)氮是指NO3--N和Ν02--Ν。本發(fā)明的菌株具有以下優(yōu)點(diǎn):( I)本發(fā)明菌株具有完全的反硝化酶系，能夠?qū)⑾鯌B(tài)氮直接還原為氮?dú)?，?shí)現(xiàn)徹底脫氮且不污染空氣。(2)本發(fā)明菌株具 有非常高的反硝化活性，可用于處理適用于較高濃度亞硝酸鹽或硝酸鹽廢水的處理。(3)本發(fā)明菌株具有非常高的除磷活性，可用于處理適用于較高濃度含磷廢水的處理。


圖1:假單胞菌CL-1菌體的掃描電鏡照片。圖2:假單胞菌CL-1的生長曲線。圖3:假單胞菌CL-1的脫氮除磷曲線。圖4:假單胞菌CL-1的脫氮除磷效率與溫度變化關(guān)系。圖5:假單胞菌CL-1的脫氮除磷曲線與pH變化關(guān)系。圖6:假單胞菌CL-1的產(chǎn)氣圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明菌株的分離鑒定:(I)培養(yǎng)基:A、菌株分離、純化、保藏培養(yǎng)基(/L):CH3COONa, 2g ;蛋白胨，15g ;酵母膏，3g ;葡萄糖，Ig ；NaCl,6g ；瓊脂，12g ；ΚΝ03,
1.5g ；pH 控制在 7.0 7.2。B、菌株篩選、脫氮培養(yǎng)基(DM:Denitrifying Medium) (/L):CH3COONa, 2g ；KH2PO4,0.4g ；MgS04.7H20, 0.6g ；CaCl2.2H20,0.07g ；KN03, Ig ；Tris緩沖液12mL ;微量元素2mL ；pH控制在7.0 7.2。C、LB 培養(yǎng)基(/L):蛋白胨，IOg ;酵母膏，5g ;氯化鈉，IOg ；pH控制在7.5。(2)假單胞菌CL-1菌株的分離、純化:采用稀釋涂布法和平板劃線法進(jìn)行分離純化。首先用無菌移液管取SBR缺氧結(jié)束時(shí)的污泥混合液IOmL,置于裝有數(shù)粒玻璃珠的無菌三角瓶中，加入無菌水90mL,制成KT1濃度的菌懸液，在磁力攪拌器上攪拌20min打散菌膠團(tuán)。用移液槍分別吸取0.5ml樣品于裝有4.5mL無菌水的試管中，混勻，依此類推，最后吸取稀釋度為10_4的稀釋液，以每塊平板0.2mL的量，涂布四塊專性培養(yǎng)基，用無菌三角玻璃刮刀在培養(yǎng)基表面均勻涂布。之后將平板倒置，放入30°C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)至長出明顯菌落。挑取單菌株，在平板上多次劃線純化，直至顯微鏡下觀察顯示無雜菌為止，此時(shí)可認(rèn)為菌株已純化完畢。分離出的菌株在含有硝酸鹽的固體培養(yǎng)基上生長良好，具有潛在的反硝化特性，異染顆粒染色后菌體內(nèi)有黑色物質(zhì)的即本發(fā)明中的假單胞菌CL-1，接種至斜面培養(yǎng)基保存?zhèn)溆谩?3)假單胞菌CL-1的硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)為了解本發(fā)明菌株的反硝化能力和特性，對本發(fā)明菌株進(jìn)行硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)。接種于小試管(規(guī)格:15mmX 100mm)中加入IOmL滅菌的反硝化液體培養(yǎng)基，用接種環(huán)挑取純化后的菌落 I環(huán)至小試管中，攪拌混勻。之后加入ImL的滅菌后的液體石蠟封口。以未接種菌株的試管作為空白對照。制作完畢后將所有試管一同置入30°C恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察發(fā)現(xiàn)石蠟與培養(yǎng)基之間有氣泡生成，證明本發(fā)明菌株具有反硝化能力。(4)假單胞菌CL-1的菌落形態(tài)特征:在培養(yǎng)基A上培養(yǎng)2天后，長出圓形菌落、乳白色、中凸、有光澤、邊緣光滑透明。(5)假單胞菌CL-1的菌體形態(tài)特征:掃描電鏡觀察表明菌體呈短桿狀，182nm 260nmX 1145nm 1458nm。(6) 16S rDNA 的 PCR 擴(kuò)增與測序:實(shí)驗(yàn)儀器:小型離心機(jī)(Eppendorf,轉(zhuǎn)速>12000r/min);電泳儀(北京六一儀器廠)；PCR熱循環(huán)擴(kuò)增儀(Eppendorf);凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。實(shí)驗(yàn)方法:從菌株CL-1的新鮮斜面上直接挑取菌體，加入至含100 μ L雙蒸水的離心管中，旋渦混勻后，熱裂解菌懸液，以基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rDNA，擴(kuò)增引物為一對通用引物。正向引物為27F:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；反向引物為1492R:5’ -GGTTACCTTGTTA CGACTT-3’。PCR反應(yīng)在50yL體系中進(jìn)行。反應(yīng)體系的組成為:模板DNA (50ng/μ L) 2 μ L ;dNTP混合物4μ L ；Taq DNA聚合酶0.25 μ L ;正向引物2 μ L ;反向引物2 μ L ;雙蒸水34.75 μ L0PCR 擴(kuò)增條件:95°C變性 5min ；95°C 30s，55°C 45s，72°C lmin30s，循環(huán) 30 次；72°C延伸10min，4°C保存。用1%的瓊脂糖凝膠對菌株的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物做電泳檢測，驗(yàn)證后切下膠條，用DNA凝膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)純化PCR產(chǎn)物?；厥蘸蟮腜CR擴(kuò)增產(chǎn)物委托山東省農(nóng)科院高新技術(shù)中心進(jìn)行測序。