專利名稱：一種水稻OsICE1基因雙元載體及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻OsICEl基因雙元載體及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
植物的生長發(fā)育過程受到各種環(huán)境因素的影響，其中冷害是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素之一。研究表明大量逆境應(yīng)答基因的表達可提聞植物獲得抗逆性的品質(zhì)(Gong et al.，2002)。逆境應(yīng)答基因的克隆和轉(zhuǎn)化是獲得抗逆性植株的主要方式，其中基因載體的構(gòu)建是其中關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一，而雙元載體的構(gòu)建和應(yīng)用為篩選陽性植株，及獲取目的基因的表達產(chǎn)物提供了便利。
ICEl (Inducers of CBF expression)編碼一個 bHLH(basic helix-loop-helix)類型的轉(zhuǎn)錄因子，這個轉(zhuǎn)錄因子在低溫誘導(dǎo)下可以與CBF3啟動子上順式作用元件相互結(jié)合，并激活CBF3的轉(zhuǎn)錄。OsICEl是CBF誘導(dǎo)因子在水稻中的同系物，呈組成性表達。OsICEl不受或很少受冷脅迫誘導(dǎo)，它對冷和鹽脅迫的應(yīng)答是在蛋白質(zhì)水平被誘導(dǎo)的，即主要在翻譯后被調(diào)控。OsICEl是ー個膜相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控冷脅迫誘導(dǎo)的上游轉(zhuǎn)錄因子基因如OsDREBIB和0sHsfA3的表達，從而使水稻適應(yīng)寒冷環(huán)境，OsICEl可能涉及到海藻糖的生物合成途徑(Nakamura et al. , 2011)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明實施例的目的在于提供一種水稻OsICEl基因的應(yīng)用方法。本發(fā)明實施例的目的在于提供一種水稻OsICEl基因的雙元載體，該雙元載體包括 Pub1:1CEl:NOS, Pub1:1CE1-FLAG:NOS，Pub1:1CEl-HA:NOS, Pub1:1CEl-MYC:NOS 與ICEl-antisense 載體。本發(fā)明實施例的另一目的在于提供一種水稻OsICEl基因的應(yīng)用方法，其特征在于，該應(yīng)用方法把構(gòu)建的OsICEl基因的五種表達載體Pub1:1CEl:N0S，Pub1:1CE1-FLAG: NOS，Pub1:1CEl-HA: NOS, Pub1:1CEl-MYC: NOS 和 ICEl-antisense 轉(zhuǎn)入水稻受體材料日本睛中，經(jīng)繁殖傳代，獲得Tl代轉(zhuǎn)基因植株。進ー步，該應(yīng)用方法還包括以下步驟(1)總RNA的提取水稻材料日本睛的種子經(jīng)25%的次氯酸鈉消毒，轉(zhuǎn)入發(fā)芽盒中萌發(fā)，胚芽長至2cm時挑選植株大小一致的水稻植株，移入人工氣候箱中的培養(yǎng)箱內(nèi)生長，營養(yǎng)液為Hogland培養(yǎng)液。姆兩天換一次培養(yǎng)液，到四葉一心期時，稱取0. 2克葉片，在研缽中倒入液氮速凍、研碎，研磨充分后轉(zhuǎn)入1. 5毫升的離心管中，迅速加入I毫升Trizol試劑(購于晶美生物工程有限公司)，40°C下12000g離心lOmin。取上清,加入0. 2毫升的氯仿，蕩后放置2-3min。40°C下12000g離心15min,吸上層水相至新1. 5ml離心管中。加0. 5ml氯仿,劇烈振蕩后放置2_3min ;40°C下12000g離心15min,把上層水相轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管中，加入0. 5ml的異丙醇，振蕩后放置IOmin,40°C下12000g離心后棄去上清，沉淀即為RNA。加入Iml 70%こ醇洗滌沉淀，40°C下12000g離心5min，去上清。沉淀干燥后RNA溶于1%。DEPC水中。取I y IRNA溶液，用分光光度計測定總RNA的濃度和純度。(2) cDNA合成取上述提取的RNA樣品5 ii g，加入50 ii molじ1 Oligo dT I yl，再加1%。DEPC水補足lOiil。70°C水浴中5min后，再依次加入Rnase inhibitor 0. 5 yl和5 X RT buffer 5u I, IOmM dNTP 2. 5u I, M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 I ii 1，1%。DEPC 水補足至 25 y I。42°C水浴I h后，再75°C水浴15min終止反應(yīng)，_80°C保存。(3) OsICEl基因cDNA全長的獲得用AtICEl基因(AT3G26744.1)序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中搜索水稻同源基因，獲得與AtICEl相似性為57%的水稻基因序列(編號為0sllg052370)，依據(jù)該同源基因0sllg052370的序列設(shè)計引物，用上述獲得的水稻材料日本睛總cDNA為模板，設(shè)計PCR引物，引物序列為
