草甘膦耐受性玉米事件vco-φ1981-5及用于其檢測(cè)的試劑盒和方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用賦予對(duì)草甘膦的耐受性的基因的植物轉(zhuǎn)化的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及用編碼EPSPS的基因轉(zhuǎn)化的玉蜀黍(玉米)植物，所述EPSPS在此除草劑有效殺死雜草的條件下對(duì)植物提供對(duì)草甘膦應(yīng)用的耐受性。具體而言，本發(fā)明關(guān)注包含基因構(gòu)建體的良種轉(zhuǎn)化事件VCO-1981-5及用于檢測(cè)所述良種事件的存在的手段、試劑盒和方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】草甘膦耐受性玉米事件VCO- 0 1981-5及用于其檢測(cè)的試劑盒和方法
[0001]本發(fā)明涉及用賦予對(duì)草甘膦(glyphosate)的耐受性的基因的植物轉(zhuǎn)化的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及用編碼EPSPS的基因轉(zhuǎn)化的玉蜀黍(玉米)(maize (corn))植物，所述EPSPS在此除草劑有效殺死雜草的條件下對(duì)植物提供對(duì)草甘膦應(yīng)用的耐受性。
[0002]特別而言，本發(fā)明關(guān)注包含基因構(gòu)建體的良種轉(zhuǎn)化事件及用于檢測(cè)所述良種事件的存在的手段(means)、試劑盒和方法。
[0003]發(fā)明背景
[0004]草甘膦耐受性植物是本領(lǐng)域中已知的，并且在過(guò)去20年中充分研究。草甘膦是一種抑制EPSPS的除草劑，所述EPSPS是一種其活性在導(dǎo)致氨基酸酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸合成的芳香族氨基酸途徑上游的酶。由于草甘膦是一種合成的總體除草劑，在常見(jiàn)的農(nóng)藝學(xué)條件下噴霧該除草劑時(shí)植物中的耐受性僅可以通過(guò)用編碼草甘膦不敏感性EPSPS酶(突變的或選自已知已經(jīng)進(jìn)化出此類(lèi)不敏感性EPSPS酶的微生物)的異源基因?qū)χ参锏乃屑?xì)胞的遺傳修飾實(shí)現(xiàn)。
[0005]草甘膦不敏感性EPSPS、基因構(gòu)建體和用所述基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物披露于EP507698，EP508909, US4535060, US5436389, W092/04449, W092/06201, W095/06128, W097/04103，W02007/064828和W02008/100353及本文引用的參考文獻(xiàn)，等等。
[0006]EPSPS蛋白的生物物理特征對(duì)于實(shí)現(xiàn)良好的對(duì)草甘膦的耐受性水平是必需的。然而，在植物中提供足夠的不敏感性蛋白質(zhì)表達(dá)水平的調(diào)節(jié)元件的選擇也是重要的，以及選擇轉(zhuǎn)化事件(其對(duì)應(yīng)于具有植物基因組中所插入的穩(wěn)定且有限數(shù)目的基因拷貝的穩(wěn)定品系)及其在已經(jīng)插入基因的基因座中的穩(wěn)定性對(duì)于獲得商業(yè)水平的草甘膦耐受性也是重要的，所述商業(yè)水平對(duì)于要用于`制備種子的植物是足夠的，所述種子要在田間以一定的對(duì)草甘膦的耐受性水平在農(nóng)藝學(xué)條件下種植，所述農(nóng)藝學(xué)條件足以容許使用有效殺死雜草而不影響用編碼EPSPS蛋白的基因轉(zhuǎn)化的作物的生長(zhǎng)條件和產(chǎn)率的濃度使用除草劑。
[0007]選擇用于制備草甘膦耐受性玉蜀黍(玉米)的商業(yè)品種的轉(zhuǎn)化事件是本領(lǐng)域中已知的，特別地披露于US6040497和EP1167531。
[0008]用于制備目前用于田間的商業(yè)植物的第一代的這些品種具有一些缺點(diǎn)。
[0009]US6040497中披露的事件GA21包含多個(gè)拷貝的基因構(gòu)建體，該基因構(gòu)建體包含稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和內(nèi)含子、編碼優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列(如EP505909中披露的)和如W097/04103中披露的編碼包含兩處突變的突變植物EPSPS的序列。轉(zhuǎn)化事件中在商業(yè)上需要的耐受性水平用復(fù)雜的轉(zhuǎn)運(yùn)肽和多個(gè)拷貝的嵌合基因構(gòu)建體獲得。
