來自人類臍帶組織衍生的細(xì)胞的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】我們已公開誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和由人類臍帶組織衍生的細(xì)胞制備誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法。更具體地，我們已公開可分化成外胚層、中胚層和內(nèi)胚層譜系的細(xì)胞的人類臍帶組織衍生的iPS細(xì)胞。
【專利說明】來自人類臍帶組織衍生的細(xì)胞的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。更具體地，本發(fā)明涉及將人類臍帶組織衍生的細(xì)胞(hUTC)重編程為誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞。

【背景技術(shù)】
[0002]誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞已產(chǎn)生在再生醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的興趣，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S在體外生成具有用于細(xì)胞治療的潛在價(jià)值的患者特異性祖細(xì)胞(Takahashi，K.和Yamanaka，S.，Cell《細(xì)胞》126,663-76(2006))。然而，在許多情況下，現(xiàn)成的方法將是期望的，諸如用于急性病癥的細(xì)胞治療，或當(dāng)患者的體細(xì)胞由于慢性疾病或衰老而改變時(shí)。
[0003]使用整合病毒方法的多能性因子和癌基因的異位表達(dá)足以在小鼠和人類的成纖維細(xì)胞兩者中誘導(dǎo)多能性(Takahashi，K.和Yamanaka，S.，Cell《細(xì)胞》126，663-76 (2006)；Takahashi, K.等人 Cell《細(xì)胞》131，861-72 (2007) ；Hochedlinger, K.和 Plath, K.，Development《發(fā)育》136, 509-23 (2009) ；Lowry, ff.E.等人，Proc NatlAcad Sci USA《美國國家科學(xué)院院刊》105,2883-8(2008))。然而，該過程是緩慢無效的，并且載體永久整合到基因組內(nèi)限制iPS細(xì)胞用于治療應(yīng)用的用途(Takahashi，K.和Yamanaka，S.，Cell《細(xì)胞》126,663-76(2006))。進(jìn)一步的研究已顯示年齡、起源和使用的細(xì)胞類型對(duì)重編程效率具有深刻的影響。近來，已顯示在與成纖維細(xì)胞進(jìn)行比較時(shí)，人類角質(zhì)形成細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致100倍更有效的和兩倍快速的重編程為多能性。假設(shè)這些差異可起因于KLF4和c-MYC在起始角質(zhì)形成細(xì)胞群中的內(nèi)源表達(dá)和/或更順應(yīng)重編程的呈現(xiàn)后生狀態(tài)的一群未分化的祖細(xì)胞的存在(Lowry，W.E.等人，Proc NatlAcad Sci USA《美國國家科學(xué)院院刊》105,2883-8(2008).)。后面的假設(shè)還已得到對(duì)小鼠的其他研究的支持。(Silva, J.等人，PLoS B1l《植物實(shí)驗(yàn)室-生物學(xué)》6，e253(2008) jPEminli，S.等人，Stem Cells《干細(xì)胞》26,2467-74(2008))。然而，干細(xì)胞通常是罕見的并且難以接近的并且大量分離的(例如神經(jīng)干細(xì)胞)(Kim, J.B.等人，Cell《細(xì)胞》136，411-9 (2009) ；Kim, J.B.等人，Nature《自然》454，646-50 (2008))。
[0004]人類臍帶組織衍生的iPS細(xì)胞代表用于許多應(yīng)用的多能細(xì)胞的可行供應(yīng)。它對(duì)再生醫(yī)學(xué)特別感興趣，因?yàn)槟殠ЫM織來自早期發(fā)育起源，并且已顯示具有多譜系分化潛能。另外，當(dāng)與青少年或成人供體細(xì)胞諸如皮膚成纖維細(xì)胞或角質(zhì)形成細(xì)胞相比較時(shí)，臍帶組織可能免于摻入的突變。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]我們?cè)诒疚闹忻枋隽送ㄟ^使人類臍帶組織衍生的細(xì)胞重編程制備的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。