專利名稱：一種分離乳酸桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種分離乳酸桿菌的方法，方法易行，操作簡(jiǎn)便，不需常規(guī)分離方法中的厭氧設(shè)備。
背景技術(shù)：
乳酸桿菌屬于乳酸桿菌科，拉丁學(xué)名為L(zhǎng)actobacillus，是指能使糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌，其存在廣泛，嗜酸，最適合PH5. 5 6，在無(wú)芽胞桿菌中其耐酸力最強(qiáng)，細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，不運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)芽孢；腸道乳酸桿菌可分解糖產(chǎn)酸，抑制致病菌及腐敗菌的繁殖，具有維護(hù)人體和動(dòng)物健康和調(diào)節(jié)免疫的功能。中國(guó)農(nóng)業(yè)部已經(jīng)批準(zhǔn)乳酸桿菌可以作為飼料添加劑中的微生物菌種用于飼料和養(yǎng)殖業(yè)中?，F(xiàn)有技術(shù)中，一般常規(guī)分離乳酸桿菌的方法需要厭氧設(shè)備，比如厭氧操作臺(tái)，厭氧罐等，但在很多地方，特別是企業(yè)，由于條件限制而沒(méi)有這些設(shè)備；同時(shí)，乳酸桿菌離開(kāi)機(jī)體后很快就會(huì)死亡，如果樣品采集地點(diǎn)離乳酸桿菌分離地點(diǎn)很遠(yuǎn)，那么樣品中的乳酸桿菌在運(yùn)送過(guò)程中就可能已經(jīng)死亡，現(xiàn)有技術(shù)不能把儀器設(shè)備運(yùn)到樣品采集地點(diǎn)進(jìn)行乳酸桿菌分離，不能解決樣品采集地點(diǎn)和分離地點(diǎn)距離太遠(yuǎn)這個(gè)問(wèn)題。本發(fā)明方法通過(guò)向培養(yǎng)器皿中充入二氧化碳?xì)怏w至培養(yǎng)基中氧氣消耗殆盡，然后用封口膜密封，人為形成一個(gè)厭氧環(huán)境，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法具有良好的優(yōu)勢(shì)，不需要常規(guī)方法所必須的厭氧設(shè)備，同時(shí)能夠在樣品采集地點(diǎn)進(jìn)行乳酸桿菌的分離培養(yǎng)，不需要將樣品帶到實(shí)驗(yàn)室后才能進(jìn)行分離培養(yǎng)，能有效解決實(shí) 踐生產(chǎn)過(guò)程中存在的上述兩個(gè)問(wèn)題。為從樣品中更方便、及時(shí)的篩選出乳酸桿菌(Lactobacillus)，本發(fā)明了公開(kāi)一種分離乳酸桿菌的方法，運(yùn)用該方法成功分離得到了乳酸桿菌，該方法可以用于實(shí)驗(yàn)室乳酸桿菌的分離，同時(shí)適合在樣品采集地點(diǎn)進(jìn)行乳酸桿菌的野外分離，減少工作量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種分離乳酸桿菌的方法，方法易行，操作簡(jiǎn)便，不需常規(guī)分離方法中的厭氧設(shè)備。乳酸桿菌的分離一般需要兩個(gè)條件，一是選擇性培養(yǎng)基，目前通用的乳酸桿菌分離培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基；二是分離過(guò)程中需要一個(gè)相對(duì)厭氧的生長(zhǎng)環(huán)境。本發(fā)明選用MRS乳酸桿菌分離培養(yǎng)基，然后通過(guò)營(yíng)造一個(gè)適合乳酸桿菌生長(zhǎng)的厭氧環(huán)境(現(xiàn)有的方法都需要特定儀器設(shè)備)，從而將乳酸桿菌分離出來(lái)。具體操作如下將配制的MRS固體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH6. 0-6. 6后，裝入100-150毫升培養(yǎng)基于250毫升生理鹽水瓶中，充入二氧化碳?xì)怏w至培養(yǎng)基中氧氣消耗殆盡，用橡膠蓋塞住瓶口，然后用封口膜密封，人為形成一個(gè)厭氧環(huán)境，置于滅菌鍋115°C滅菌13-18分鐘，以45度角傾斜放置，使培養(yǎng)基形成斜面，自然冷卻到培養(yǎng)基凝固，將所要分離的樣品稀釋液用注射器注入生理鹽水瓶中的斜面培養(yǎng)基上，將生理鹽水瓶倒置于生化培養(yǎng)箱中29_31°C恒溫培養(yǎng)46-50小時(shí),乳酸桿菌將在生理鹽水瓶的斜面培養(yǎng)基上被分離出來(lái)。
