突變型TNF-α基因和提高抗原TNF-α基因表達(dá)量的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了堿基組成如SEQ?ID?NO?7所示的突變型TNF-α基因和抗原TNF-α基因表達(dá)的方法，包括以下步驟：以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆為模板，以引物SEQ?ID?NO?1和SEQ?ID?NO?2進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物T1；以引物SEQ?ID?NO?3和SEQ?ID?NO?4進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物T2；以擴(kuò)增產(chǎn)物T1和T2為模板，以SEQ?ID?NO?1和SEQ?ID?NO?4為引物，進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，得到突變型TNF-α基因；雙酶切突變型TNF-α基因后，插入pET28a表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌；誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到TNF-α蛋白。本發(fā)明將TNF-α基因中兩對(duì)相距較近的大腸桿菌稀有密碼子突變?yōu)榇竽c桿菌偏愛(ài)密碼子，密碼子優(yōu)化后的TNF-α基因表達(dá)量提高了至少1.5倍。
【專(zhuān)利說(shuō)明】突變型TNF-α基因和提高抗原TNF-α基因表達(dá)量的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是涉及一種突變型TNF-α基因和提高抗原TNF-α基因表達(dá)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤壞死因子a (Tumor necrosis factor a,TNF_a)是一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生。體內(nèi)TNF-α蛋白有跨膜型TNF-α和分泌型TNF-α。跨膜TNF-α全長(zhǎng)233個(gè)氨基酸，其中1-76位氨基酸是信號(hào)肽(包括跨膜氨基酸)，77-233氨基酸是胞外段。第77-233個(gè)氨基酸也是分泌型TNF-α的氨基酸序列，其大小為17KD，以三聚體形式與細(xì)胞表面的TNF受體(TNFR)結(jié)合，介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)。
[0003]TNF-α是迄今發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子，但TNF-α在體內(nèi)的大量產(chǎn)生和釋放則會(huì)破壞機(jī)體的免疫平衡與其他炎癥因子一起產(chǎn)生多種病理?yè)p傷。在許多疾病，如心血管疾病、惡病質(zhì)和敗血癥休克所致的多器官功能衰竭、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)、炎癥性腸病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血紊亂綜合征(MDS)等的病理生理過(guò)程中TNF-α起著重要的介質(zhì)作用。臨床上，抗TNF-α的治療性抗體被成功用于治療RA、Crohn’ s病，同時(shí)研究表明其對(duì)牛皮癬和強(qiáng)直性脊髓炎也具有肯定的療效。
[0004]目前上市的TNF-α單抗藥物主要有兩個(gè):Inf Iiximab (英夫利昔單抗，商品Remicade)和adalimumab (阿達(dá)木單抗，商品名Humira)。Infliximab是人鼠嵌合單抗，其中約25 %為鼠源VH、VL區(qū)，75 %為人源CHl和Fe恒定區(qū)序列，主要用于治療克羅恩病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎。Infliximab為瑞士 Cilag AG公司生產(chǎn)，在中國(guó)由西安楊森公司負(fù)責(zé)上市。其2011年全球銷(xiāo)售額為65億美元。制備Infliximab的抗原為人的分泌型 TNF-α 蛋白(Knight D et al.Molecular Immunology.1993),來(lái)源為大腸桿菌表達(dá)的重組TNF- α。人的分泌型TNF- α基因共477bp，編碼157個(gè)氨基酸，存在多個(gè)大腸桿菌稀有密碼子，其中在基因7-21bp和300-312bp中有兩對(duì)相距較近的稀有密碼子，嚴(yán)重制約TNF-α基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)。
[0005]制備抗TNF-a的單克隆抗體所需要的抗原TNF-α量比較大，往往達(dá)數(shù)毫克以上。目前商品化的蛋白TNF-a非常昂貴，價(jià)格超過(guò)70元/μ g,而實(shí)驗(yàn)室用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)TNF- α的效率并不高，亟需創(chuàng)新性思維提高人TNF-α基因的表達(dá)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]基于此，本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種抗原TNF-a基因表達(dá)的方法，該方法能提高TNF- α基因的表達(dá)量。
[0007]解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下。
[0008]一種抗原T NF-a基因表達(dá)的方法，包括以下步驟:[0009]NCOI和HindIII雙酶切堿基組成如SEQ ID N0.7所示的突變型TNF- α基因后，分別插入同樣雙酶切的pET28a表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 ;誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到TNF-α蛋白。