人類臍帶組織衍生的細(xì)胞是從基本上不含血液的人類臍帶組織中分離的經(jīng)分離的臍帶組織細(xì)胞，所述臍帶組織細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，具有分化成其他表型的細(xì)胞的潛能，可在培養(yǎng)中經(jīng)歷至少40次的倍增，在傳代時(shí)保持正常核型，并且具有下述特征:表達(dá) CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr- a、PD-L2 和 HLA-A, B、C 中的每一種；不表達(dá) CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CDl 17、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G 或 HLA-DR, DP、DQ 中的任一種；以及相對(duì)于成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人類細(xì)胞的表達(dá)，對(duì)于白細(xì)胞介素8、漿膜蛋白I和趨化因子(C-X-C基序)配體3中的每一種的增加的基因表達(dá)。人類臍帶組織衍生的細(xì)胞還具有下述特征:分泌因子MCP-1、MIPl β、IL-6、IL_8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、RANTES 和 --ΜΡ1 中的每一種；并且不分泌因子 SDF-1 α、TGF- β 2、ANG2、PDGFbb、MIPla 和 VEGF 中的任一種。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0006]圖1.利用人類的0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC以及針對(duì)p53的shRNA的hUTC轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得人類臍帶組織衍生的iPS細(xì)胞、克隆Kl的形態(tài)?？寺★@示于在第I代的被照射的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層上。
[0007]圖2.在MEF飼養(yǎng)層上生長且對(duì)堿性磷酸酶進(jìn)行染色的人類臍帶組織衍生的iPS細(xì)胞(克隆κι) (4x放大率)。

【具體實(shí)施方式】
[0008]我們?cè)诒疚闹泄_了通過四種(OSKM)轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)連同或不連同P53的下調(diào)，將人類臍帶組織衍生的細(xì)胞(hUTC)重編程為多能性。使用本文描述的方法和組合物，hUTC通過利用0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)而重編程為多能性。所得的重編程的hUTC具有誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞的特征。
[0009]在一個(gè)實(shí)施例中，由人類臍帶組織衍生的細(xì)胞制備的誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞，在本文中稱為人類臍帶組織衍生的iPS細(xì)胞。hUTC通過在針對(duì)p53的shRNA存在或不存在的情況下重編程因子的被迫表達(dá)而重編程。重編程的細(xì)胞在形態(tài)、堿性磷酸酶的染色、多能性標(biāo)記的表達(dá)、特定啟動(dòng)子的甲基化和特定胚層標(biāo)記的表達(dá)方面被表征。
[0010]hUTC是從人類臍帶組織中分離的獨(dú)特細(xì)胞群。用于分離hUTC的方法在全文以引用方式并入本文的美國專利號(hào)7，510，873中有所描述。簡而言之，該方法包括(a)獲得人類臍帶組織；(b)去除基本上所有血液，以收獲基本上不含血液的臍帶組織，(c)通過機(jī)械處理或酶促處理或兩者來解離組織，(d)使組織重懸浮于培養(yǎng)基中，以及(e)提供允許人類臍帶組織衍生的細(xì)胞生長的生長條件，所述人類臍帶組織衍生的細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，并具有分化成其他表型的細(xì)胞的潛能。
[0011]在優(yōu)選的實(shí)施例中，細(xì)胞不表達(dá)端粒酶(hTert)。因此，一個(gè)實(shí)施例是不表達(dá)端粒酶(hTert)并且具有一種或多種本文公開的特征的人類臍帶組織衍生的細(xì)胞。
[0012]在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞是臍帶組織衍生的細(xì)胞，其從基本上不含血液的人類臍帶組織中分離，能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，具有分化成其他表型的細(xì)胞的潛能，可經(jīng)歷至少40次的倍增，并且具有下述特征:(a)表達(dá)⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr- α、PD-L2 和 HLA-A、B、C 中的每一種；(b)不表達(dá) CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD 117、CD141、CD 