OsICEl-F: 5’ - CATCTCTGCCATCTCCTTC - 3’OsICEl-R: 5’ - GATAAACTGGTTCAGCAAGC - 3’該PCR引物所擴增的區(qū)段包含完整的OsICEl閱讀框。PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性4min，98°C變性10s，60°C復(fù)性延伸2min，35個循環(huán)后，72°C IOmin0擴增后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，將目的條帶切割，用凝膠回收試劑盒進行產(chǎn)物回收。PCR產(chǎn)物回收后用pUCm-T載體連接。取5 ill連接產(chǎn)物加入大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞中，冰浴10_20min，42°C熱激90秒，冰浴10分鐘，加入500iil LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床上低速(120-150 rpm)搖菌I小吋。取100 ill菌液均勻涂于含有100 u gmじ1安芐的LB固體培養(yǎng)基上生長12h_14h后，挑取陽性菌落進行DNA測序，OsICEl基因的cDNA序列與NCBI NM_001074519序列完全相同；獲得含有目的基因OsICEl cDNA全長序列的重組質(zhì)粒，命名為pICEl。4)表達載體pUb1-1CEl的構(gòu)建根據(jù)水稻OsICEl基因的cDNA序列，設(shè)計PCR引物，其PCR產(chǎn)物包含完整的OsICEl閱讀框，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點BamHI，弓丨物序列為ICEl-F :5 ’ -CTGAGGATCCCATCTCTGCCATCTCCTTC - 3’ BamHIICEl-R :5 ’ -GTCAGGATCCGATAAACTGGTTCAGCAAGC -3’ BamHI用以上獲得的pICEl質(zhì)粒為模板，PCR程序如下94°C預(yù)變性4min，98°C變性10s，60°C復(fù)性延伸2min，35個循環(huán)后，72°C lOmin，擴增的PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將目的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后切膠回收，回收產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHI進行單酶切，同時用BamH I單酶切表達載體質(zhì)粒，然后分別回收酶切過的PCR片段和載體，將載體進行去磷酸化后再次回收；回收后通過T4連接酶將線性化的載體與酶切過的PCR片段在4°C下連接過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，涂在含有卡那霉素50 ii gmじ1的LB固體培養(yǎng)基上生長12h后，挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒經(jīng)BamHI酶切驗證片段大小無誤后，將該菌液進行DNA測序，將含有測序正確克隆的菌液加入等體積30%甘油于_70°C保存，提取陽性克隆質(zhì)粒命名為pUb1-1CEl。最后通過電擊法將pUb1-1CEl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細胞中，涂在含有卡那霉素和鏈霉素均為50 u gmじ1的YEP固體培養(yǎng)基上生長48h后，挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHl酶切驗證無誤后，茵液加入等體積30%甘油于_70°C保存，轉(zhuǎn)基因備用。5)轉(zhuǎn)基因植株的獲得
