專利名稱：一株氧化葡糖酸桿菌工程菌及其構(gòu)建方法和在制備木糖醇中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株氧化葡糖酸桿菌工程菌及其構(gòu)建方法和在制備木糖醇中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木糖醇由于其甜度與蔗糖相當(dāng)，可抑制形成齲齒的變形桿菌活力，代謝不依賴胰島素，并有降低血脂、抗酮體等功能而備受到越來越多的重視。木糖醇是一種優(yōu)良的功能性甜味劑和重要的平臺化合物，在食品、醫(yī)藥、國防和輕工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。據(jù)預(yù)測，國際市場上木糖醇總需求量將達(dá)10萬噸以上，市場缺口高達(dá)40%，可見市場發(fā)展空間極大。 目前工業(yè)上主要采用化學(xué)法生產(chǎn)木糖醇，該工藝以玉米芯為原材料，經(jīng)過酸水解后分離得到木糖，然后利用化學(xué)加氫獲得木糖醇。該合成工藝對資源和能源消耗大、環(huán)境污染極為嚴(yán)重，不符合當(dāng)前提倡的綠色環(huán)保可持續(xù)發(fā)展的生產(chǎn)理念。近年來以來源豐富價格低廉的葡萄糖為底物生產(chǎn)木糖醇引起人們的廣泛關(guān)注，但是到目前為止在自然界中還沒有發(fā)現(xiàn)直接發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)木糖醇的微生物。1969年，Onishi等首先報道了通過三步發(fā)酵將葡萄糖轉(zhuǎn)化為木糖醇。2000年前后Shunichi等提出通過兩步工藝將葡萄糖轉(zhuǎn)化為木糖醇，即首先利用酵母菌將葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿拉伯糖醇，之后利用氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)將D-阿拉伯糖醇氧化還原為木糖醇。葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的工藝已經(jīng)成熟，轉(zhuǎn)化率可達(dá)45%(理論轉(zhuǎn)化率50%)，而由于氧化葡萄糖酸桿菌轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇產(chǎn)木糖醇的低得率限制了該工藝的推廣。研究者發(fā)現(xiàn)D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化生成木糖醇是兩個酶催化的過程，第一個為G. oxydans細(xì)胞質(zhì)外膜上的D-阿拉伯糖醇脫氫酶，該酶快速的把D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化為D-木酮糖,轉(zhuǎn)化率接近100% ;第二個為木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase, XDH),該酶負(fù)責(zé)把前一步生成的木酮糖還原為木糖醇。由于XDH對NADH的專一輔酶依賴性，造成XDH催化木酮糖產(chǎn)木糖醇的效率低下，限制了催化轉(zhuǎn)化流程的高效運(yùn)轉(zhuǎn)。因此為XDH提供足量的輔酶成為解決這一難題的首選方案。如上說提到的氧化葡萄糖酸桿菌(G. oxydans)是一種專性好氧的革蘭氏陰性菌，屬于醋酸桿菌科(Acetobacterceae),其最大的特點(diǎn)是細(xì)胞質(zhì)外膜空間含有眾多脫氫酶,能夠不完全氧化一系列的醇及糖醇類化合物生成相應(yīng)的醛、酮或酸，產(chǎn)物不需要通過透膜運(yùn)輸而直接分泌到胞外，從而大大提高了氧化葡萄糖酸桿菌的工業(yè)應(yīng)用價值。氧化葡萄糖酸桿菌不存在糖酵解途徑，三羧酸循環(huán)途徑也不完整，導(dǎo)致了菌體細(xì)胞內(nèi)作為轉(zhuǎn)移磷酸化電子供體的還原力和輔酶NADH的濃度和總量偏低，進(jìn)而造成催化轉(zhuǎn)化過程中依賴輔酶NADH的XDH活力不高，木糖醇轉(zhuǎn)化率低下。研究發(fā)現(xiàn)作為氧化葡糖酸桿菌核心代謝的磷酸戊糖途徑可以促進(jìn)NADH的再生循環(huán)和積累，而與之相關(guān)的兩個關(guān)鍵酶分別由基因gox0145 (亦記做zwf)和goxl705 (或記做gnd)編碼，其中zwf合成的葡糖-6-磷酸脫氫酶G6PDH是整個途徑的限速酶與代謝閥門。這兩個酶都具有對NADP/NAD的雙輔酶依賴性，但是在氧化葡糖酸桿菌生理條件下，G6PDH傾向與依賴NADP產(chǎn)生NADPH，6P⑶H傾向于依賴輔酶NAD產(chǎn)生NADH。另有研究表明氧化葡糖酸桿菌胞內(nèi)存在可以將NADPH轉(zhuǎn)化為NADH由gox0310-0312編碼的氫轉(zhuǎn)移酶。