為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種分離乳酸桿菌的方法，其步驟是將配制的MRS固體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH6. 0-6. 6后，裝入100-150毫升培養(yǎng)基于250毫升生理鹽水瓶中，充入二氧化碳?xì)怏w至培養(yǎng)基中氧氣消耗殆盡，將一細(xì)線的一端置于瓶?jī)?nèi)，另一端置于瓶外，用橡膠蓋塞住瓶口，然后用封口膜密封，置于滅菌鍋115°C滅菌13-18分鐘，拔掉細(xì)線，以45度角傾斜放置，使培養(yǎng)基形成斜面，自然冷卻到培養(yǎng)基凝固；將待分離的樣品用無(wú)菌雙蒸水以體積比1:10混合，渦旋一分鐘后靜置3-6分鐘；移取上清I毫升進(jìn)行10倍倍比稀釋，然后分別取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—5三個(gè)稀釋度各200微升樣品，用注射器注入A步中所制備的裝有固體培養(yǎng)基的250毫升生理鹽水瓶中，用蠟密封好注射過(guò)程中注射器留在生理鹽水瓶上橡膠塞的注射孔，轉(zhuǎn)動(dòng)生理鹽水瓶，使樣品均勻分布在生理鹽水瓶中培養(yǎng)基的斜面上；將生理鹽水瓶倒置于生化培養(yǎng)箱中29_31°C恒溫培養(yǎng)46-50小時(shí),乳酸桿菌將在生理鹽水瓶的斜面培養(yǎng)基上被分離出來(lái)。所述MRS固體培養(yǎng)基為
祖成成份氓!》丨:汾
牛Λ蛋 粉842
Λ肉沂8-12
猜姆設(shè)出斤粉 3-7 葡萄糖18-22
醋酸鈉3-7
檸If酸二鑛1-3
吐溫 800.08- 0.2
酸酸鎂0.48- 0.68
S 酸蜢0.18-0.38
瓊脂粉13-17
蒸溜水800-1200,與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供的分離乳酸桿菌的方法，無(wú)需厭氧培養(yǎng)相關(guān)器皿，也不需要二氧化碳培養(yǎng)箱。通過(guò)將二氧化碳?xì)怏w充入裝有培養(yǎng)基的生理鹽水瓶中，消耗培養(yǎng)基和生理鹽水瓶中的氧氣，構(gòu)建一個(gè)適合乳酸桿菌生長(zhǎng)的厭氧環(huán)境，為乳酸桿菌的分離找到一種簡(jiǎn)單、方便的方法。該方法更方便、及時(shí)，并顯著減少了工作量。


圖1為一種分離乳酸桿菌的方法流程示意圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明的范圍。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述實(shí)施例1 :一種分離乳酸桿菌的方法，其步驟是A. MRS固體培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基配方為牛肉蛋白粉10g、魚(yú)肉汁10g、酵母浸出汁粉5g、葡萄糖20g、醋酸鈉5g、檸檬酸二銨2g、硫酸鎂O. 58g、硫酸錳O. 28g、瓊脂粉15g，加I毫升吐溫80，溶解于蒸溜水1000中，調(diào)節(jié)pH值為6或6. 2或6. 3或6. 4或6. 6后，充入二氧化碳?xì)怏w直至培養(yǎng)基和生理鹽水瓶中的氧氣消耗殆盡，將一細(xì)線的一端置于瓶?jī)?nèi)，另一端置于瓶外，用橡膠蓋塞住瓶口，然后用封口膜密封，置于滅菌鍋115°C滅菌13或14或15或16或17分鐘，與水平面成45度角傾斜放置，自然冷卻直至培養(yǎng)基凝固。B.