[0010]EP1167531中披露的事件NK603也是一種在一個(gè)基因座中具有兩個(gè)基因構(gòu)建體組合的復(fù)雜事件。第一種基因構(gòu)建體包含稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和內(nèi)含子，及編碼擬南芥(Arabidopsis)EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列和編碼對(duì)草甘膦實(shí)現(xiàn)的抑制有抗性的II型EPSPS的序列(其分離自土壤桿菌(Agrobacterium)菌株CP4。第二種基因構(gòu)建體包含CaMV35S啟動(dòng)子和稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子，及編碼擬南芥EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列和編碼對(duì)草甘膦實(shí)現(xiàn)的抑制有抗性的II型EPSPS的序列(其分離自土壤桿菌菌株CP4)。[0011]需要新一代的轉(zhuǎn)化事件，其對(duì)農(nóng)藝學(xué)條件下種植的在植物基因組中具有單一拷貝的外來(lái)基因構(gòu)建體的玉蜀黍(玉米)植物容許高草甘膦耐受性。
[0012]發(fā)明概述
[0013]發(fā)明關(guān)注包含事件VCO-0 1981-5的玉蜀黍(玉米)植物，代表性種子以登錄號(hào)41842 保藏于 NCMB。
[0014]發(fā)明還關(guān)注包含VCO- 0 1981-5事件的玉蜀黍(玉米)植物，其特征在于存在包含序列SEQIDN01和/或SEQIDNd或SEQIDN03的基因組側(cè)翼序列-基因構(gòu)建體接合。
[0015]本發(fā)明還關(guān)注包含本發(fā)明的VCO- 0 1981-5事件的玉米植物后代，其特征在于存在所述接合序列。
[0016]鑒定玉蜀黍(玉米)植物基因組中所述接合序列存在的探針，以及包括所述探針及其使用的用于此類(lèi)鑒定的試劑盒和方法，特別是用于檢測(cè)VCO- 0 1981-5事件的方法及用于此類(lèi)檢測(cè)的引物、探針和試劑盒也是本發(fā)明的一部分。
[0017]發(fā)明詳述
[0018]“轉(zhuǎn)化事件”意指用異源DNA構(gòu)建體進(jìn)行植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化，源自將轉(zhuǎn)基因插入植物基因組中的植物群體的再生，和選擇以對(duì)特定基因組位置插入基因構(gòu)建體為特征的特定植物的產(chǎn)物。
[0019]依照本發(fā)明，“基因構(gòu)建體”意指從不同核苷酸序列(其包括控制編碼序列在宿主生物體中表達(dá)和翻譯的調(diào)節(jié)元件)構(gòu)建的基因。特別地，本發(fā)明中的宿主生物體是玉蜀黍(玉米)、細(xì)胞、組織和全植物?；驑?gòu)建體包含啟動(dòng)子區(qū)，與該啟動(dòng)子區(qū)可操作連接的編碼序列和終止子區(qū)。它可以包含增強(qiáng)子，諸如內(nèi)含子，其一般在啟動(dòng)子區(qū)下游且在編碼區(qū)上游連接。在草甘膦耐受性的情況中，編碼序列包含編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列，與該序列連接的從已經(jīng)形成對(duì)草甘膦的抗性的微生物突變或選擇或選擇且突變的編碼選擇其對(duì)草甘膦抑制的抗性的EPSPS酶的序列。
[0020]本發(fā)明的事件中的基因構(gòu)建體包含甘蔗泛素啟動(dòng)子和內(nèi)含子的DNA分子，與該DNA分子可操作連接的編碼玉米乙酰羥基酸合酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA分子，與該DNA分子可操作連接的編碼球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis)EPSPS GRG23ACE5的DNA分子。所述基因構(gòu)建體還包含終止子序列，特別是35S CaMV轉(zhuǎn)錄物的終止子序列。
[0021]本發(fā)明的基因構(gòu)建體的各種元件依照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且可用的常見(jiàn)分子生物學(xué)技術(shù)分離并可操作連接。