侵染愈傷組織和共培養(yǎng)取水稻材料日本睛花后15 d的幼胚，用75 %こ醇浸泡I m in，再用25 %的次氯酸鈉浸泡25-30 min,無菌水洗3 -4次，用異物針挑出幼胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。將水稻愈傷組織挑出放入離心管中，取培養(yǎng)好的茵液Iml于1.5ml離心管中，4°C，5000rpm,離心I min,去上清,用含200 u molじ1こ酰丁香酮As的30ml感茵液制成懸浮液，此懸浮液倒入挑好的愈傷組織中，侵染5min，倒掉液體，將愈傷組織取出，置于無茵的含吸水紙的培養(yǎng)皿上浙干30-40min，將愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25°C暗培養(yǎng)60h。洗菌和抗生素篩選培養(yǎng)將愈傷組織從共培養(yǎng)培養(yǎng)基中取出，用無茵水清5次，姆次不停的振蕩5min,再用含500mgじ1羧節(jié)青霉素car的無茵水浸泡40_60min,最后置于無菌濾紙上浙干2h，第一輪篩選將晾干的愈傷組織轉(zhuǎn)入含250mgじ1羧芐青霉素car和50mgじ1潮霉素Hyg的選擇培養(yǎng)基上進行第一次選擇,30°C,光照培養(yǎng)14d ;第二輪篩選將長有抗性愈傷組織的初始愈傷組織轉(zhuǎn)到含25011^171羧芐青霉素car和80mgじ1潮霉素Hyg的選擇培養(yǎng)基上，30°C，光照培養(yǎng)IOd然后轉(zhuǎn)移到組培室中培養(yǎng)4d。
抗性愈傷組織的誘導(dǎo)分化和生根挑取顏色鮮黃的抗性愈傷組織移入分化培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)室，組培室培養(yǎng)條件為24-30°C，14h光/8h暗，待苗長至5cm，放入生根培養(yǎng)基中壯苗。剪取待檢測苗Icm長的新鮮綠色葉片，平放于含潮霉素SOmgI/1培養(yǎng)基上，30°C, 16h/8h光/暗培養(yǎng)48h葉片依舊保持鮮綠的即為陽性植株，而陰性幼苗的葉片出現(xiàn)塊狀壞死，通過潮霉素篩選得到陽性TO植株。TO代種子發(fā)芽后得到Tl代轉(zhuǎn)基因苗，提取轉(zhuǎn)基因Tl代苗不同株系葉片的總 RNA,反轉(zhuǎn)錄總 cDNA,采用引物 F :5 ’ - CGATGAGGACTGGTACTTCG -3 ’，R :5’-GTCCTCGGAGTCGTAGTTGA-3’進行半定量PCR鑒定，結(jié)果具有727bp條帶的，即為得到的穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系。同時，使用CTAB法提取DNA，使用潮霉素引物進行PCR檢測。本發(fā)明實施例的另ー目的在于提供ー種OsICEl轉(zhuǎn)基因水稻T2代植株的抗冷性分析方法，其特征在干，首先，從轉(zhuǎn)基因水稻植株冷脅迫表型方面觀察OsICEl基因?qū)涿{迫的抗性表現(xiàn)；模擬冷脅迫條件，在人工氣候箱內(nèi)用Hogland培養(yǎng)液培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因水稻植株與非轉(zhuǎn)基因水稻植株，待幼苗生長兩周后于6°C下培養(yǎng)四天，觀察到轉(zhuǎn)基因植株C1-T12，C2-T25，C3-T7，C4-T5的長勢優(yōu)于對照植株，表現(xiàn)在植株高度、葉色和根長等性狀；轉(zhuǎn)基因植株C5-T21為OsICEl基因的反義表達載體轉(zhuǎn)化的植株，其植株幼苗在6°C冷脅迫條件下培養(yǎng)四天，對冷脅迫反應(yīng)較敏感。本發(fā)明實施例的另一目的在于公開水稻OsICEl基因抗冷性基因工程應(yīng)用，基因來自水稻，可作為目的基因?qū)胫参?，提高植物的抗冷性，進行植物品種改良。本發(fā)明提供的功能基因的雙元載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物的抗逆性分子育種中具有較廣泛的實踐意義和廣闊的應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明實施例提供的OsICEl基因的載體圖；圖2是本發(fā)明實施例提供的部分轉(zhuǎn)基因水稻的分化苗；圖3是本發(fā)明實施例提供的各種載體的轉(zhuǎn)基因株系；
圖4是是OsICEl轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株(WT)對冷脅迫的耐受表型.WT :非轉(zhuǎn)基因植株，Cl Pub1:1CEl:NOS, C2 Pub1:1CEl -FLAG:NOS, C3 Pub1:1CEl -HA:NOS, C4 Pub1:1CEl -MYC:NOS, C5 ICEl-antisense ；圖5本發(fā)明實施例提供的OsICEl轉(zhuǎn)基因水稻植株在冷脅迫下的的存活率。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進ー步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。冷脅迫通過使植株生長遲緩和不可逆轉(zhuǎn)的損傷，嚴重影響了作物產(chǎn)量。最近，擬南芥中的CBF表達的誘導(dǎo)因子(ICEl)已被鑒定為主要的誘導(dǎo)外源脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子/C-重復(fù)結(jié)合因子調(diào)節(jié)子(DREB/CBF)型的轉(zhuǎn)錄因子參與冷脅迫和滲透壓脅迫下信號的傳導(dǎo)。