[0010]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述突變型TNF-α基因可以通過(guò)以下步驟制備得到:
[0011](I)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆為模板，以引物SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2進(jìn)行擴(kuò)增，得到突變型TNF-α基因第l-321bp核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物Tl ；
[0012](2)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆為模板，以引物SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4進(jìn)行擴(kuò)增，得到突變型TNF-α基因第280-474bp核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物T2 ；
[0013](3)以擴(kuò)增產(chǎn)物Tl和T2為模板，以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.4為引物，進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，得到所述突變型TNF-α基因。
[0014]本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供一種突變型TNF-α基因，該基因可用于抗原TNF-α的表達(dá)方法中，提高TNF-α蛋白的表達(dá)量。
[0015]解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下。
[0016]堿基組成如SEQ ID N0.7所示的突變型TNF- α基因。
[0017]本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供一種上述突變型TNF-α基因的制備方法。 [0018]一種突變型TNF-α基因的制備方法，包括以下步驟:
[0019](I)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆為模板，以引物SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2進(jìn)行擴(kuò)增，得到突變型TNF-α基因第l-321bp核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物Tl ；
[0020](2)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆為模板，以引物SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4進(jìn)行擴(kuò)增，得到突變型TNF-a基因第280-474bp核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物T2 ；
[0021](3)以擴(kuò)增產(chǎn)物Tl和T2為模板，以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.4為引物，進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，得到堿基組成如SEQ ID N0.7所示突變型TNF-a基因。
[0022]在其中一個(gè)實(shí)施例中，上述重疊PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:
[0023]PrimerSTAR 2.5U/ul, Polymerase:0.5±0.05ul ；
[0024]100ng/ul，擴(kuò)增產(chǎn)物 Tl:3±0.5ul ；
[0025]100ng/ul，擴(kuò)增 T2:3±0.5ul ；
[0026]2.5mM dNTP:4±0.5ul ;
[0027]5χ PrimerSTAR Buffer:10±0.5ul
[0028]IOuM, SEQ ID NO 1:l±0.05ul
[0029]IOuM, SEQ ID NO 4:1±0.05ul
[0030]加H2O至總量為50ul。
[0031]在其中一個(gè)實(shí)施例中，上述重疊PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?
[0032]94°C,3min ；
[0033]94°C:30s ；
[0034]55 °C: Imin ；
[0035]72°C:40s ；
[0036]72°C: IOmin ；
[0037]循環(huán)數(shù)35±2。[0038]為了獲得足夠的抗原TNF-α免疫小鼠制備抗TNF-α單抗，本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)含有點(diǎn)突變的突變引物和重疊PCR等方法，將TNF- α基因中兩對(duì)相距較近的大腸桿菌稀有密碼子突變?yōu)榇竽c桿菌偏愛(ài)密碼子。簡(jiǎn)單的密碼子優(yōu)化后得到的突變型TNF-α基因插入pET28a表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，密碼子優(yōu)化后的TNF- α基因表達(dá)量提高了至少
1.5 倍。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1為野生型和突變型TNF-α基因的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示意圖；其中M:Marker ；1:野生型TNF-α基因；2:突變型TNF-α基因；
[0040]圖2為實(shí)施例1的野生型TNF- α基因和突變型TNF- α基因的序列比對(duì)結(jié)果示意圖；
[0041]圖3為實(shí)施例1的SDS-PAGE分析兩種轉(zhuǎn)化菌TNF-α表達(dá)的情況示意圖，其中，M:Marker ；1:突變型TNF-α基因轉(zhuǎn)化菌；2:野生型TNF-α基因轉(zhuǎn)化菌。
【具體實(shí)施方式】