[0022]“泛素啟動(dòng)子和內(nèi)含子”意指來(lái)自甘鹿(Saccharum officinarum L.)的泛素_4基因的5’非編碼區(qū)的、來(lái)自甘蔗泛素-4基因的啟動(dòng)子和來(lái)自甘蔗泛素-4基因的內(nèi)含子，如披露于Albert和Wei (美國(guó)專(zhuān)利6，638，766)及SEQ ID N04和5中分別列出的。
[0023]“玉米AHAS葉綠素轉(zhuǎn)運(yùn)肽”指源自玉蜀黍(Zea mays L., maize)乙酰羥基酸合酶(AHAS)基因的N端轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，如披露于Fang等(1992)及SEQ ID N06中列出的。
[0024]“球形節(jié)桿菌epspsgrg23ace5”(Arthrobacter globiformis epspsgrg23ace5)意指如W02008/100353的SEQ ID N028中列出的核苷酸序列(SEQ ID N07)。
[0025]“35CaMV終止子序列”指終止mRNA轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)多聚腺苷酸化的來(lái)自花椰菜花葉病毒的非編碼3’端，如披露于Gardner等(1981)和SEQ ID N08中列出的。[0026]“植物轉(zhuǎn)化”和經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的選擇在本領(lǐng)域中廣泛披露，且更具體的是玉米轉(zhuǎn)化。用于玉米轉(zhuǎn)化和育種的技術(shù)現(xiàn)在是本領(lǐng)域中公知的，且特別披露于實(shí)驗(yàn)室筆記本和手冊(cè)，諸如“Transgenic Plants:Methods and Protocols(Methods in MolecularBiology)，，(Leandro Pena, Humana Press Inc., 2005), “Heterosis and Hybrid SeedProduction in Agronomic Crops”(Amarjit Basra, The Harwoth Press Inc., 1999)及“The Maize Handbook”(Michael Freeling and Virginia ffalbot, SpringerLab Manuals, 1994)。更具體地，用包含轉(zhuǎn)化載體的土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Hiei和Komari, 1997, US Patent5591616)實(shí)施玉米轉(zhuǎn)化。
[0027]用基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物一般包括下列步驟:
[0028]a)用含有包含基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化載體的根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株接種植物細(xì)胞；
[0029]b)選擇已經(jīng)將本發(fā)明的基因構(gòu)建體整合入其基因組中的植物細(xì)胞；
[0030]c)從選擇的植物細(xì)胞再生能育植物；
[0031]d)對(duì)再生植物傳粉，并
[0032]e)選擇對(duì)高劑量草甘膦耐受性的后代植物，然后
[0033]f)選擇已經(jīng)穩(wěn)定整合一個(gè)獨(dú)特拷貝的本發(fā)明基因構(gòu)建體的植物。
[0034]“轉(zhuǎn)化載體”意指包含基因構(gòu)建體和別的DNA元件的DNA分子，所述別的DNA元件容許對(duì)植物細(xì)胞導(dǎo)入基因構(gòu)建體及所述基因構(gòu)建體對(duì)植物細(xì)胞基因組的整合。轉(zhuǎn)化是一種土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中轉(zhuǎn)化載體包含在要插入的基因構(gòu)建體側(cè)翼的來(lái)自根癌土壤桿菌的T-DNA質(zhì)粒的右側(cè)和左側(cè)邊界。此類(lèi)轉(zhuǎn)化載體是本領(lǐng)域中完全公開(kāi)且植物分子和細(xì)胞生物學(xué)及植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的技術(shù)人員容易得到的。