178、B7-H2、HLA-G或HLA-DR、DP、DQ中的任一種；以及(c)相對(duì)于其為成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人類細(xì)胞的表達(dá)，白細(xì)胞介素8、漿膜蛋白I和趨化因子受體配體(C-X-C基序)配體3的增加的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施例中，這些臍帶衍生的細(xì)胞還具有下述特征中的一種或多種:(a)分泌因子 MCP-1、MIPl β、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TP0、RANTES和--MP1 中的每一種；以及(b)不分泌因子 SDF-1 a、TGF_3 2、ANG2、H)GFbb、MIPla和VEGF中的任一種。在另一個(gè)實(shí)施例中，這些臍帶組織衍生的細(xì)胞不表達(dá)hTERT或端粒酶。
[0013]在另一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞是臍帶組織衍生的細(xì)胞，其從基本上不含血液的人類臍帶組織中分離，能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，具有分化成其他表型的細(xì)胞的潛能，不表達(dá)⑶117且表達(dá)端粒酶或hTert。在另外一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞還不表達(dá)⑶45。在替代實(shí)施例中，細(xì)胞還不表達(dá) CD31、CD34、CD80、CD86、CD 141、CD 178、B7-H2、HLA-G 或 HLA-DR、DP、DQ 中的任一種。在另一個(gè)替代實(shí)施例中，細(xì)胞還表達(dá)⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr- α、PD-L2和HLA-A、B、C中的每一種。在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞還可經(jīng)歷至少40次的倍增。在另外一個(gè)實(shí)施例中，相對(duì)于其為成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人類細(xì)胞的表達(dá)，細(xì)胞還顯示白細(xì)胞介素-8 ;漿膜蛋白I ;和趨化因子受體配體(C-X-C基序)配體3的增加的表達(dá)。在另外一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞還具有下述特征中的每一種:(a)分泌因子 MCP-1、MIPl β、IL-6、IL-8, GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF, BDNF, TPO, RANTES 和 --ΜΡ1中的每一種，以及(b)不分泌因子SDF-1 α TGF-β 2、ANG2、PDGFbb、MIPla和VEGF中的任一種。
[0014]hUTC使用病毒重編程方法進(jìn)行重編程。在一個(gè)實(shí)施例中，hUTC利用單個(gè)地?cái)y帶組成性表達(dá)的人類轉(zhuǎn)錄因子0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC的逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)柒。簡而言之，將hUTC在hFib培養(yǎng)基中以I X 15細(xì)胞/孔在6孔板上鋪平板，并且在5% CO2和37°C下溫育6小時(shí)。將四種鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體(0CT4、S0X2、KLF4和c-MYC)和用于增加轉(zhuǎn)柒效率的試劑加入到每個(gè)孔中。在5% CO2和37°C下過夜溫育后，重復(fù)該轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟。在24小時(shí)后，抽吸培養(yǎng)基并加入新鮮的hFib培養(yǎng)基。在另外48小時(shí)后，將細(xì)胞收集并在hFib培養(yǎng)基中在預(yù)種植有小鼠胚胎飼養(yǎng)(MEF)細(xì)胞的60mm的皿上鋪平板。在48小時(shí)后，將培養(yǎng)基用hES培養(yǎng)基替換。允許細(xì)胞溫育三至四周，同時(shí)每天替換hES培養(yǎng)基。