(7) 16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析:測序后得到CL-1菌株的16S rDNA長度為1430bp的序列，提交到Genbank與其他菌株進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)菌株CL-1與Pseudomonas sp.的進(jìn)化距離最為接近,確定其屬于假單胞菌屬，命名為 Pseudomonas sp.CL-1。實(shí)施例2本發(fā)明菌株的培養(yǎng)(1)所使用的培養(yǎng)基A、菌株保藏培養(yǎng)基(/L):蛋白胨，5g ;酵母膏，3g ;葡萄糖，Ig ；NaCl,6g ;瓊脂，12g ；KNO3,1.5g ；pH 控制在 7.0 7.2。B、菌株反硝化培養(yǎng)基(DM:Denitrifying Medium) (/L):CH3COONa，2g ;KH2PO4,0.4g ；MgS04.7H20，0.6g ；CaCl2.2H20，0.07g ；KN03, Ig ；Tris 緩沖液 12mL ;微量元素 2mL ；pH控制在7.0 7.2。上述培養(yǎng)基使用前，121 °C，滅菌20分鐘。(2)培養(yǎng)條件將在保藏培養(yǎng)基斜面上保存的假單胞菌CL-1用接種環(huán)刮取I環(huán)菌苔，接種入裝有IOOmL已滅菌的LB培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30°C恒溫振蕩培養(yǎng)12h，即可獲得種子液。實(shí)驗(yàn)時(shí)，按10%的接種量將種子液接種于反硝化培養(yǎng)基或是廢水中。實(shí)施例3本發(fā)明菌株的最佳脫氮除磷條件將IOOmL已滅菌的反硝化培養(yǎng)基裝入250mL三角瓶中，按照10%的接種量接入種子菌液，靜置培養(yǎng)。其最佳脫氮溫度在25-30°C之間，最適溫度是25°C，最適pH值為7 8。該菌的生長周期長，48h以后進(jìn)入對數(shù)生長期，96h以后進(jìn)入穩(wěn)定期，96 120h基本處于穩(wěn)定期，120h后進(jìn)入衰亡期。該菌株前24h氮磷去除率分別為56.93%、43.56%，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程氮磷去除率分別為75.6%和57.5%。實(shí)施例4本發(fā)明菌株具有完全的反硝化酶系在IL的三角瓶中裝滿接種了 10%種子液的反硝化培養(yǎng)基，密封瓶口，室溫下靜置培養(yǎng)。用氣體收集袋收集實(shí)驗(yàn)過程中釋放的氣體，然后通過氣象色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀(GC-MS)分析氣體成分。結(jié)果顯示該氣體分子量為28，且與氮?dú)獾南嗨贫茸罡?，推斷該氣體為N2，無其他氣體。證明本發(fā)明菌株具有完全的反硝化酶系，能夠?qū)⑾鯌B(tài)氮直接還原為N2,能夠發(fā)揮完全的反硝化活性，沒有NO、N2O等有毒有害中間產(chǎn)物氣體的生成。因此，本菌株更適宜于工程應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一株具有脫氮除磷雙重能力的反硝化聚磷菌，其特征在于:該菌株命名為Pseudomonas sp.CL-1,屬于假單胞菌屬，已于2012年6月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為:CCTCCM2012225。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有脫氮除磷雙重能力的反硝化聚磷菌，其特征在于:該菌株菌學(xué)特征為細(xì)胞呈短桿狀，革蘭氏陽性菌，菌落圓形、乳白色、菌落中凸、有光澤、邊緣光滑透明。
3.權(quán)利要求1所述的具有脫氮除磷雙重能力的反硝化聚磷菌在廢水處理中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的具有脫氮除磷雙重能力的反硝化聚磷菌在廢水處理中的應(yīng)用方法，其特征是，包括步驟如下: (1)使用前用LB培養(yǎng)基活化菌株:將斜面培養(yǎng)基上保存的上述假單胞菌CL-1用接種環(huán)刮取I環(huán)菌苔，接種入裝有IOOmL LB培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30°C搖床震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)12h，即可獲得菌液，OD600=L 0±0.01 ； (2)將活化后的菌液接種于待處理的含氮磷廢水中，投加量為受處理廢水體積的10%，pH值范圍在7.0 9.0之間， 室溫靜置192h以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株具有脫氮除磷雙重能力的反硝化聚磷菌及其應(yīng)用，該菌株命名為假產(chǎn)堿假單胞菌CL-1，Pseudomonas pseudoalcaligenes CL-1，屬于假產(chǎn)堿假單胞菌，已于2012年6月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NOM2012225。該菌株為革蘭氏陽性，短桿菌，菌落圓形乳白色、中凸、有光澤、邊緣光滑透明。該菌生長周期長，前24h氮磷去除率分別為56.93%、43.56%，整個(gè)生長周期氮磷去除率分別為75.6%和57.5%。該菌株具有完全的反硝化能力，能將硝氮、亞硝氮等無機(jī)氮直接還原為無害的氮?dú)馀懦鏊w。使用其處理含氮磷廢水工藝簡單，處理效果高效穩(wěn)定，節(jié)約運(yùn)行成本，且不產(chǎn)生NO、N2O等溫室氣體，不造成空氣污染。
文檔編號C12R1/38GK103114062SQ201310032730
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者裴海燕, 孟盼盼, 胡文容, 邵媛媛, 李政 申請人:山東大學(xué)