[0035]“來(lái)自根癌土壤桿菌的T-DNA質(zhì)粒的右側(cè)和左側(cè)邊界”是來(lái)自Ti質(zhì)粒的右側(cè)和左側(cè)邊界序列的DNA序列，并且是植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中公知且公開(kāi)的。更特別地，右側(cè)邊界(RB)序列用作T-DNA從根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)移至植物基因組的啟動(dòng)點(diǎn)，特別地，它是源自質(zhì)粒pTiT37的胭脂堿型T-DNA的右側(cè)邊界序列(D印icker等1982; Komari等，1996)。左側(cè)邊界(LB)序列限定T-DNA從根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)移至植物基因組的終止點(diǎn)，特別地，它是來(lái)自Ti質(zhì)粒pTiC58 的左側(cè)邊界序列(Komari 等,1996; Otten 等,1999)。
[0036]“經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物”意指已經(jīng)將基因構(gòu)建體整合入其基因組中的植物，所述基因構(gòu)建體側(cè)翼有來(lái)自根癌土壤桿菌的T-DNA質(zhì)粒的右側(cè)和左側(cè)邊界序列的全部或片段。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的所有細(xì)胞已經(jīng)將基因構(gòu)建體整合入其基因組中。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物是能育植物，且更具體的是與未轉(zhuǎn)化的相同植物相比農(nóng)藝學(xué)特性(產(chǎn)量、谷物質(zhì)量、干旱耐受性等)不受損害的植物。
[0037]“插入DNA”是側(cè)翼有RB和LB序列并且在特定基因座處在植物基因組中插入的基因構(gòu)建體。
[0038]事件以玉蜀黍(玉米)基因組中特定基因座處本發(fā)明的插入T-DNA的穩(wěn)定整合限定。
[0039]插入限定兩個(gè)獨(dú)特的交接DNA序列，其中插入T-DNA序列連接側(cè)翼玉米基因組序列。通過(guò)參照插入T-DNA，存在有插入T-DNA的5’部分中定位的5’交接DNA和插入T-DNA的3’部分中定位的3’交接DNA。事件VCO-0 1981-5交接DNA(或所謂的“事件VCO-0198HDNA”)的非限制性例子在SEQIDN01、SEQIDN02或SEQIDN03中列出。
[0040]術(shù)語(yǔ)“事件”指包含異源DNA的初始轉(zhuǎn)化植物和經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的后代。術(shù)語(yǔ)“事件”還指在于后代包含異源DNA的通過(guò)經(jīng)轉(zhuǎn)化植物與另一品種之間的有性異型雜交產(chǎn)生的后代。
[0041]術(shù)語(yǔ)“事件”還指通過(guò)包含插入DNA和相鄰側(cè)翼基因組序列的供體近交系(初始轉(zhuǎn)化系和后代)和不含所述插入DNA的接受近交系(或輪回系)之間的有性回交產(chǎn)生的后代。在重復(fù)回交后，插入DNA在接受系中存在于與在供體系中相同的基因組中基因座。
[0042]術(shù)語(yǔ)VCO-0 1981-5的“事件”或事件序列也指來(lái)自初始轉(zhuǎn)化植物的插入DNA，其包含會(huì)從供體系轉(zhuǎn)移至接受系的部分或整個(gè)插入DNA和相鄰側(cè)翼基因組序列。
[0043]會(huì)將最后一次回交后代自交以生成后代，其在漸滲的插入DNA方面是純合的。
[0044]然后，這些后代會(huì)用作近交親本系以生成雜種。
[0045]可以如下育種草甘膦耐受性玉蜀黍(玉米)VCO-0 1981-5(又稱(chēng)作6981玉蜀黍(玉米))，即首先有性雜交由從轉(zhuǎn)基因玉蜀黍(玉米)植物VCO-0 1981-5(又稱(chēng)作6981玉蜀黍(玉米))(耐受草甘膦除草劑應(yīng)用的源自用本發(fā)明表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的以登錄號(hào)41842保藏于NCMB的代表性種子及其后代)種植的玉蜀黍(玉米)植物組成的供體親本玉蜀黍(玉米)植物，和缺乏對(duì)草甘膦除草劑的耐受性的接受親本玉蜀黍(玉米)植物，由此生成多個(gè)第一后代植物；然后，選擇對(duì)草甘膦除草劑應(yīng)用有耐受性的第一后代植物；并自交第一后代植物，由此生成多個(gè)第二后代植物；然后，從第二后代植物選擇草甘膦除草劑耐受性植物。這些步驟可以進(jìn)一步包括第一草甘膦耐受性后代植物或第二草甘膦耐受性后代植物與接受親本(或輪回)玉蜀黍(玉米)植物或第三親本玉蜀黍(玉米)植物的回交，由此生成耐受草甘膦除草劑應(yīng)用的玉蜀黍(玉米)植物。
