低過(guò)敏原的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用作低過(guò)敏原的突變體多肽。更具體地，本發(fā)明提供了突變體Bet?v1蛋白以及此類多肽用作用于使樺樹(shù)花粉過(guò)敏脫敏的低過(guò)敏原的用途。此外，本發(fā)明提供了包含此類多肽的疫苗制劑；此類制劑的用途；以及抵抗樺樹(shù)花粉過(guò)敏而進(jìn)行免疫接種的方法。
【專利說(shuō)明】低過(guò)敏原
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用作低過(guò)敏原的突變體多肽。更具體地，本發(fā)明涉及突變體Bet Vl蛋白以及此類多肽作為用于使樺樹(shù)花粉過(guò)敏脫敏的低過(guò)敏原的用途。此外，本發(fā)明還涉及包含此類多肽的疫苗制劑；此類制劑在免疫接種中的用途；以及抵抗樺樹(shù)花粉過(guò)敏而進(jìn)行免疫接種的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]過(guò)敏由對(duì)通常無(wú)害的蛋白質(zhì)、過(guò)敏原的免疫反應(yīng)引起。過(guò)敏性病在世界范圍內(nèi)正在達(dá)到流行病的比例。工業(yè)化國(guó)家超過(guò)25%的人口患有I型過(guò)敏并且數(shù)量正在穩(wěn)定增加。 樺樹(shù)花粉過(guò)敏是I型過(guò)敏的非常常見(jiàn)的形式。Bet Vl是樺樹(shù)花粉的主要過(guò)敏原。更多關(guān)于 Bet vl過(guò)敏原、其異構(gòu)過(guò)敏原和變體的信息,見(jiàn)于WHO網(wǎng)站www.allergen, org。
[0004]I型過(guò)敏基于免疫球蛋白E(IgE)抗體的形成，當(dāng)過(guò)敏原分子結(jié)合兩個(gè)結(jié)合至肥大細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞表面上的受體的IgE抗體并且誘導(dǎo)IgE-Fc e RI復(fù)合物的交聯(lián)時(shí)，癥狀發(fā)生。這觸發(fā)了生物介質(zhì)(例如組胺和引起炎癥反應(yīng)和癥狀(例如過(guò)敏性哮喘、鼻炎、食物和皮膚過(guò)敏以及甚至過(guò)敏性反應(yīng))的脂質(zhì)介質(zhì))的脫粒。
[0005]IgE是由兩個(gè)相同輕鏈和重鏈組成的大分子。在IgE的重鏈中存在5個(gè)結(jié)構(gòu)域:VH、C e 1、C e 2、C e 3和C e 4。完整IgE分子的大小為約200kDa。結(jié)合至其 Fe e RI受體的C e 2-C e 4片段以及C e 2-C e 4片段的晶體結(jié)構(gòu)已被測(cè)定(Garman等人，Nature2000 (406): 259-266，和 Wan 等人，Nature Immunology, 2002 (3): 681-686)。
[0006]最近幾年，已測(cè)定了大量不同過(guò)敏原的三維結(jié)構(gòu)。在結(jié)構(gòu)上，這些過(guò)敏原變化相當(dāng)大，并且還未鑒定出可解釋過(guò)敏原引起IgE抗體產(chǎn)生的共同結(jié)構(gòu)基序。然而，有研究表明過(guò)敏原性僅限于少數(shù)蛋白質(zhì)家族，從而提出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征也可在過(guò)敏原性方面起作用的證據(jù)(Rouvinen 等人，PloS 0NE2010 (5): e9037 ;Raudauer 等人，J Allergy Clin Immunol.2008(121):847-852)。
[0007]Niemi等人最近的出版物，Structure2007 (15): 1413-21公開(kāi)了與P -乳球蛋白 (BLG)復(fù)合的IgE Fab片段的晶體結(jié)構(gòu)。其還顯示了兩個(gè)IgE/Fab分子是如何結(jié)合二聚體 BLG的以及當(dāng)與已知IgG表位結(jié)構(gòu)相比較時(shí)IgE表位是不同的，為位于P折疊區(qū)中的“扁
平”表面。
[0008]今天所有過(guò)敏性癥狀的治療的趨勢(shì)是向著使用過(guò)敏原-特異性脫敏作用而非避免過(guò)敏原進(jìn)行耐受性的主動(dòng)誘導(dǎo)，所述避免過(guò)敏原通常是不可能的或僅僅治療癥狀。目前的脫敏療法基于從天然來(lái)源純化的過(guò)敏原，其中批次間變化可導(dǎo)致與發(fā)現(xiàn)和維持治療的正確劑量和功效相關(guān)的問(wèn)題。這些問(wèn)題可導(dǎo)致過(guò)敏性副作用和對(duì)新過(guò)敏原的致敏作用的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
