專利名稱：表面修飾氨基苯硼酸的納米碳材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于無(wú)機(jī)材料和生物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及表面修飾氨基苯硼酸的納米碳材料及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)組學(xué)的核心在于大規(guī)模地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行綜合分析，通過(guò)對(duì)某種物種、個(gè)體、器官、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)性質(zhì)(其中包括表達(dá)水平、結(jié)構(gòu)、分布、功能、豐度變化、翻譯后修飾、細(xì)胞內(nèi)定位、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用、蛋白質(zhì)與疾病的相關(guān)性)的研究，對(duì)蛋白功能做出精細(xì)和準(zhǔn)確的闡述。其中翻譯后修飾蛋白質(zhì)的變化往往具有重要生理功能因而進(jìn)行翻譯后修飾蛋白質(zhì)的分析鑒定是生物分析領(lǐng)域熱點(diǎn)問(wèn)題。糖蛋白是一類由糖類和蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵連接而成的結(jié)合的功能蛋白。糖鏈不僅改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，而且導(dǎo)致蛋白功能發(fā)生改變。糖基化對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸、定位起著重要作用，并參與受體激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多重要的生物進(jìn)程。同時(shí)臨床的生物標(biāo)志物及治療的靶標(biāo)都是糖蛋白。研究表明，大多數(shù)糖蛋白是低豐度的蛋白質(zhì)，因而很難被質(zhì)譜選中進(jìn)行分析。此外，非糖蛋白/非糖肽的離子化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于糖蛋白/糖肽，它們的大量存在，導(dǎo)致復(fù)雜體系中糖蛋白/糖肽的信號(hào)被嚴(yán)重抑制，大大降低了被鑒定的可能性。因此作為分析和鑒定糖蛋白的前提和基礎(chǔ)，如何快速分離和富集糖蛋白越來(lái)越成為制約其檢測(cè)和鑒定的關(guān)鍵步驟。目前已有的糖基化肽段富集方法主要有以下幾種凝集素親和色譜法、體積排阻色譜法、親水色譜法、肼腙反應(yīng)法和硼酸富集法。近來(lái)發(fā)展的硼酸富集法基于堿性條件下，硼酸可以和糖鏈的順式鄰二醇結(jié)合形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，而在酸性條件下又可以可逆地將完整的糖蛋白/糖肽洗脫，因此具有廣泛的適用性。近年來(lái)，納米碳材料以其發(fā)展快速和應(yīng)用潛力而被越來(lái)越多的應(yīng)用于生物領(lǐng)域。因此發(fā)展一種簡(jiǎn)單、有效地分離富集糖蛋白/糖肽的方法成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要分支。納米碳材料以其粒徑小、良好的生物兼容性、高比表面積、表面易于功能化修飾的特點(diǎn)為其應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析中痕量肽段的分離富集方法提供了可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種易于合成、 特異性好，能對(duì)糖蛋白/糖肽進(jìn)行分離富集的表面修飾硼酸的納米碳材料。本發(fā)明還提供上述表面修飾硼酸納米碳材料的制備方法。本發(fā)明進(jìn)一步還提供上述納米碳材料的應(yīng)用。本發(fā)明是在原有納米碳材料經(jīng)酸化處理的基礎(chǔ)上，通過(guò)碳化二亞胺反應(yīng)，首先將其表面進(jìn)行多聚賴氨酸(PU以及聚乙二醇二甘醇酸(PEG)的修飾，再與氨基苯硼酸(APBA)反應(yīng)，進(jìn)行納米碳材料表面功能化修飾，得到表面修飾硼酸基團(tuán)的納米碳材料。本發(fā)明通過(guò)下述方法和步驟制備所述的表面修飾硼酸基團(tuán)的納米碳材料(1)對(duì)納米碳材料進(jìn)行預(yù)處理l_5g納米碳材料經(jīng)超聲分散于10_50mLH2SO4/HNO3 (H2SO4 =HNO3= 9:1-8:2 (v/v))溶液中，室溫?cái)嚢?2-24小時(shí)，用清水洗至中性；置于0. 1-0. 5M NaOH水溶液中，于90_95°C攪拌2-4小時(shí)，用清水清洗；至于0. 1-0. 5M HCl溶液中，于90-95°C攪拌2-4小時(shí)，清水洗凈，干燥后得酸化/活化納米碳材料；以上處理過(guò)程使其表面產(chǎn)生羧基官能團(tuán)；
(2)將0.5-lg酸化/活化納米碳材料分散于溶解5-10mL 60-80mg/mL N-羥基丁二酰亞胺的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液；超聲波分散2-5分鐘，隨后將5-10mL 60-80mg/mLN-乙基二甲氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽快速加入，繼續(xù)超聲分散10-30min，反應(yīng)結(jié)束，離心收集納米碳材料，棄去上清，并用2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液沖洗多次；
(3)將活化的納米碳材料繼續(xù)分散于8-10mL2%-10%多聚賴氨酸(Mw，500_17，000)的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液中，并充分混旋振蕩，反應(yīng)3-12h ;待反應(yīng)結(jié)束離心收集，并清洗多聚賴氨酸修飾后的納米碳材料；