`[0046]用于生成雜種玉蜀黍(玉米)種子的方法是本領(lǐng)域中公知的。該方法包括將包含由 GEMSTAR, rue Limagrain, BP-1, 63720Chappes, FRANCE 在 2011 年 5 月 13 日以登錄號(hào)41842保藏于NCMB的VCO- 0 1981-5事件的植物，或包含VCO- 0 1981-5事件的所述植物后代與不同玉蜀黍(玉米)植物雜交，并收獲包含VCO-.0 1981-5事件的所得雜種玉蜀黍(玉米)種子。
[0047]還應(yīng)當(dāng)理解，也可以雜交兩種不同轉(zhuǎn)基因植物以生成含有兩種或更多種獨(dú)立分離的添加的轉(zhuǎn)基因的后代。用于生成在其遺傳物質(zhì)中含有兩種或更多種轉(zhuǎn)基因的玉蜀黍(玉米)植物的方法，其中該方法包括將包含以登錄號(hào)41842保藏于NCMB的VCO- 0 1981-5事件的玉蜀黍(玉米)植物或包含VCO-0 1981-5事件的所述植物后代與包含至少一種轉(zhuǎn)基因的第二玉蜀黍(玉米)植物雜交，使得源自雜交的后代的遺傳物質(zhì)含有與調(diào)節(jié)元件可操作連接的轉(zhuǎn)基因，且其中轉(zhuǎn)基因選自下組:雄性不育，雄性能育、昆蟲(chóng)抗性、疾病抗性和水應(yīng)激耐受性和除草劑抗性(其中轉(zhuǎn)基因賦予對(duì)選自下組的除草劑的抗性:咪唑啉酮(imidazolinone)、磺酰脲(sulfonylurea)、草甘膦、草丁磷(glufosinate))。
[0048]合適后代的自交可以生成在兩種添加的外來(lái)基因方面都是純合的植物。會(huì)使用包含兩種或更多種轉(zhuǎn)基因的所述玉蜀黍(玉米)植物來(lái)生成雜種玉蜀黍(玉米)種子，其中方法包括雜交所述玉蜀黍(玉米)植物與不用玉蜀黍(玉米)植物，并收獲包含兩種或更多種轉(zhuǎn)基因的所得雜種玉蜀黍(玉米)種子。[0049]也涵蓋與親本植物回交和與非轉(zhuǎn)基因植物的異型雜交。通常用于不同性狀和作物的其它育種方法的描述可以參見(jiàn)幾篇參考文獻(xiàn)之一，例如A.Hallauer and J.B.Miranda inQuantitative genetics in maize breeding.(第 2 版，1wa State University press)及 R.Bernardo 于 Breeding for quantitative traits in plants(Stemma press.com)。
[0050]術(shù)語(yǔ)“事件”還指通過(guò)自包含以登錄號(hào)41842保藏于NCMB的VCO- 0 1981-5事件的玉蜀黍(玉米)植物或包含VCO- 0 1981-5事件的所述植物后代的營(yíng)養(yǎng)生殖產(chǎn)生的玉蜀黍(玉米)植物。營(yíng)養(yǎng)生殖可以從植物部分如例如細(xì)胞、組織諸如葉、花粉、胚、根、根尖、花藥、穗絲(silk)、花、籽粒(kernel)、穗(ear)、玉米穗軸(cob)、殼(husk)、莖(stalk)、或從所述植物部分啟動(dòng)的組織培養(yǎng)物啟動(dòng)。
[0051]術(shù)語(yǔ)事件關(guān)注草甘膦耐受性玉米，該草甘膦耐受性玉米在其基因組中包含與SEQID NOl或SEQ ID N02或SEQ ID N03至少95%，優(yōu)選至少96，97，98，或99%相同的核苷酸序列。
[0052]本發(fā)明還關(guān)注包含SEQIDN01或SEQIDN02或SEQIDN03并且具有25個(gè)核苷酸至5092個(gè)核苷酸的任何長(zhǎng)度的多核苷酸序列。
[0053]特別地，本發(fā)明關(guān)注事件VCO-0 1981-5特異的多核苷酸序列SEQIDN01、SEQIDN02和SEQIDN03。這些多核苷酸序列適合于選擇性鑒定不同生物學(xué)樣品中的事件VCO- 01981-5。生物學(xué)樣品應(yīng)當(dāng)理解為植物、植物部分或植物材料，諸如細(xì)胞、組織如葉、花粉、胚、根、根尖、花藥、穗絲、花、籽粒、穗、玉米穗軸、殼、莖或種子。它還應(yīng)當(dāng)理解為包含或源自植物部分或植物材料的加工產(chǎn)物。