[0009]重組過(guò)敏原用于脫敏的用途將消除與批次間變化相關(guān)的不利方面，并且最早的重組過(guò)敏原處于臨床試驗(yàn)中(Valenta等人，Annu Rev Immunol2010 (28): 211-41)。這樣的過(guò)敏原在臨床中的效率從而仍待觀察。一些修飾重組過(guò)敏原已被報(bào)導(dǎo)。
[0010]國(guó)際專利公布W002/40676和W003/096869公開(kāi)了樺樹(shù)花粉過(guò)敏原Bet vl的許多突變體形式。這些突變體通過(guò)在基于Bet vl多肽的保守表面結(jié)構(gòu)的序列分析的假定的IgE結(jié)合位點(diǎn)引入隨機(jī)突變來(lái)產(chǎn)生。WO 03/096869公開(kāi)了過(guò)敏原表面上的不同“小簇(group)”上的4個(gè)主要突變的用途。
[0011]國(guó)際專利公布W02007/073907公開(kāi)了在氨基酸位置54、115或123上包含3個(gè)氨基酸置換或缺失的Bet vl多肽。沒(méi)有證據(jù)表明這些突變體具有減小的組胺釋放能力。
[0012]國(guó)際專利公布WO 2009/024208公開(kāi)了在氨基酸100-125的區(qū)域中具有至少4個(gè)突變的Bet vl突變體。然而，由于所述突變，多肽的三維結(jié)構(gòu)喪失了，并且無(wú)報(bào)導(dǎo)的活性。
[0013]國(guó)際專利公布WO 2008/092992公開(kāi)了通過(guò)修飾非連續(xù)致敏性表位(即致敏性物質(zhì)上具有600-900人的區(qū)域的扁平表面)上的氨基酸殘基來(lái)阻斷致敏性物質(zhì)的I型表面相互作用的方法，并且提示可相應(yīng)地制備低過(guò)敏原性樺樹(shù)花粉蛋白。
[0014]存在對(duì)安全高效的疫苗和治療產(chǎn)品的公認(rèn)和巨大的需要，以應(yīng)對(duì)日益增加的過(guò)敏醫(yī)療問(wèn)題。目前，對(duì)過(guò)敏的安全高效的療法的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)不足。
[0015]發(fā)明概述[公開(kāi)內(nèi)容]
[0016]本發(fā)明涉及基于SEQ ID NO: 4中所示的野生型氨基酸序列或其任何其它Bet vl野生型同種型的重組樺樹(shù)花粉Bet vl多肽，所述多肽在選自氨基酸殘基101、137、99、80、82、84、117、119、7、9、133、141和145的位置上包含至少一個(gè)氨基酸置換。
[0017]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)氨基酸置換位于選自氨基酸殘基E101、K137、S99、K80、N82、S84、S117、K119、T7、T9、V133、E141 和 R145 的位置。
[0018]在具體實(shí)施方案中，`根據(jù)本發(fā)明的多肽由選自SEQ ID NO:4-39的氨基酸序列表
/Jn ο
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽具有位于氨基酸位置101、137或99(優(yōu)選E101、K137或S99)處的氨基酸置換。
[0020]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述置換是S99被酪氨酸替代，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述置換是K137被酪氨酸替代。在其它實(shí)施方案中，所述置換是ElOl被賴氨酸替代。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的低過(guò)敏原性多肽具有當(dāng)與Bet vl野生型的組胺釋放能力相比較時(shí)降低至少20倍的組胺釋放能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽的組胺釋放能力降低至少100倍。
[0022]本發(fā)明還涉及包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的低過(guò)敏原性多肽的疫苗。
[0023]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗用于舌下施用。