(4)將0.2-1. Og聚乙二醇二甘醇酸溶解于5-10mL 60-80mg/mL N-輕基丁二酰亞胺的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液 ；超聲波分散2-5分鐘，隨后將5-10mL 60-80mg/mL N-乙基二甲氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽快速加入，繼續(xù)超聲10-30min，隨后將活化后的聚乙二醇二甘醇酸以及l(fā)_2mL 10-20mg/mL氨基苯硼酸迅速加入多聚賴氨酸修飾納米碳材料中，超聲分散，4-10°C反應(yīng)過(guò)夜12-16小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束，離心收集表面修飾硼酸基團(tuán)的納米碳材料使用超純水充分清洗后，將其干燥，備用。步驟(I)中，所述的納米碳材料可以為納米金剛石、碳納米管、石墨烯、富勒烯材料，優(yōu)選為納米金剛石。步驟(2) - (4)中，所述的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液可以為磷酸鹽緩沖液。步驟(2)和(4)中，N-羥基丁二酰亞胺的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液，其濃度可為100-200mM, pH可為6—6. 5，例如為6.1等；
步驟(3)中，所述多聚賴氨酸為分子量在5-15萬(wàn)。步驟(4)中，所述聚乙二醇二甘醇酸為分子量在200-2萬(wàn)。本發(fā)明方法制備得到的表面修飾硼酸基團(tuán)的納米碳材料，具有下式的結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種表面修飾硼酸基團(tuán)的納米碳材料的制備方法，其特征在于具體步驟為(1)對(duì)納米碳材料進(jìn)行預(yù)處理l-5g納米碳材料經(jīng)超聲分散于10-50mL&504/!^03溶液中，室溫?cái)嚢?2-24小時(shí)，用清水洗至中性，H2S04/HN03溶液中H2SO4 =HNO3= 9:1-8:2 (v/ V);置于O. 1-0. 5M NaOH水溶液中，于90_95°C攪拌2-4小時(shí)，用清水清洗；置于O. 1-0. 5M HCl溶液中，于90-95°C攪拌2-4小時(shí)，清水洗凈，干燥后得酸化/活化納米碳材料；以上處理過(guò)程使其表面產(chǎn)生羧基官能團(tuán)；(2)將O.5-lg酸化/活化納米碳材料分散于溶解5-10mL 60-80mg/mL N-羥基丁二酰亞胺的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液；超聲波分散2-5分鐘，隨后將5-10mL 60-80mg/mL N-乙基二甲氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽快速加入，繼續(xù)超聲分散10-30min，反應(yīng)結(jié)束，離心收集納米碳材料，棄去上清，并用2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液沖洗多次；(3)將活化的納米碳材料繼續(xù)分散于8-10mL2%-10%多聚賴氨酸的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液中，并充分混旋振蕩，反應(yīng)3-12h ;待反應(yīng)結(jié)束離心收集，并清洗多聚賴氨酸修飾后的納米碳材料；(4)將O.2-1. Og聚乙二醇二甘醇酸溶解于5-10mL 60-80mg/mL N-輕基丁二酰亞胺的 2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液；超聲波分散2-5分鐘，隨后將5-10mL 60-80mg/mL N-乙基二甲氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽快速加入，繼續(xù)超聲10-30min，隨后將活化后的聚乙二醇二甘醇酸以及l(fā)_2mL 10-20mg/mL氨基苯硼酸迅速加入多聚賴氨酸修飾納米碳材料中，超聲分散，4-10°C反應(yīng)過(guò)夜12-16小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束，離心收集表面修飾硼酸基團(tuán)的納米碳材料使用超純水充分清洗后，將其干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面修飾硼酸基團(tuán)的納米碳材料的制備方法，其特征在于步驟(I)中，所述的納米碳材料為納米金剛石、碳納米管、石墨烯或富勒烯材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面修飾硼酸基團(tuán)的納米碳材料的制備方法，其特征在于步驟(2) - (4)中，所述的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面修飾硼酸基團(tuán)的納米碳材料的制備方法，其特征在于步驟(2)和(4)中，N-羥基丁二酰亞胺的2- (N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液，其濃度為100-200mM， pH 為 6—6. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面修飾硼酸基團(tuán)的納米碳材料的制備方法，其特征在于步驟(3)中，所述多聚賴氨酸為分子量在5-15萬(wàn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面修飾硼酸基團(tuán)的納米碳材料的制備方法，其特征在于步驟(4)中，所述聚乙二醇二甘醇酸為分子量在200-2萬(wàn)。
7.由權(quán)利要求1-6之一所述方法制備得到的表面修飾硼酸基團(tuán)的納米碳材料，具有下式的結(jié)構(gòu)
8.權(quán)利要求1所述的表面修飾硼酸納米碳材料在制備特異性分離富集糖蛋白和糖月太中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于無(wú)機(jī)材料和生物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種表面修飾氨基苯硼酸的納米碳材料及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明是在原有納米碳材料經(jīng)酸化處理的基礎(chǔ)上，通過(guò)碳化二亞胺反應(yīng)，首先將其表面進(jìn)行多聚賴氨酸以及聚乙二醇二甘醇酸修飾后，再與氨基苯硼酸反應(yīng)進(jìn)行納米碳材料表面功能化修飾。本發(fā)明的合成方法簡(jiǎn)單有效，制備的氨基苯硼酸功能化納米碳材料作為納米吸附劑，比表面積大，選擇特異性強(qiáng)，在水溶液中具有較好的分散性和穩(wěn)定性，可快速實(shí)現(xiàn)糖肽/糖蛋白的特異性分離富集。該材料在糖蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域中具有良好的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N9/08GK103043647SQ20121057354
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者魏黎明, 徐國(guó)賓, 張偉, 陸豪杰, 楊芃原 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)