[0042]為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。
[0043]實(shí)施例1
[0044]本發(fā)明通過(guò)突變引物和重疊PCR等方法，把人的分泌型TNFa基因第三個(gè)精氨酸、第101個(gè)脯氨酸和第104個(gè)精氨酸的大腸桿菌稀有密碼子突變?yōu)榇竽c桿菌偏愛(ài)密碼子，成功提高TNF- α產(chǎn)量1.57倍，具體方法如下:
[0045](I)設(shè)計(jì)和合成擴(kuò)增突變型TNF- α基因的含有NCOI酶切位點(diǎn)(下劃線)和點(diǎn)突變(斜體堿基)的突變引物
【權(quán)利要求】
1.一種抗原TNF-α基因表達(dá)的方法，其特征是，包括以下步驟: NCOI和HindIII雙酶切堿基組成如SEQ ID N0.7所示的突變型TNF-α基因后，插入同樣雙酶切的pET28a表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌；誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到TNF-α蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗原TNF-α基因表達(dá)的方法，其特征是，所述突變型TNF- α基因通過(guò)以下步驟制備得到: (1)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆為模板，以引物SEQID N0.1和SEQID N0.2進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物Tl ； (2)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆為模板，以引物SEQ ID N0.3和SEQID N0.4進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物T2 ； (3)以擴(kuò)增產(chǎn)物Tl和T2為模板，以SEQID N0.1和SEQ ID N0.4為引物，進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，得到所述突變型TNF- α基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗原TNF-α基因表達(dá)的方法，其特征是，所述大腸桿菌是大腸桿菌BL21。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗原TNF-α基因表達(dá)的方法，其特征是，所述重疊PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:
PrimerSTAR 2.5U/ul, Polymerase:0.5±0.05ul ； 100ng/ul，擴(kuò)增產(chǎn)物 Tl:3±0.5ul ；
100ng/ul，擴(kuò)增 T2:3±0.5ul ；
2.5mM dNTP:4±0.5ul ；
5x PrimerSTAR Buffer:10 ±0.5ul
IOuM, SEQ ID NO 1:1±0.05ul
IOuM, SEQ ID NO 4:1±0.05ul
加H2O至總量為50ul。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗原TNF-α基因表達(dá)的方法，其特征是， 所述重疊PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?
94°C, 3min ；
94°C:30s ；
55 °C:lmin ；
72°C:40s ；
72°C: IOmin ； 循環(huán)數(shù)35±2。
6.堿基組成如SEQID N0.7所示的突變型TNF-α基因。
7.一種突變型TNF-α基因的制備方法，其特征是，包括以下步驟: (1)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆為模板，以引物SEQID N0.1和SEQ ID N0.2進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物Tl ； (2)以人分泌型TNF-α基因cDNA克隆為模板，以引物SEQID NO 3和SEQ ID NO 4進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物T2 ； (3)以擴(kuò)增產(chǎn)物Tl和T2為模板，以SEQID N0.1和SEQ ID N0.4為引物，進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，得到堿基組成如SEQ ID N0.7所示的突變型TNF-α基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征是，所述重疊PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:PrimerSTAR 2.5U/ul, Polymerase:0.5±0.05ul ；.100ng/ul，擴(kuò)增產(chǎn)物 Tl:3±0.5ul ；.100ng/ul，擴(kuò)增 T2:3±0.5ul ；.2.5mM dNTP:4±0.5ul ；.5x PrimerSTAR Buffer:10±0.5ul.10uM, SEQ ID NO 1:1±0.05ul.10uM, SEQ ID NO 4:1±0.05ulWH2O至總量為50ul。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征是，所述重疊PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?.94°C, 3min ；.94°C:30s ；.55 °C:lmin ；.72°C:40s ；.72°C: 10min ；循環(huán)數(shù)35±2。
【文檔編號(hào)】C12N15/67GK103898144SQ201210572674
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月25日
【發(fā)明者】萬(wàn)曉春, 李俊鑫, 任曉虎, 王蒲 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院