為了檢測在寒冷條件下，水稻ICE同系物是否通過調(diào)節(jié)水稻DREB的同系物來對冷脅迫的作出反應(yīng)，本發(fā)明實施例鑒定了ー個含有ICE特異基序多肽抗原決定簇。對水稻幼苗的冷脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生ー個分子量大約為55kDa的ICE相關(guān)蛋白。這個蛋白的分子量與預(yù)測的OsICEl的分子量一致。與該蛋白相比，冷脅迫對OsICEl的表達是沒有明顯的影響。半定量RT-PCR表明這個基因可以持續(xù)表達，但是冷脅迫卻持續(xù)上調(diào)OsDREBIB，水稻熱激轉(zhuǎn)錄因子A3 (0sHsfA3)和6-磷酸海藻糖磷酸酶(OsTPPl)的表達。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，OsICEl的功能在冷脅迫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子上游涉及到OsDREBIB和0sHsfA3，從而能適應(yīng)寒冷環(huán)境。本發(fā)明實施例提供的水稻OsICEl基因的克隆及測序方法。cDNA序列見序列表。1、雙元載體的構(gòu)建構(gòu)建了 OsICEl基因的雙元載體，包括Pub1:1CEl:N0S，Pub1:1 CE1-FLAG: NOS, Pub1:1 CE1-HA: NOS, Pub1:1CEl-MYC: NOS ;與 ICEl-antisense 載體。OsICEl基因的載體圖如圖1.(I)總RNA的提取水稻材料日本睛的種子經(jīng)25%的次氯酸鈉消毒，轉(zhuǎn)入發(fā)芽盒中萌發(fā)，胚芽長至2cm時挑選植株大小一致的水稻植株，移入人工氣候箱中的培養(yǎng)箱內(nèi)生長，營養(yǎng)液為Hogland培養(yǎng)液。每兩天換一次培養(yǎng)液，到四葉一心期時，稱取0. 2克葉片，在研缽中倒入液氮速凍、研碎，研磨充分后轉(zhuǎn)入1. 5毫升的離心管中，迅速加入I毫升Trizol試劑(購于晶美生物工程有限公司)，40°C下12000g離心lOmin。取上清，加入0. 2毫升的氯仿，蕩后放置2-3min。40。。下12000g離心15min,吸上層水相至新1. 5ml離心管中。加
0.5ml氯仿,劇烈振蕩后放置2_3min ;40°C下12000g離心15min,把上層水相轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管中，加入0.5ml的異丙醇，振蕩后放置10min，40°C下12000g離心后棄去上清，沉淀即為RNA。加入Iml 70%こ醇洗滌沉淀，40°C下12000g離心5min，去上清。沉淀干燥后RNA溶于1%。DEPC水中。取I ii IRNA溶液，用分光光度計測定總RNA的濃度和純度。
(2) cDNA合成取上述提取的RNA樣品5 ii g，加入50 ii molじ1 Oligo dT I yl，再加1%。DEPC水補足lOiil。70°C水浴中5min后，再依次加入Rnase inhibitor 0. 5 yl和5 X RT buffer 5u I, IOmM dNTP 2. 5u I, M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 I ii 1，1%。DEPC 水補足至 25 y I。42°C水浴I h后，再75°C水浴15min終止反應(yīng)，_80°C保存。(3) OsICEl基因的cDNA全長的獲得用AtICEl基因()序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中捜索水稻同源基因序列，依據(jù)該同源序列設(shè)計引物，用上述獲得的水稻材料日本睛總cDNA為模板，設(shè)計PCR引物，引物序列為OsICEl-F: 5’ - CATCTCTGCCATCTCCTTC - 3’OsICEl-R: 5’ - GATAAACTGGTTCAGCAAGC - 3’該PCR引物所擴增的區(qū)段包含完整的OsICEl閱讀框。PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性4min，98°C變性10s，60°C復(fù)性延伸2min，35個循環(huán)后，72°C IOmin0擴增后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，將目的條帶切割，用凝膠回收試劑盒進行產(chǎn)物回收。PCR產(chǎn)物回收后用pUCm-T載體連接。取5 ill連接產(chǎn)物加入大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞中，冰浴10_20min，42°C熱激90秒，冰浴10分鐘，加入500iil LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床上低速(120-150 rpm)搖菌I小吋。取100 ill菌液均勻涂于含有100 u gmじ1安芐的LB固體培養(yǎng)基上生長12h_14h后，挑取陽性菌落進行DNA測序，OsICEl基因的cDNA序列與NCBI NM_001074519序列完全相同；獲得含有目的基因OsICEl cDNA全長序列的重組質(zhì)粒，命名為pICEl。