[0015]在另一個(gè)實(shí)施例中，hUTC用單個(gè)地?cái)y帶組成性表達(dá)的人類轉(zhuǎn)錄因子0CT4、S0X2、KLF4和c-MYC以及p53-shRNA的VSVg鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)柒。p53的抑制先前已顯示假定通過減慢細(xì)胞增殖來增強(qiáng)特定細(xì)胞類型的重編程效率(Zhao Y等人，(2008)Cell StemCell《細(xì)胞-干細(xì)胞》3 =475-479 ；Sarig, R.等人，J.Exp.Med.《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》207:2127-2140 (2010))。簡而言之，將hUTC在Hayflick培養(yǎng)基中以I X 15細(xì)胞/孔在6孔板中鋪平板，并且在5% CO2和37°C下過夜溫育。對(duì)于病毒轉(zhuǎn)染，制備具有四種VSVg鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體(0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC)和p53_shRNA以及增加轉(zhuǎn)染效率的試劑的轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)基用于每個(gè)孔。從孔中抽吸培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)基，并在5% CO2和37°C下過夜溫育。第二天重復(fù)該轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟，并且在過夜溫育后，將轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)基用Hayflick培養(yǎng)基替換。允許細(xì)胞溫育另外四天，同時(shí)每兩天替換Hayflick培養(yǎng)基。
[0016]隨后將經(jīng)轉(zhuǎn)染的hUTC進(jìn)行培養(yǎng)并觀察典型iPS細(xì)胞形態(tài)的出現(xiàn)。典型iPS細(xì)胞形態(tài)指緊密填充的細(xì)胞集落的形成，所述細(xì)胞集落在光學(xué)顯微鏡下是折光的或“有光澤的”，具有非常尖銳且界限清楚的邊緣。將表現(xiàn)出典型iPS細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞分離，傳代培養(yǎng)并擴(kuò)增，以提供人類臍帶組織衍生的iPS細(xì)胞。
[0017]若干標(biāo)準(zhǔn)用于評(píng)估iPS細(xì)胞是否是完全重編程的，包括形態(tài)(如上所述)、堿性磷酸酶的染色、多能性標(biāo)記的表達(dá)、特定啟動(dòng)子的甲基化和特定胚層標(biāo)記的表達(dá)。關(guān)鍵的多能性因子NANOG和胚胎干細(xì)胞特異性表面抗原(SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81)的表達(dá)已常規(guī)地用于鑒定完全重編程的人類細(xì)胞。在功能性水平上，iPS細(xì)胞也展示出分化成來自所有三個(gè)胚胎胚層的譜系的能力。
[0018]通過本文描述的方法制備的人類臍帶組織衍生的iPS細(xì)胞在多能性方面被表征。顯示出典型iPS細(xì)胞形態(tài)的這些細(xì)胞能夠自我更新，表達(dá)關(guān)鍵的多能性標(biāo)記(TRA1-60、TRA1-81、SSEA3、SSEA4和NAN0G)，展示出分化成來自三個(gè)胚層的譜系，并且顯示正常核型。
[0019]人類臍帶組織衍生的iPS細(xì)胞代表用于再生醫(yī)學(xué)的多能細(xì)胞的良好來源。利用這種技術(shù)，目前能夠生成大量的多能細(xì)胞。另一個(gè)重要的有益效果是由源于早期發(fā)育起源的組織和由相對(duì)于成人供體細(xì)胞可能不含摻入的突變的組織獲得iPS細(xì)胞。這些細(xì)胞可用于在源自多重組織的iPS細(xì)胞中，關(guān)于后生重編程的程度、分化能力、所得的譜系的穩(wěn)定性和相關(guān)異常的危險(xiǎn)的比較。
[0020]本發(fā)明將在以下說明書中參照附圖圖解以本發(fā)明的非限制性實(shí)例、各種實(shí)施例的方式得到進(jìn)一步的解釋。
[0021]SM
[0022]實(shí)例1.將hUTC重編稈為iPS細(xì)朐
[0023]根據(jù)美國專利號(hào)7，510，873中所述的方法獲得的hUTC利用單個(gè)地?cái)y帶組成性表達(dá)的人類轉(zhuǎn)錄因子(0 CT4、S0X2、KLF4和c-MYC)的鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0024]將hUTC解凍且在轉(zhuǎn)導(dǎo)前培養(yǎng)一代。在第I天時(shí)，使hUTC胰蛋白酶化，并在2毫升hFib培養(yǎng)基(DMEM(美國加利福尼亞州卡爾斯巴德的英濰捷基公司(InvitrogenCorporat1n, Carlsbad, CA),目錄號(hào) 11965-092))中以 I X 15 細(xì)胞 / 孔在 6 孔板上鋪平板，所述hFib培養(yǎng)基含有以商品名BENCHMARK銷售的10%胎牛血清(FBS)(美國加利福尼亞州西薩克拉門托的雙子座生物制品公司(Gemini B1-products, West Sacramento, CA),目錄號(hào)100-106，體積/體積)、2毫摩爾以商品名GLUTAMAX銷售的L-谷氨酰胺(英濰捷基公司(Invitrogen Corporat1n),目錄號(hào)35050-061) >50單位/毫升青霉素和50毫克/毫升鏈霉素(英濰捷基公司(Invitrogen Corporat1n),目錄號(hào)15140-122) /孔。