[0054]用于檢測(cè)植物基因組中特定DNA元件的存在或缺乏的方法是本領(lǐng)域中公知的。主要技術(shù)包括用容許擴(kuò)增DNA序列的特異性引物進(jìn)行的DNA序列擴(kuò)增，特別是用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，及用對(duì)DNA序列特異性的探針進(jìn)行的雜交。
[0055]本發(fā)明包括用于鑒定本發(fā)明的轉(zhuǎn)化事件VCO- 0 1981-5的存在或缺乏的方法，特別是用已知技術(shù)之一進(jìn)行。
[0056]在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟:
[0057]a)從獲自玉蜀黍(玉米)植物、組織或細(xì)胞的生物學(xué)材料提取DNA;
[0058]b)使所述提取的DNA與合適長(zhǎng)度的第一和第二引物接觸，所述合適長(zhǎng)度選擇為容許生成包含整個(gè)或部分VCO- 0 1981-5事件序列的擴(kuò)增子DNA分子；
[0059]c)實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)以生成擴(kuò)增子DNA分子，并
[0060]d)檢測(cè)擴(kuò)增子分子中包含整個(gè)或部分VCO-0 1981-5事件序列的核苷酸序列的存在或缺乏。
[0061]—般地，引物包含或具有由10-30個(gè)核苷酸構(gòu)成(comprised)的長(zhǎng)度,并且依照分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)選擇和制備。
[0062]在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，包含整個(gè)或部分VCO- 0 1981-5事件序列的擴(kuò)增子分子包含SEQ ID NOl中列出的事件交接序列和/或SEQ ID N02中列出的事件交接序列和/或 與SEQIDN01或SEQIDN02至少95%，優(yōu)選至少96，97，98，或99%相同的序列。
[0063]有利地，第一和第二引物包含與SEQ ID N03中列出的事件序列的序列片段同源的序列，并且選擇為在事件VCO-0 1981-5序列側(cè)翼且生成包含SEQ ID NOl和SEQ ID N02中列出的DNA序列的擴(kuò)增子。
[0064]優(yōu)選的引物包含SEQ ID NOll和SEQ ID N012中列出的DNA序列。
[0065]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟:
[0066]a)從獲自玉蜀黍(玉米)植物、組織或細(xì)胞的生物學(xué)材料提取DNA;
[0067]b)使所述提取的DNA與探針接觸，所述探針具有足以在嚴(yán)格條件下與特異性檢測(cè)至少一種VCO- 0 1981-5交接序列的核苷酸序列雜交的長(zhǎng)度；
[0068]c)使提取的DNA和探針受到嚴(yán)格雜交條件處理，并
[0069]d)檢測(cè)所述探針與提取的DNA的雜交，其中檢出指示事件VCO- 0 1981-5序列的存在。
[0070]本發(fā)明還關(guān)注用于生成草甘膦耐受性植物的方法，其包括育種包含事件VCO- 01981-5序列的本發(fā)明植物，并通過(guò)檢測(cè)事件VCO-,0 1981-5序列的存在(特別是用本發(fā)明的檢測(cè)方法)來(lái)選擇后代。
[0071]“擴(kuò)增子”指通過(guò)用核苷酸模板序列中包含的靶核苷酸序列的特異性引物對(duì)擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物。
[0072]用于鑒定玉米 基因組中特定DNA或擴(kuò)增子序列的存在或缺乏的引物、探針和方法是本領(lǐng)域中公知的，特別是披露于EP1167531的段落[0027]至[0043](其通過(guò)提及并入本文)，及本文中引用的出版物。
[0073]嚴(yán)格條件定義如下。對(duì)于包含超過(guò)30個(gè)堿基的序列，Tm通過(guò)以如下的等式限定:1'111=81.5+0.41(%6+0+16.61^^(陽(yáng)離子濃度)-0.63(% 甲酰胺)-(600/堿基數(shù)目)(Sambrook 等，1989)。
[0074]對(duì)于短于30個(gè)堿基的序列，Tm以如下的等式限定:Tm=4 (G+C) +2 (A+T)。