4)表達載體pUb1-1CEl的構(gòu)建根據(jù)水稻OsICEl基因的cDNA序列，設(shè)計PCR引物，其PCR產(chǎn)物包含完整的OsICEl閱讀框，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點BamHI，弓丨物序列為ICEl-F :5 ’ -CTGAGGATCCCATCTCTGCCATCTCCTTC - 3’ BamHIICEl-R :5 ’ -GTCAGGATCCGATAAACTGGTTCAGCAAGC -3’ BamHI用以上獲得的pICEl質(zhì)粒為模板，PCR程序如下94°C預(yù)變性4min，98°C變性10s，60°C復(fù)性延伸2min，35個循環(huán)后，72°C lOmin，擴增的PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將目的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后切膠回收，回收產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHI進行單酶切，同時用BamH I單酶切植物表達載體質(zhì)粒，然后分別回收酶切過的PCR片段和載體，將載體進行去磷酸化后再次回收；回收后通過T4連接酶將線性化的載體與酶切過的PCR片段在4°C下連接過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，涂在含有卡那霉素50 y gmじ1的LB固體培養(yǎng)基上生長12h后，挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒經(jīng)BamHI酶切驗證片段大小無誤后，將該菌液進行DNA測序，將含有測序正確克隆的菌液加入等體積30%甘油于_70°C保存，提取陽性克隆質(zhì)粒命名為pUb1-1CEl。最后通過電擊法將pUb1-1CEl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細胞中，涂在含有卡那霉素和鏈霉素均為50 u gmじ1的YEP固體培養(yǎng)基上生長48h后，挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHl酶切驗證無誤后，茵液加入等體積30%甘油于_70°C保存，轉(zhuǎn)基因備用。5)轉(zhuǎn)基因植株的獲得侵染愈傷組織和共培養(yǎng)取水稻材料日本睛花后15 d的幼胚，用75 %こ醇浸泡I m in，再用25 %的次氯酸鈉浸泡25-30 min,無菌水洗3 -4次，用異物針挑出幼胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。將水稻愈傷組織挑出放入離心管中，取培養(yǎng)好的茵液Iml于1.5ml離心管中，4°C，5000rpm,離心I min,去上清,用含200 u molじ1こ酰丁香酮As的30ml感茵液制成懸浮液，此懸浮液倒入挑好的愈傷組織中，侵染5min，倒掉液體，將愈傷組織取出，置于無茵的含吸水紙的培養(yǎng)皿上浙干30-40min，將愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25°C暗培養(yǎng)60h。洗菌和抗生素篩選培養(yǎng)將愈傷組織從共培養(yǎng)培養(yǎng)基中取出，用無茵水清5次，姆次不停的振蕩5min,再用含500mgじ1羧節(jié)青霉素car的無茵水浸泡40_60min,最后置于無菌濾紙上浙干2h，第一輪篩選將晾干的愈傷組織轉(zhuǎn)入含250mgじ1羧芐青霉素car和50mgL_1潮霉素Hyg的選擇培養(yǎng)基上進行第一次選擇,30°C,光照培養(yǎng)14d ;第二輪篩選將長有抗性愈傷組織的初始愈傷組織轉(zhuǎn)到含25011^171羧芐青霉素car和SOmgL—1潮霉素Hyg的選擇培養(yǎng)基上，30°C，光照培養(yǎng)IOd然后轉(zhuǎn)移到組培室中培養(yǎng)4d?？剐杂鷤M織的誘導(dǎo)分化和生根挑取顏色鮮黃的抗性愈傷組織移入分化培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)室，組培室培養(yǎng)條件為24-30°C，14h光/8h暗，待苗長至5cm，放入生根培養(yǎng)基中壯苗。剪取待檢測苗Icm長的新鮮綠色葉片，平放于含潮霉素SOmgI/1培養(yǎng)基上，30°C, 16h/8h光/暗培養(yǎng)48h葉片依舊保持鮮綠的即為陽性植株，而陰性幼苗的葉片出現(xiàn)塊狀壞死，通過潮霉素篩選得到陽性TO植株。