[0024]本發(fā)明還涉及基于SEQ ID NO:4中所示的野生型氨基酸序列或其任何Bet vl野生型變體的重組樺樹(shù)花粉Bet vl多肽作為疫苗的用途(單獨(dú)地或與至少一種藥學(xué)上可接受的佐劑組合)，所述多肽在選自氨基酸殘基E101、K137、S99、K80、N82、S84、S117、K119、T7、T9、V133、E141和R145的位置上包含至少一個(gè)氨基酸置換。
[0025]本發(fā)明還涉及抵抗樺樹(shù)花粉過(guò)敏而進(jìn)行免疫接種的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的低過(guò)敏原性多肽和至少一種藥學(xué)上可接受的佐劑的組合物。
[0026]本發(fā)明還涉及基于SEQ ID NO:4所示的野生型氨基酸序列或任何其它Bet vl野生型同種型的重組樺樹(shù)花粉Bet vl多肽用作疫苗，所述多肽在選自氨基酸殘基101、137、99、80、82、84、117、119、7、9、133、141和145的位置上包含至少一個(gè)氨基酸置換。
[0027]附圖概述[0028]在下文中，參考附圖通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案將更詳細(xì)地描述本發(fā)明，其中
[0029]圖1舉例說(shuō)明實(shí)施例1中衍生的Bet vl的第一假定表位；
[0030]圖2舉例說(shuō)明實(shí)施例1中衍生的Bet vl的第二假定表位；
[0031]圖3是Bet vl的36個(gè)同種型的氨基酸序列比對(duì)；
[0032]圖4是用于產(chǎn)生重組過(guò)敏原的細(xì)菌表達(dá)單位的示意圖,其中Ptac是啟動(dòng)子，PelB SS是連接于重組過(guò)敏原的編碼區(qū)的信號(hào)序列，星號(hào)顯示氨基酸置換位置；
[0033]圖5顯示實(shí)施例2中使用的Bet vl野生型多肽(A)、S99Y多肽⑶、K137多肽(C) 和ElOlK多肽的核酸序列(SEQ ID N01-3)；
[0034]圖6顯示重組Bet vl、Bet vlS99Y和ElOlK多肽對(duì)血清IgE與Bet vl結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制；
[0035]圖7顯示利用重組Bet vUBet vlS99Y和K137Y多肽的組胺釋放實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；和
[0036]圖8顯示濃度為3 ii M的重組Bet vl野生型和重組Bet vl突變體ElOlK的天然 ESI FT-1CR 質(zhì)譜。
[0037]發(fā)明詳述
[0038]在下列描述、實(shí)施例和權(quán)利要求中，三字母和單字母代碼用于氨基酸。為了命名根據(jù)本發(fā)明的多肽中的氨基酸位置，使用下列代碼:S99表示位置99上的絲氨酸，然而S99Y 表示位置99上的絲氨酸被酪氨酸替代。
[0039]樺樹(shù)花粉過(guò)敏是過(guò)敏的非常常見(jiàn)的形式，白樺樹(shù)(撫皮樺(Betula verrucosa)) 的花粉是歐洲和北美的I型過(guò)敏反應(yīng)的主要原因之一。據(jù)估計(jì)約10-15%的人口可患有樺樹(shù)花粉過(guò)敏。此外，其它過(guò)敏原例如蘋(píng)果過(guò)敏原與樺樹(shù)花粉特異性IgE交叉反應(yīng)，從而即使當(dāng)受試者未接觸`花粉時(shí)亦引起過(guò)敏反應(yīng)。
[0040]Bet vl是樺樹(shù)花粉的主要過(guò)敏原,其在超過(guò)95%的樺樹(shù)花粉過(guò)敏性受試者中負(fù)責(zé) IgE結(jié)合。Bet vl是具有17kD的分子量的蛋白質(zhì)。野生型Bet vl的氨基酸序列示于SEQ ID NO:4中。WHO過(guò)敏原網(wǎng)站(www.allergen, org)列出了 Bet vl的三十六個(gè)(36)同種型，圖3顯示了所述同種型的序列比對(duì)。比對(duì)顯示Bet vl是高度保守的。在本發(fā)明中用作野生型Bet vl的同種型是同種型Bet via (Bet vl.0101),但這些異構(gòu)過(guò)敏原的任一種均可用于提供根據(jù)本發(fā)明的低過(guò)敏原性變體。野生型序列(SEQ ID NO:4)意欲包括全部Bet vl同種型序列。