使細(xì)胞在5% CO2和37°C下溫育6小時(shí)。抽吸培養(yǎng)基以去除非活細(xì)胞，并且加入2毫升新鮮的hFib培養(yǎng)基。將單個(gè)地?cái)y帶0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC的逆轉(zhuǎn)錄病毒(各自具有5的Μ0Ι)和10微升(200x)以商品名TRANSDUX銷售的感染試劑(美國加利福尼亞州山景城的美國SBI公司(System B1sCiences, Inc.，Mountain View, CA),目錄號(hào) LV850A-1)加入到每個(gè)孔內(nèi)，并通過旋轉(zhuǎn)所述板逐漸混合。在第2天時(shí)，重復(fù)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟。在第3天時(shí)，去除轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞并將培養(yǎng)基用2毫升hFib培養(yǎng)基替換。在同一天，將I X 15絲裂霉素C處理的MEF細(xì)胞種植到60-毫米的皿(預(yù)涂有0.1 %明膠(美國馬薩諸塞州比爾里卡的密理博公司(Millipore Corporat1n, Billerica,MA),目錄號(hào) ES-006-B,重量 / 體積)上，并且在5% CO2和37°C下過夜溫育。
[0025]為了監(jiān)控重編程或iPS細(xì)胞集落的形成，通過在第4天時(shí)受胰蛋白酶作用收獲經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的hUTC，重懸浮于hES培養(yǎng)基(DMEM/F12，英濰捷基公司，目錄號(hào)11330-32)中，所述hES培養(yǎng)基含有20% knockout血清(KSR，英濰捷基公司，目錄號(hào)10828-028，體積/體積)、10納克/毫升堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF ;美國明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯的安迪生物科技公司(R&D Systems, Inc.，Minneapolis，MN)，目錄號(hào) 233-FB-025)、I 毫摩爾 GLUTAMAX、0.1毫摩爾非必需氨基酸(英濰捷基公司，目錄號(hào)11140-050)、0.1毫摩爾2-巰基乙醇(美國密蘇里州圣路易的西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO),目錄號(hào)M7522)、50單位/毫升青霉素和50毫克/毫升鏈霉素(英濰捷基公司，目錄號(hào)15140-122)，并且隨后以IX 16細(xì)胞/60毫米的皿的濃度在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)平板上鋪平板。細(xì)胞以3X 14至IX 15細(xì)胞的不同細(xì)胞密度鋪平板。在第6天時(shí)，抽吸培養(yǎng)基并替換為hES培養(yǎng)基。每天將培養(yǎng)基更換為新鮮的hES培養(yǎng)基，共3至4周。每天檢查平板，以鑒定iPS細(xì)胞集落。
[0026]對(duì)于在針對(duì)p53的shRNA的存在下的重編程，hUTC用逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體具體是單個(gè)地?cái)y帶組成性表達(dá)的人類轉(zhuǎn)錄因子(0CT4、S0X2、KLF4和c-MYC)的VSVg鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒，和含有p53-shRNA的VSVg鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒。
[0027]使用293_gp2逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞產(chǎn)生鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒，所述包裝細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天以3 X 16細(xì)胞/皿的密度在6厘米的皿上鋪平板，并且在5% CO2和37°C下過夜溫育。根據(jù)制造商的標(biāo)準(zhǔn)方案，每個(gè)皿隨后用3微克pMX載體(Sox2、0ct4、cMyc、Klf4或p53_shRNA載體，I微克VSV-g和16微升在商品名FUGENE HI下銷售的轉(zhuǎn)染試劑(美國印第安納州印第安納波利斯的羅氏應(yīng)用生物科學(xué)公司(Roche Applied B1science, Indianapolis, IN),目錄號(hào)04709705001))進(jìn)行轉(zhuǎn)染。隨后在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集病毒，并且在使用前通過0.45微米濾器進(jìn)行過濾。