TO代種子發(fā)芽后得到Tl代轉(zhuǎn)基因苗，提取轉(zhuǎn)基因Tl代苗不同株系葉片的 總 RNA,反轉(zhuǎn)錄總 cDNA,采用引物 F :5 ’ - CGATGAGGACTGGTACTTCG -3 ’，R :5’-GTCCTCGGAGTCGTAGTTGA-3’進行半定量PCR鑒定，結(jié)果具有727bp條帶的，即為得到的穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系。同時，使用CTAB法提取DNA，使用潮霉素引物進行PCR檢測。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化，A、部分轉(zhuǎn)基因水稻的分化苗，如圖2所示。B、含有不同載體的轉(zhuǎn)基因水稻株系在溫室生長和繁殖，圖3為含有各種載體的轉(zhuǎn)基因株系。2 OsICEl基因轉(zhuǎn)基因水稻植株的陽性轉(zhuǎn)化體的鑒定本項目前期工作中已經(jīng)把構(gòu)建的OsICEl基因的五種表達載體(包括Pub1:1CEl:NOS, Pub1:1CEl -FLAG:NOS，Pub1:1CEl -HA:NOS, Pub1:1CEl -MYC:NOS 和ICEl-antisense)轉(zhuǎn)入水稻受體材料日本晴中，經(jīng)繁殖傳代，獲得Tl代轉(zhuǎn)基因植株。OsICEl轉(zhuǎn)基因株系于校內(nèi)生物科技園正常季節(jié)繁殖、海南加代，目前每個轉(zhuǎn)化體已獲得不同數(shù)目的株系。對獲得的轉(zhuǎn)基因T2代植株部分株系經(jīng)過PCR鑒定，篩選陽性轉(zhuǎn)化體，鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因水稻的株系數(shù)如表I。表1. OsICEl轉(zhuǎn)基因水稻植株的株系數(shù)

權(quán)利要求
1.一種水稻OsICEl基因的雙元載體，該雙元載體包括Pub1:1CEl :N0S， Pub1:1CE1-FLAG:NOS，Pub1:1CEl-HA:NOS, Pub1:1CEl-MYC:NOS 與 ICEl-antisense 載體。
2.一種水稻OsICEl基因雙元載體的應(yīng)用方法，其特征在于，該應(yīng)用方法把構(gòu)建的 OsICEl 基因的五種表達載體Pub1:1CEl:NOS, Pub1:1CE1-FLAG:NOS, Pub1:1CEl-HA:NOS, Pub1:1 CE1-MYCiNOS和ICEl-antisense轉(zhuǎn)入水稻受體材料日本晴中，經(jīng)繁殖傳代，獲得Tl 代轉(zhuǎn)基因植株。
3.如權(quán)利要求2所述水稻OsICEl基因雙元載體的應(yīng)用方法，其特征在于，該應(yīng)用方法還包括以下步驟總RNA的提取方法水稻材料日本晴的種子經(jīng)25%的次氯酸鈉消毒，轉(zhuǎn)入發(fā)芽盒中萌發(fā)，胚芽長至2cm時挑選植株大小一致的水稻植株，移入人工氣候箱中的培養(yǎng)箱內(nèi)生長，營養(yǎng)液為Hogland培養(yǎng)液；每兩天換一次培養(yǎng)液，到四葉一心期時，稱取O. 2克葉片，在研缽中倒入液氮速凍、研碎，研磨充分后轉(zhuǎn)入1. 5毫升的離心管中，迅速加入I毫升Trizol試劑，40°C下12000g離心IOmin ;取上清,加入O. 2毫升的氯仿,蕩后放置2_3min ;40°C下12000g離心15min,吸上層水相至新1. 5ml離心管中；加O. 5ml氯仿,劇烈振蕩后放置2_3min ;40°C下12000g離心 15min,把上層水相轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管中，加入O. 5ml的異丙醇，振蕩后放置IOmin, 40°C下 12000g離心后棄去上清，沉淀即為RNA ;加入Iml 70%乙醇洗滌沉淀，40°C下12000g離心 5min,去上清；沉淀干燥后RNA溶于1%。DEPC水中；取I μ IRNA溶液，用分光光度計測定總 RNA的濃度和純度。
4.如權(quán)利要求2所述水稻OsICEl基因雙元載體的應(yīng)用方法，其特征在于，該應(yīng)用方法還包括以下步驟cDNA合成方法取上述提取的RNA樣品5 μ g，加入50 μ mo 1Γ1 Oligo dT I μ I,再加I %。DEPC水補足 10 μ I ;70 °C 水浴中 5min 后，再依次加入 Rnase inhibitor 0.5y]^P5XRT buffer 5 μ I, IOmM dNTP 2· 5 μ 1，M_MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 I μ 1，1%。DEPC水補足至 25 μ I; 42°C水浴 I h后， 再75°C水浴15min終止反應(yīng)，_80°C保存。