[0041]全部36個(gè)Bet vl同種型的氨基酸序列如下分別地公開(kāi)于序列表中:1.0101 (SEQ ID NO:4)、1.0102 (SEQ ID NO: 5)、1.0103 (SEQ ID NO:6)、1.2501 (SEQ ID NO:7),1.1501 (SEQ ID N0:8)、1.1502 (SEQ ID NO:9)、1.2801 (SEQ ID NO:10)、1.3001 (SEQ ID NO:11), 1.2901 (SEQ ID NO: 12)、1.2301 (SEQ ID NO:13)、1.0501 (SEQ ID NO:14)、1.0601 (SEQ ID NO:15)、1.0602(SEQ ID NO:16)、1.0801 (SEQ ID NO:17)、1.1701 (SEQ ID NO:18), 1.0401 (SEQ ID NO:19),1.04020801 (SEQ ID NO:20)、1.07010801 (SEQ ID N0:21)、 1.10010801 (SEQ ID NO:22)、1.24010801(SEQ ID NO:23)、1.26010801 (SEQ ID NO:24)、 1.27010801(SEQ ID NO:25)、1.22010801(SEQ ID NO:26)、1.02010801(SEQ ID NO:27)、 1.09010801(SEQ ID NO:28)、1.03010801 (SEQ ID NO:29)、1.14010801(SEQ ID NO:30)、 1.14020801(SEQ ID NO:31)、1.19010801(SEQ ID NO:32)、1.20010801 (SEQ ID NO:33)、 1.18010801(SEQ ID NO:34)、1.11010801(SEQ ID NO:35)、1.12010801(SEQ ID NO:36)、1.16010801(SEQ ID NO:37)、1.21010801(SEQ ID NO:38)和 1.13010801(SEQ ID NO:39)。
[0042]Bet vl的同種型包括具有不同的致敏性潛能的變體。Bet vl的同種型與SEQ IDN0:4的Bet vl野生型氨基酸序列具有至少94%的同一性。例如，與Bet vl.0101具有96%的氨基酸殘基同一性的同種型Bet vl.0401和與Bet vl.0101具有至少94%的殘基同一性的Bet vl.1001已被鑒定為天然低過(guò)敏原，因?yàn)樗鼈兪墙橘|(zhì)釋放的弱誘導(dǎo)物。
[0043]本發(fā)明提供了 Bet Vl的突變的低過(guò)敏原性變體，其用作疫苗用于免疫接種有此需要的受試者，從而預(yù)防和/或減輕過(guò)敏和使患有樺樹(shù)花粉過(guò)敏的受試者脫敏。根據(jù)本發(fā)明的重組樺樹(shù)花粉Bet vl多肽具有突變的野生型氨基酸序列從而在選自氨基酸殘基E101、K137、S99、K80、N82、S84、S117、K119、T7、T9、V133、E141 和 R145 的位置上包含至少一個(gè)氨基酸置換。根據(jù)本發(fā)明的多肽是低過(guò)敏原性的，并且當(dāng)與未突變的Bet vl野生型的組胺釋放能力相比較時(shí)顯示降低至少20倍，優(yōu)選100倍的組胺釋放能力。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的低過(guò)敏原性多肽可用作抗過(guò)敏特別是樺樹(shù)花粉過(guò)敏的疫苗。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)制藥方案配制包含根據(jù)本發(fā)明的多肽的疫苗。根據(jù)本發(fā)明的疫苗特別適合于舌下施用。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物包含至少一種本發(fā)明的重組低過(guò)敏原性Bet vl多肽和至少一種藥學(xué)上可接受的稀釋劑或佐劑例如鹽水、緩沖液、氫氧化鋁等。
[0045]根據(jù)本發(fā)明的低過(guò)敏原性變體通過(guò)突變位于Bet vl的表位表面上的一些(1-5)特定氨基酸殘基(例如具有大側(cè)鏈的殘基)而獲得。選擇的氨基酸殘基是其側(cè)鏈向外指向溶劑的那些氨基酸殘基。突變此類殘基導(dǎo)致過(guò)敏原的基本三維結(jié)構(gòu)的最小改變。優(yōu)選地，然而，誘變修飾表位表面的程度使得肥大細(xì)胞表面上的IgE抗體的結(jié)合和交聯(lián)被阻止或強(qiáng)烈減少，然而變體的總體結(jié)構(gòu)仍然與野生型過(guò)敏原的總體結(jié)構(gòu)十分相似。這樣的突變有利于IgG和具有結(jié)合野生型過(guò)敏原和突變體變體過(guò)敏原的能力的其它保護(hù)性抗體的誘導(dǎo)。突變的作用被確定為過(guò)敏原特異性IgE抗體對(duì)經(jīng)修飾的Bet vl過(guò)敏原的更低親和力。優(yōu)選地，突變使特異性IgE抗體的親和力減小至少20倍，更優(yōu)選20-100倍，最優(yōu)選超過(guò)100倍。所產(chǎn)生的經(jīng)修飾的Bet vl過(guò)敏原`可用于誘發(fā)過(guò)敏性患者對(duì)樺樹(shù)花粉的耐受性。