樣品準(zhǔn)備分別制備羅伊乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri,來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)CGMCC1. 2838，搖瓶培養(yǎng)，菌液濃度為106cfu/ml)、嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus,來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)CGMCC1. 1854，搖瓶培養(yǎng)，菌液濃度為106cfu/ml)、唾液乳酸桿菌(Lactobacillussalivarius,來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)CGMCC1. 0006,搖瓶培養(yǎng)，菌液濃度為106cfu/ml)、非解乳鏈球菌(Streptococcus alactolyticus,來(lái)源于中國(guó)微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)CICC21028搖瓶培養(yǎng)，菌液濃度為IO6Cfu/ml)、大腸桿菌(Escherichia coli,來(lái)源于中國(guó)微生物菌種保藏中心,保藏編號(hào)CAU0786,搖瓶培養(yǎng)，菌液濃度為106cfu/ml)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,來(lái)源于中國(guó)微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)YZU0499，搖瓶培養(yǎng)，菌液濃度為106cfu/ml)、粘膜乳酸桿菌(Lactobacillus mucosae,來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)CGMCC1. 3259)，搖瓶培 養(yǎng)，菌液濃度為106cfu/ml)菌液，各菌液體按體積比等比例混合后，取I毫升細(xì)菌混合樣品，用無(wú)菌雙蒸水以體積比1:10混合，渦旋30秒。C.樣品接種移取I毫升B步中所制備的菌液進(jìn)行10倍倍比稀釋，然后分別取10_4、10' IO-5三個(gè)稀釋度各200微升樣品，用注射器注入生理鹽水瓶中的斜面培養(yǎng)基，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)生理鹽水瓶，使樣品均勻分布在斜面培養(yǎng)基上；D.分離培養(yǎng)用蠟將生理鹽水瓶橡膠蓋上的注射器針孔密封，倒置于生化培養(yǎng)箱中29或30或31°C恒溫培養(yǎng)46或47或48或49或50小時(shí)，在培養(yǎng)基斜面上，出現(xiàn)乳白色、圓形、凸起、邊緣整齊、不透明的菌落，初步判斷為乳酸桿菌，再通過(guò)16S rDNA測(cè)序方法對(duì)生長(zhǎng)出來(lái)的菌落克隆進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，然后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中運(yùn)用BLASTN軟件進(jìn)行序列比對(duì)，對(duì)所分離的乳酸桿菌進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)，挑選36個(gè)細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行了測(cè)序分析，其結(jié)果如表I。結(jié)果顯示，不屬于乳酸菌的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌沒(méi)有生長(zhǎng)，屬于乳酸桿菌的羅伊乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌和粘膜乳酸桿菌都有生長(zhǎng)，屬于乳酸菌但不屬于乳酸桿菌的非解乳鏈球菌也有生長(zhǎng)，表明混合菌液被很好的分離，該方法不但能分離乳酸桿菌，同時(shí)也能分離部分其它的乳酸菌，比如鏈球菌屬中的細(xì)菌。