5.如權(quán)利要求2所述水稻OsICEl基因雙元載體的應(yīng)用方法，其特征在于，該應(yīng)用方法還包括以下步驟OsICEl基因cDNA全長的獲得方法用AtICEl基因(AT3G26744.1)序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中搜索水稻同源基因，獲得與 AtICEl相似性為57%的水稻基因序列(編號為0sllg052370)，依據(jù)該同源基因0sllg052370 的序列設(shè)計引物，用上述獲得的水稻材料日本晴總cDNA為模板，設(shè)計PCR引物，引物序列為OsICEl-F: 5’ - CATCTCTGCCATCTCCTTC - 3’OsICEl-R: 5’ - GATAAACTGGTTCAGCAAGC - 3’該PCR引物所擴增的區(qū)段包含完整的OsICEl閱讀框；PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性4min，98°C變性10s，60°C復(fù)性延伸2min，35個循環(huán)后，72°C IOmin ;擴增后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，將目的條帶切割，用凝膠回收試劑盒進行產(chǎn)物回收；PCR產(chǎn)物回收后用 PUCm-T載體連接；取5 μ I連接產(chǎn)物加入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中，冰浴10_20min， 42°C熱激90秒，冰浴10分鐘，加入500 μ I LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床上低速搖菌I小時；取` 100 μ I菌液均勻涂于含有100 μ gmL—1安芐的LB固體培養(yǎng)基上生長12h_14h后，挑取陽性菌落進行DNA測序，OsICEl基因的cDNA序列與NCBI NM_001074519序列完全相同；獲得含有目的基因OsICEl cDNA全長序列的重組質(zhì)粒，命名為pICEl。
6.如權(quán)利要求2所述水稻OsICEl基因雙元載體的應(yīng)用方法，其特征在于，該應(yīng)用方法還包括以下步驟表達載體pUb1-1CEl的構(gòu)建方法根據(jù)水稻OsICEl基因的cDNA序列，設(shè)計PCR引物，其PCR產(chǎn)物包含完整的OsICEl閱讀框，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點BamHI，引物序列為ICEl-F :5 ’ -CTGAGGATCCCATCTCTGCCATCTCCTTC - 3’ BamHIICEl-R :5 ’ -GTCAGGATCCGATAAACTGGTTCAGCAAGC -3’ BamHI用以上獲得的PlCEl質(zhì)粒為模板，PCR程序如下941預(yù)變性41^11，981變性10s，60°C 復(fù)性延伸2min，35個循環(huán)后，72°C IOmin,擴增的PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將目的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后切膠回收，回收產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHI進行單酶切，同時用BamH I單酶切表達載體質(zhì)粒，然后分別回收酶切過的PCR片段和載體，將載體進行去磷酸化后再次回收；回收后通過T4連接酶將線性化的載體與酶切過的PCR片段在 4°C下連接過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，涂在含有卡那霉素50μ gmL—1的LB固體培養(yǎng)基上生長12h后，挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒經(jīng)BamHI酶切驗證片段大小無誤后，將該菌液進行DNA測序，將含有測序正確克隆的菌液加入等體積30%甘油于_70°C保存，提取陽性克隆質(zhì)粒命名為pUb1-1CEl;最后通過電擊法將pUb1-1CEl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細胞中，涂在含有卡那霉素和鏈霉素均為50 μ gmL-1的YEP固體培養(yǎng)基上生長48h后，挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHl酶切驗證無誤后，茵液加入等體積30%甘油于_70°C保存，轉(zhuǎn)基因備用。