[0075]在非特異性(無(wú)特異性)序列不雜交的合適嚴(yán)格性條件下，雜交溫度是比Tm低約5-300C，優(yōu)選地5-10°C，并且使用的雜交緩沖液優(yōu)選是較高離子力的溶液，如例如溶液6倍SSC。
[0076]本發(fā)明還關(guān)注用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中本發(fā)明的VCO-0 1981-5事件的存在或缺乏的試劑盒，其中其包含擴(kuò)增包含事件VCO- 0 1981-5DNA序列的多核苷酸序列或與該多核苷酸序列雜交的引物和/或探針。
[0077]特別地，本發(fā)明包括10至30個(gè)核苷酸的第一引物和10至30個(gè)核苷酸的第二引物，所述第一引物包含與SEQ ID N03的序列片段同源的序列，所述第二引物包含與SEQ IDN03的序列片段具有互補(bǔ)性的序列，所述第一和第二引物在事件VCO- 0 1981-OTNA序列側(cè)翼，并且聲稱(chēng)包含SEQ ID NOl或SEQ ID N02的擴(kuò)增子分子。
[0078]特別地，所述第一和第二引物包含SEQ ID NOll和SEQ ID N012中分別列出的序列。
[0079]本發(fā)明還關(guān)注分離的核苷酸序列，其包含SEQ ID NOll和/或SEQ ID N012中列出的序列，或基本上由該序列組成。
[0080]本發(fā)明還關(guān)注分離的核苷酸序列，其包含SEQ ID NOl和/或SEQ ID N02中列出的序列，特別地包含SEQ ID N03中列出的序列或其片段和/或與SEQIDN01或SEQIDN02或SEQIDN03至少95%，優(yōu)選地至少96，97，98，或99%相同的序列，或者基本上由SEQ ID N03中列出的序列或其片段和/或與SEQIDN01或SEQIDN02或SEQIDN03至少95%，優(yōu)選地至少96，97，98，或99%相同的序列組成。
[0081]用于基因構(gòu)建的技術(shù)及使用擴(kuò)增技術(shù)諸如PCR或雜交技術(shù)進(jìn)行基因鑒定的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的，且具體披露于實(shí)驗(yàn)室筆記本和手冊(cè)，諸如Sambrook和Russel(2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Ν.Y.)。
[0082]附圖簡(jiǎn)述
[0083]圖1代表轉(zhuǎn)化載體pAG3541。
[0084]圖2代表選擇事件VCO- 0 1981-5的示意圖。
[0085]圖3描繪了事件VCO- 0 1981-5的育種圖示。
[0086]圖4代表T-DNA區(qū)內(nèi)的EPSPS GRG23ACE5表達(dá)盒。
[0087]圖5代表后續(xù)世代(following generation)(對(duì)于BllO和B109雜交)和接著的4個(gè)世代(對(duì)于品系A(chǔ)AX3)中實(shí)施的分離分析。
實(shí)施例
[0088]縮寫(xiě)、首字母縮略詞、和定義
【權(quán)利要求】
1.一種包含事件VCO-0 1981-5的玉蜀黍(玉米)植物，代表性種子以登錄號(hào)41842保藏于NCMB。
2.一種包含事件VCO-0 1981-5的草甘膦耐受性玉蜀黍(玉米)植物，其通過(guò)將玉蜀黍(玉米)植物用從以登錄號(hào)41842保藏于NCMB的種子種植的玉蜀黍(玉米)植物育種可獲得。
3.權(quán)利要求2的草甘膦耐受性玉蜀黍(玉米)，其在其基因組中包含如SEQID NOl或SEQ ID N02和/或SEQ ID N03中所列的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的草甘膦耐受性玉蜀黍(玉米)，其中它是雜種玉蜀黍(玉米)植物。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述植物的部分、或所述植物的細(xì)胞或所述植物的種子，其中所述植物的所述部分、細(xì)胞或種子包含所述事件VCO- 0 1981-5。
6.一種分離的核苷酸序列，其包含與SEQ ID NOl和/或SEQ ID N02和/或SEQ IDN03至少95%相同的序列。
7.權(quán)利要求6的分離的核苷酸序列，其包含SEQID NOl和/或SEQ ID N02中所列的序列。
8.權(quán)利要求6的分離的核苷酸序列，其中它由SEQID N03中所列的序列組成。