[0046]可用于過(guò)敏原特異性脫敏的根據(jù)本發(fā)明的低過(guò)敏原性變體多肽具有兩個(gè)特征:1)強(qiáng)力減弱IgE介導(dǎo)的反應(yīng)的能力；和2)保持的野生型3D折疊，從而保持誘導(dǎo)能夠結(jié)合wt過(guò)敏原的IgG抗體的產(chǎn)生的能力。
[0047]IgE結(jié)合表位的結(jié)構(gòu)的知識(shí)將極大地簡(jiǎn)化低過(guò)敏原性變體的設(shè)計(jì)。然而，與IgE抗體復(fù)合的Bet vl的結(jié)構(gòu)不幸地是不可獲得的。在表位掃描中使用肽也是不可靠的并且實(shí)際上僅當(dāng)掃描線性表位時(shí)才有用(Niemi等人，Structure2007 (15): 1413-21)。單個(gè)肽的構(gòu)象以及物理性質(zhì)例如溶解度可與形成天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多肽鏈的對(duì)應(yīng)部分的構(gòu)象以及物理性質(zhì)顯著不同。因此，突變體Bet vl過(guò)敏原的設(shè)計(jì)是基于使用分子圖形學(xué)程序例如PyMOL的分子表面分析，以通過(guò)制備和測(cè)試突變體來(lái)闡明表位的結(jié)構(gòu)和測(cè)試潛在命中。
[0048]Bet vl(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)代碼1BV1)的晶體結(jié)構(gòu)用于定義Bet vl的四級(jí)結(jié)構(gòu)。TOBePISA互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器用于建立Bet vl的對(duì)稱二聚體的坐標(biāo)。據(jù)估計(jì)肥大細(xì)胞表面上的簇中的IgE抗體之間的距離為約5nm(KnoI, EF ;Mol.Nutr.Res.50 (2006):620)。通過(guò)研究距離對(duì)稱軸2.5nm內(nèi)的圍繞二重對(duì)稱軸的Bet vl 二聚體的分子表面，在Bet vl的分子表面上鑒定了兩個(gè)假定的表位(圖1和圖2)。
[0049]假定的表位I 由氨基酸殘基 V2-E6 ；R70-D75 ;N78_S84 ;E96_K103 和 K115-H121 構(gòu)成，而假定的表位2由氨基酸殘基F3-V12 ；A130-L152和T107-D109構(gòu)成。
[0050]仔細(xì)分析這些假定的表位，以鑒定可作為突變點(diǎn)的氨基酸殘基。優(yōu)選的突變點(diǎn)應(yīng)當(dāng)具有減小過(guò)敏原對(duì)IgE抗體的結(jié)合但仍然維持野生型過(guò)敏原的三維結(jié)構(gòu)的能力。第一假定表位包括氨基酸殘基K80、N82、S84、S99、E101、S117和K119。第二假定表位包括殘基17、 T9、V133、K137、E141和R145。殘基S99、ElOlK和K137被認(rèn)為是最有趣的突變點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兾挥趦蓚€(gè)假定表位的中心。
[0051]這3個(gè)殘基在Bet vl的全部36個(gè)同種型中是高度保守的，唯一的變化是殘基99， 其存在為絲氨酸(在24個(gè)同種型中)或半胱氨酸(在12個(gè)同種型中)。殘基80、84、119、 141和145是保守的，然而殘基82、117、7、9、133略微變化，如圖3中顯示的。
[0052]下一步驟是選擇每一個(gè)殘基的適當(dāng)突變。作為實(shí)例，S99 (在表位I中)是小的親水性和中性氨基酸殘基。將干擾IgE結(jié)合的突變從而具有“相反的”性質(zhì)，即大的和/或帶電荷的，例如Phe、Asp、Glu、Lys、Arg、Tyr、His或Trp。類似地,表位I中的ElOl可被帶相反電荷的殘基(Lys，Arg)或疏水性殘基(Tyr，Trp，Phe，Val，Ile或Leu)替代。作為第二實(shí)例，K137(表位2中的)的側(cè)鏈?zhǔn)情L(zhǎng)的，柔性和帶正電荷的。至更小的殘基的突變不可能是有幫助的，因?yàn)槠溆捎谧杂煽臻g的原因不會(huì)阻止對(duì)抗體的結(jié)合。K137從而被帶負(fù)電荷的殘基Asp、Glu或剛性大的殘基例如Trp、Tyr、Phe、Ile或Met置換。