7.如權(quán)利要求2所述水稻OsICEl基因雙元載體的應(yīng)用方法，其特征在于，該應(yīng)用方法還包括以下步驟轉(zhuǎn)基因植株的獲得方法侵染愈傷組織和共培養(yǎng)取水稻材料日本晴花后15 d的幼胚，用75 %乙醇浸泡I min，再用25 %的次氯酸鈉浸泡25-30 min,無菌水洗3 -4次，用異物針挑出幼胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；將水稻愈傷組織挑出放入離心管中，取培養(yǎng)好的茵液Iml于1. 5ml離心管中，4°C, 5000rpm,離心I min,去上清,用含200 μ moll/1乙酰丁香酮As的30ml感茵液制成懸浮液，此懸浮液倒入挑好的愈傷組織中，侵染5min，倒掉液體，將愈傷組織取出，置于無茵的含吸水紙的培養(yǎng)皿上浙干30-40min，將愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25°C暗培養(yǎng) 60h;洗菌和抗生素篩選培養(yǎng)將愈傷組織從共培養(yǎng)培養(yǎng)基中取出，用無茵水清5次，每次不停的振蕩5min,再用含SOOmgI/1羧節(jié)青霉素car的無茵水浸泡40_60min,最后置于無菌濾紙上浙干2h，第一輪篩選將晾干的愈傷組織轉(zhuǎn)入含25011^171羧芐青霉素car和SOmgL—1潮霉素Hyg的選擇培養(yǎng)基上進行第一次選擇，30°C，光照培養(yǎng)14d ;第二輪篩選將長有抗性愈傷組織的初始愈傷組織轉(zhuǎn)到含25011^171羧芐青霉素car和SOmgL—1潮霉素Hyg的選擇培養(yǎng)基上，300C，光照培養(yǎng)IOd然后轉(zhuǎn)移到組培室中培養(yǎng)4d;抗性愈傷組織的誘導(dǎo)分化和生根挑取顏色鮮黃的抗性愈傷組織移入分化培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)室，組培室培養(yǎng)條件為24-30°C，14h光/8h暗，待苗長至5cm，放入生根培養(yǎng)基中壯苗；剪取待檢測苗Icm長的新鮮綠色葉片，平放于含潮霉素SOrngL—1培養(yǎng)基上，30°C， 16h/8h光/暗培養(yǎng)48h葉片依舊保持鮮綠的即為陽性植株，而陰性幼苗的葉片出現(xiàn)塊狀壞死，通過潮霉素篩選得到陽性TO植株；TO代種子發(fā)芽后得到Tl代轉(zhuǎn)基因苗，提取轉(zhuǎn)基因Tl代苗不同株系葉片的總 RNA,反轉(zhuǎn)錄總 cDNA,采用引物 F :5 ’ - CGATGAGGACTGGTACTTCG -3 ’，R :5’ -GTCCTCGGAGTCGTAGTTGA-3’進行半定量PCR鑒定，結(jié)果具有727bp條帶的，即為得到的穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系；同時，使用CTAB法提取DNA，使用潮霉素引物進行PCR檢測。
8.—種OsICEl轉(zhuǎn)基因水稻T2代植株的抗冷性分析方法，其特征在于，首先，從轉(zhuǎn)基因水稻植株冷脅迫表型方面觀察OsICEl基因?qū)涿{迫的抗性表現(xiàn)；模擬冷脅迫條件，在人工氣候箱內(nèi)用Hogland培養(yǎng)液培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因水稻植株與非轉(zhuǎn)基因水稻植株，待幼苗生長兩周后于6°C下培養(yǎng)四天，觀察到轉(zhuǎn)基因植株C1-T12，C2-T25， C3-T7，C4-T5的長勢優(yōu)于對照植株，表現(xiàn)在植株高度、葉色和根長等性狀；同樣條件下，轉(zhuǎn)基因植株C5-T21為OsICEl基因的反義表達載體轉(zhuǎn)化的植株，其植株幼苗在6°C冷脅迫條件下培養(yǎng)，對冷脅迫反應(yīng)較敏感。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻OsICE1基因的雙元載體及其應(yīng)用，該雙元載體包括Pubi:ICE1:NOS，Pubi:ICE1-FLAG:NOS，Pubi:ICE1-HA:NOS, Pubi:ICE1-MYC:NOS與ICE1-antisense載體。該應(yīng)用方法把構(gòu)建的OsICE1基因的五種表達載體Pubi:ICE1:NOS，Pubi:ICE1-FLAG:NOS，Pubi:ICE1-HA:NOS，Pubi:ICE1-MYC:NOS和ICE1-antisense轉(zhuǎn)入水稻受體材料日本晴中，經(jīng)繁殖傳代，獲得T2代轉(zhuǎn)基因植株。此外，本發(fā)明還對OsICE1轉(zhuǎn)基因水稻T2代植株的抗冷性分析方法，得到的轉(zhuǎn)基因植株C5-T21為OsICE1基因的反義表達載體轉(zhuǎn)化的植株，其植株幼苗在6℃冷脅迫條件下培養(yǎng)，對冷脅迫反應(yīng)較敏感。本發(fā)明提供的功能基因的雙元載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物的抗逆性分子育種中具有較廣泛的實踐意義和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/66GK103014062SQ20131000934
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者楊立明, 羅玉明, 季勤, 胡向陽, 劉華清, 田大剛 申請人:淮陰師范學院