用該方法分離乳酸桿菌，無(wú)需厭氧培養(yǎng)相關(guān)器皿，也不需要二氧化碳培養(yǎng)箱。通過(guò)將二氧化碳?xì)怏w充入裝有培養(yǎng)基的生理鹽水瓶中，消耗培養(yǎng)基和生理鹽水瓶中的氧氣，構(gòu)建一個(gè)適合乳酸桿菌生長(zhǎng)的厭氧環(huán)境，為乳酸桿菌的分離找到一種簡(jiǎn)單、方便的方法。該方法更方便、及時(shí)，且能在野外對(duì)樣品中的乳酸桿菌進(jìn)行分離，并顯著減少了工作量。因此，該方法對(duì)乳酸桿菌的分離，特別是對(duì)乳酸桿菌的野外分離以及在缺乏厭氧菌分離儀器的地方具有重要的指導(dǎo)意義和現(xiàn)實(shí)需求。表 I
權(quán)利要求
1.一種分離乳酸桿菌的方法，其步驟是 將配制的MRS固體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH6. 0-6. 6后，裝入100-150毫升培養(yǎng)基于250毫升生理鹽水瓶中，充入ニ氧化碳?xì)怏w至培養(yǎng)基中氧氣消耗殆盡，將ー細(xì)線的一端置于瓶?jī)?nèi)，另ー端置于瓶外，用橡膠蓋塞住瓶ロ，然后用封ロ膜密封，置于滅菌鍋115で滅菌13-18分鐘，拔掉細(xì)線，以45度角傾斜放置，使培養(yǎng)基形成斜面，自然冷卻到培養(yǎng)基凝固； 將待分離的樣品用無(wú)菌雙蒸水以體積比1:10混合，渦旋一分鐘后靜置3-6分鐘； 移取上清I毫升進(jìn)行10倍倍比稀釋，然后分別取lO'lO'lO—5三個(gè)稀釋度各200微升樣品，用注射器注入A步中所制備的裝有固體培養(yǎng)基的250毫升生理鹽水瓶中，用蠟密封好注射過(guò)程中注射器留在生理鹽水瓶上橡膠塞的注射孔，轉(zhuǎn)動(dòng)生理鹽水瓶，使樣品均勻分布在生理鹽水瓶中培養(yǎng)基的斜面上； 將生理鹽水瓶倒置于生化培養(yǎng)箱中29-3TC恒溫培養(yǎng)46-50小時(shí),乳酸桿菌在生理鹽水瓶的斜面培養(yǎng)基上被分離出來(lái)； 所述MRS固體培養(yǎng)基為 組成成份重量份 牛肉蛋白粉 8-12 魚(yú)肉汁8-12 酵母浸出汁粉 3-7 葡萄糖18-22 醋酸鈉3-7 檸檬酸ニ銨1-3 吐溫 800. 08- 0. 2 硫酸鎂0. 48- 0. 68 硫酸錳0. 18- 0. 38 瓊脂粉13-17 蒸溜水800-1200。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種分離乳酸桿菌的方法，其步驟是A、將MRS固體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH后裝入生理鹽水瓶，充入二氧化碳使培養(yǎng)基中氧氣消耗殆盡，密封，滅菌，45度傾斜放置，培養(yǎng)基形成斜面，自然冷卻；B、將待分離的樣品用無(wú)菌雙蒸水混合，渦旋后靜置；C、移取上清進(jìn)行稀釋，分別取10-3、10-4、10-5三個(gè)稀釋，分別用注射器注入到生理鹽水瓶的斜面上，轉(zhuǎn)動(dòng)生理鹽水瓶，使樣品均勻分布在生理鹽水瓶中的斜面培養(yǎng)基上；D、倒置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，乳酸桿菌將在培養(yǎng)基表面被分離出來(lái)。方法易行，操作簡(jiǎn)便，該方法可以用于實(shí)驗(yàn)室乳酸桿菌的分離，同時(shí)適合在樣品采集地點(diǎn)進(jìn)行乳酸桿菌的野外分離，并顯著減少工作量。
文檔編號(hào)C12R1/225GK103045523SQ20131001000
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月11日
發(fā)明者王升平, 印遇龍, 李麗立, 熊霞, 范覺(jué)鑫, 劉惠知, 周映華, 胡新旭, 高書(shū)峰, 周小玲, 繆東, 舒燕, 曾發(fā)姣 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所