[0053]可相應(yīng)地分別設(shè)計(jì)殘基1(80、胳2、5843101、5117和K119以及殘基17、T9、V133、 E141和R145上的置換。表1列出了潛在的置換，所述置換可產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的Bet vl低過(guò)敏原性突變體。
[0054]表1
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種基于SEQ ID NO:4中所示的野生型氨基酸序列或任何其它Bet vl野生型同種型的重組樺樹(shù)花粉Bet vl多肽，所述多肽在選自氨基酸殘基101、137、99、80、82、84、117、119、7、9、133、141和145的位置上包含至少一個(gè)氨基酸置換。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列選自SEQID N0:4至39。
3.權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述多肽包含選自SEQID N0:41-53的氨基酸序列或其同種型。
4.權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽包含選自如下序列的氨基酸序列: SEQ ID N0:41，其中氨基酸101是K， SEQ ID NO:42，其中氨基酸137是K， SEQ ID NO:43，其中氨基酸99是K， SEQ ID NO:44，其中氨基酸80是Y， SEQ ID NO:45，其中氨基酸82是K， SEQ ID NO:46，其中氨基酸84是K， SEQ ID NO:47，其中氨基酸117是K， SEQ ID N0:48，其中氨基酸119是E， SEQ ID N0:49，其中氨基酸7是E， SEQ ID NO: 50，其中氨基酸9是E， SEQ ID NO:51，其中氨基酸133是Y， SEQ ID NO: 52，其中氨基酸141是K，和 SEQ ID NO: 53，其中氨基酸145是Y， 或它們的同種型。
5.權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)的多肽，其中所述氨基酸置換位于氨基酸位置101、137或99上。
6.權(quán)利要求5的多肽，其中S99被酪氨酸替代。
7.權(quán)利要求5的多肽，其中K137被酪氨酸替代。
8.權(quán)利要求5的多肽，其中ElOl被賴氨酸替代。
9.權(quán)利要求1-8的任一項(xiàng)的多肽，其具有當(dāng)與野生型Betvl的組胺釋放能力相比較時(shí)降低至少20倍的組胺釋放能力。
10.權(quán)利要求9的多肽，其中組胺釋放能力的降低為至少100倍。
11.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的多肽，其中總共存在至少2、3或4個(gè)氨基酸置換。
12.一種包含至少一種權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)的低過(guò)敏原性多肽的疫苗。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的疫苗，其特征在于所述疫苗用于舌下施用。
14.基于SEQID NO:4中所示的野生型氨基酸序列或其任何Bet vl野生型變體的重組樺樹(shù)花粉Bet vl多肽的作為疫苗的用途，所述多肽在選自氨基酸殘基ElOl、K137、S99、K80、N82、S84、S117、K119、T7、T9、V133、E141和R145的位置上包含至少一個(gè)氨基酸置換。
15.一種抵抗樺樹(shù)花粉過(guò)敏而進(jìn)行免疫接種的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用組合物，所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)的至少一種低過(guò)敏原性多肽和至少一種藥學(xué)上可接受的 佐劑。
16.一種基于SEQ ID NO: 4中所示的野生型氨基酸序列或任何其它Bet vl野生型同種型的重組樺樹(shù)花粉Bet vl多肽，所述多肽在選自氨基酸殘基101、137、99、80、82、84、117、`119、7、9、133、141和145的位置上包含至少一個(gè)氨基酸置換，所述多肽用作疫苗。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK103562388SQ201280023847
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月18日
【發(fā)明者】K·塔基寧, M·L·勞卡寧, H·瑟德隆德, S·于爾海, H·霍爾克里, M·尼米, J·羅威寧 申請(qǐng)人:國(guó)家技術(shù)研究中心Vtt