[0028]將hUTC解凍且在轉(zhuǎn)導(dǎo)前培養(yǎng)一代。在轉(zhuǎn)導(dǎo)前一天，使hUTC受胰蛋白酶作用，并且以I X 15細(xì)胞/孔在6孔板的2個(gè)孔上在2毫升腎上皮生長培養(yǎng)基(REGM，美國馬里蘭州沃克斯維爾的 Lonza Walkersville 公司(Lonza ffalkersville, Inc.，Walkersville, MD))/孔中鋪平板。使細(xì)胞在5% CO2和37°C下過夜溫育。在第I天時(shí)，制備2.5毫升轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)基用于每個(gè)孔，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)基含有500微升每種新鮮制備的病毒和4納克/毫升聚凝胺。從孔中抽吸培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)基，并且在5% CO2和37°C下過夜溫育。在第2天時(shí)，重復(fù)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟。在第3天時(shí)，去除轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)基并替換為REGM。培養(yǎng)基更換每2天執(zhí)行直至第7天時(shí)。
[0029]為了監(jiān)控重編程的集落或iPS細(xì)胞集落的形成，通過胰蛋白酶化收獲經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的hUTC，重懸浮于補(bǔ)充有另外的20納克/毫升bFGF以商品名STEMEDIUM NUTRISTEM銷售的培養(yǎng)基(美國馬薩諸塞州劍橋的Stemgent公司(Stemgent, Inc., Cambridge, MA),目錄號(hào)01-0005) (iPS-Nu培養(yǎng)基)中，或具有20納克/毫升bFGF的含標(biāo)準(zhǔn)knockout血清替代品(KSR)的人類ES培養(yǎng)基(iPS-KSR培養(yǎng)基)中，并且隨后在以商品名MATRIGEL銷售的涂布的基底膜基質(zhì)(美國伊利諾州芝加哥的BD生物科學(xué)公司(BD B1sciences, Chicago, IL),目錄號(hào)354277)上或在6孔板中以IX 14細(xì)胞/孔的濃度的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)平板上鋪平板。在第一周期間每2天并且在第2至6周期間每天，將培養(yǎng)基用新鮮的iPS培養(yǎng)基更換。每天檢查平板以鑒定iPS細(xì)胞集落。
[0030]表現(xiàn)出“典型”重編程的或iPS細(xì)胞形態(tài)的集落從MEF飼養(yǎng)平板手動(dòng)地挑選，并且種植到12孔MEF飼養(yǎng)平板的單個(gè)孔上。每天更換培養(yǎng)基。在4-6天后，從12孔板中手動(dòng)挑選集落且擴(kuò)增到6孔板內(nèi)。每天更換培養(yǎng)基，并且每4-6天以1: 3手動(dòng)分開。使用以商品名CRY0STEM銷售的冷凍培養(yǎng)基(Stemgent公司，目錄號(hào)01-0013)將來自每個(gè)孔的細(xì)胞在各個(gè)階段進(jìn)行冷凍。
[0031]MS
[0032]利用表達(dá)四種重編程因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒的hUTC重編程導(dǎo)致表現(xiàn)出iPS細(xì)胞形態(tài)的重編程的集落。手動(dòng)挑選重編程的集落，并且將這些集落中的12個(gè)擴(kuò)增并冷凍。使用四種重編程因子獲得的人類臍帶組織衍生的iPS細(xì)胞被指示為FF，隨后為集落編號(hào)。
[0033]利用表達(dá)四種重編程因子和針對(duì)p53的shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒的hUTC重編程導(dǎo)致表現(xiàn)出iPS細(xì)胞形態(tài)的重編程的集落。手動(dòng)挑選二十五個(gè)重編程的集落，并且將這些集落中的19個(gè)擴(kuò)增并冷凍。使用四種重編程因子和p53 ShRNA獲得的人類臍帶組織衍生的iPS細(xì)胞被指示為N (最初在含STEMEDIUMNUTRISTEM培養(yǎng)基中保持)，隨后為集落編號(hào)，或被指示為K (最初在含KSR培養(yǎng)基中保持)，隨后為集落編號(hào)(圖1)。
[0034]實(shí)例2.多能性標(biāo)記的表達(dá)
[0035]實(shí)例I中制備的人類臍帶組織衍生的iPS細(xì)胞通過免疫細(xì)胞化學(xué)對(duì)其多能性標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估。在4%多聚甲醛中固定集落后，使用表1中所示的抗體試劑(所有抗體均購自Stemgent公司)執(zhí)行對(duì)多能性標(biāo)記的免疫突光染色。
[0036]表1.