9.一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中權(quán)利要求1至5的VCO-0 1981-5事件的存在或缺乏的試劑盒，其中它包含擴(kuò)增包含事件VCO-0 1981-OTNA序列的多核苷酸序列或與該多核苷酸序列雜交的引物或探針。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其中`它包含10至30個(gè)核苷酸的第一引物和10至30個(gè)核苷酸的第二引物，所述第一引物包含與SEQ ID N03的序列片段同源的序列，所述第二引物包含與SEQ ID N03的序列片段具有互補(bǔ)性的序列片段，所述第一和所述第二引物側(cè)接事件VCO-0 1981-5DNA序列，并且能夠生成包含SEQ ID NOl和/或SEQ ID N02的擴(kuò)增子分子。
11.權(quán)利要求9或10中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述第一和第二引物分別包含SEQIDNOll和SEQ ID N012中列出的序列。
12.一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中權(quán)利要求1至5的玉蜀黍(玉米)轉(zhuǎn)化VCO-0 1981-5事件的存在或缺乏的方法，其包括: a)從生物學(xué)樣品提取DNA； b)使所述提取的DNA與包含10-30個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度的第一和第二引物接觸； c)實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)以生成包含事件VCO-01981-OTNA序列的擴(kuò)增子分子，和 d)檢測(cè)所述擴(kuò)增子分子中包含事件VCO-01981-OTNA序列的核苷酸序列的存在或缺乏。
13.權(quán)利要求12的方法，其中包含事件VCO-01981-OTNA序列的所述擴(kuò)增子分子包含SEQ ID NOl或與SEQIDN01至少95%相同的序列。
14.權(quán)利要求12的方法，其中包含事件VCO-01981-OTNA序列的所述擴(kuò)增子分子包含SEQ ID N02或與SEQIDN02至少95%相同的序列。
15.權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一引物包含與SEQIDN03的序列片段同源的序列，且所述第二引物包含與SEQIDN03的序列片段具有互補(bǔ)性的序列，所述第一和所述第二引物側(cè)接事件VCO-0 1981-OTNA序列以生成擴(kuò)增子分子，該擴(kuò)增子分子包含SEQIDN01 或 SEQIDN02 或與 SEQIDN01 或 SEQIDN02 至少 95% 相同的序列。
16.權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一和第二引物分別包含SEQIDNOll和SEQ ID N012中所列的序列。
17.一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中玉蜀黍(玉米)植物VCO-0 1981-5事件的存在或缺乏的方法，其包括: a)從生物學(xué)樣品提取DNA； b)使所述提取的DNA與足夠長(zhǎng)度的探針接觸以在嚴(yán)格條件下與特異性檢測(cè)VCO-01981-5事件接合序列的核苷酸序列雜交； c)使所述提取的DNA和探針經(jīng)受?chē)?yán)格雜交條件，和 d)檢測(cè)所述探針與所述提取的DNA的雜交，其中檢出指示事件VCO-01981-5DNA序列的存在。
18.—種生成草甘膦耐受性植物的方法，其包括將權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的植物育種，并通過(guò)檢測(cè)包含事件VCO- 0 1981-5DNA序列的多核苷酸序列的存在來(lái)選擇后代。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述多核苷酸包含SEQID NOl、SEQ ID N02和/或SEQID N03所列的序 列。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103827305SQ201280043337
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月28日
【發(fā)明者】L.阿蒂姆曼, V.貝林森, N.卡羅齊, R.德特, B.范德伯格, A.陶潘, L.比夫, G.弗雷斯內(nèi)特 申請(qǐng)人:吉奈克蒂夫公司