[0037]

【權(quán)利要求】
1.一種包含重編程的人類臍帶組織衍生的細(xì)胞的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，其中所述人類臍帶組織衍生的細(xì)胞是從基本上不含血液的人類臍帶組織中分離的經(jīng)分離的臍帶組織細(xì)胞，所述臍帶組織細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，具有分化成其他表型的細(xì)胞的潛能，可在培養(yǎng)中經(jīng)歷至少40次的倍增，在傳代時(shí)保持正常核型，并且具有下述特征:表達(dá)⑶10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr- a、PD-L2 和 HLA-A, B、C 中的每一種；不表達(dá) CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CDl 17、CD141、CD178、Β7-Η2、HLA-G 或 HLA-DR、DP、DQ 中的任一種；以及相對(duì)于成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人類細(xì)胞的表達(dá)，對(duì)于白細(xì)胞介素8、漿膜蛋白I和趨化因子(C-X-C基序)配體3中的每一種的增加的基因表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，其中所述人類臍帶組織衍生的細(xì)胞還具有下述特征:分泌因子 MCP-1、MIPI β、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、RANTES 和 --ΜΡ1 中的每一種；以及不分泌因子 SDF-1 a、TGF-β 2、ANG2、PDGFbb, MIPla 和VEGF中的任一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，其中所述誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達(dá)TRA1-60、TRA1-81、SSEA3、SSEA4和 NANOG。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，其中所述誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞對(duì)于堿性磷酸酶染色是陽性的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，其中所述誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分化成外胚層、中胚層和內(nèi)胚層譜系的細(xì)胞。
6.一種誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，所述誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞由包括下述步驟的方法制備: 提供人類臍帶組織衍生的細(xì)胞，其中所述人類臍帶組織衍生的細(xì)胞是從基本上不含血液的人類臍帶組織中分離的經(jīng)分離的臍帶組織細(xì)胞，所述臍帶組織細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，具有分化成其他表型的細(xì)胞的潛能，可在培養(yǎng)中經(jīng)歷至少40次的倍增，在傳代時(shí)保持正常核型，并且具有下述特征:表達(dá)⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr- α、PD-L2 和 HLA-A、B、C 中的每一種；不表達(dá) CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、CD141、CD178、B7-H2、HLA-G或HLA-DR、DP、DQ中的任一種；以及相對(duì)于成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人類細(xì)胞的表達(dá)，對(duì)于白細(xì)胞介素8、漿膜蛋白I和趨化因子(C-X-C基序)配體3中的每一種的增加的基因表達(dá)； 利用單個(gè)地?cái)y帶組成性表達(dá)的人類轉(zhuǎn)錄因子0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC的鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒來轉(zhuǎn)染所述人類臍帶組織衍生的細(xì)胞， 培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的人類臍帶組織衍生的細(xì)胞， 鑒定誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞， 分離所述人類臍帶組織衍生的IPS細(xì)胞， 傳代培養(yǎng)所述誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞， 以及提供誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒還攜帶p53-shRNA。
【文檔編號(hào)】C12N5/0735GK104136604SQ201280070176
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月20日
【發(fā)明者】C.布恩蘇塞索, A.塞達(dá), D.C.科爾特, S.德哈納拉, B.C.克拉梅 申請(qǐng)人:德普伊新特斯產(chǎn)品有限責(zé)任公司