以上所述是解決氧化葡糖酸桿菌催化制備木糖醇過程中的輔酶NADH不足的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗設(shè)計指南。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可以利用廉價輔底物產(chǎn)生充足輔酶供給的氧化葡糖酸桿菌工程菌。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述氧化葡糖酸桿菌工程菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述氧化葡糖酸桿菌工程菌的應(yīng)用。 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一株氧化葡糖酸桿菌工程菌，它是導(dǎo)入了葡糖6-磷酸脫氫酶基因gox0145與啟動子Ptufe的氧化葡糖酸桿菌，所述的葡糖6-磷酸脫氫酶基因gOX0145位于啟動子Ptufe的下游。本發(fā)明氧化葡糖酸桿菌工程菌是通過過量表達(dá)控制磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵限制酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6TOH)，提高該途徑的代謝通量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)輔酶NADH的循環(huán)再生其中，所述的葡糖6-磷酸脫氫酶基因gox0145的核苷酸序列如SEQ IDNo. I所示。其中，所述的啟動子PtufB是tufB基因(the elongation factor EF-Tu)的啟動子，核苷酸序列如SEQ IDNo. 2。其中，所述的氧化葡糖酸桿菌為氧化葡糖酸桿菌Gluconobacter oxydans NH_10。該菌株在中國專利CN101948878A中已經(jīng)公開，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號CGMCCNo. 2709，登記日期2008年10月14日。上述氧化葡糖酸桿菌工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟(I)設(shè)計引物克隆啟動子PtufB、葡糖6-磷酸脫氫酶基因gox0145 ；(2)將啟動子PtufB序列連接到廣宿主型表達(dá)載體上，以構(gòu)建帶有啟動子的表達(dá)載體；(4)將基因gox0145片段連接到啟動子的下游構(gòu)建重組表達(dá)載體；(4)將步驟(3)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化氧化葡糖酸桿菌即得重組的輔酶循環(huán)途徑加強(qiáng)型氧化葡糖酸桿菌菌株Gluconobacter oxydans pnadh_5。步驟(2)中，所述的廣宿主型表達(dá)載體為pBBRlMCS-5。本發(fā)明所述的工程菌的主要代謝途徑如圖4所示。上述氧化葡糖酸桿菌工程菌在轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇制備木糖醇中的應(yīng)用。具體方法是，將氧化葡糖酸桿菌工程菌經(jīng)種子培養(yǎng)后接種于搖瓶或發(fā)酵罐，發(fā)酵后離心收獲菌體；將所得菌體加入到D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化體系中，利用菌體靜息細(xì)胞實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇制備木糖醇。對于搖瓶轉(zhuǎn)化體系，D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化體系中，D-阿拉伯糖醇濃度為2(T50g/L，0. IM pH6. O的磷酸鉀緩沖液作為反應(yīng)介質(zhì)，菌體加入量為5 15(w/v)%，溫度25 35°C ;采用兩階段通氣法，第一階段，搖瓶轉(zhuǎn)速20(T240rpm，反應(yīng)8 14h，第二階段加入5 20g/L葡萄糖作為輔底物，控制PH在5. 5 6. 5，搖瓶轉(zhuǎn)速降低到4(T80rpm，反應(yīng)5(T70h。對于發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化體系，D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化體系中，D-阿拉伯糖醇濃度為4(T60g/L，0. IM pH6.0的磷酸鉀緩沖液作為反應(yīng)介質(zhì)，并全程控制pH在5. 5飛.5，菌體加入量為1(T15(W/V)%，溫度25 35°C ;采用兩階段通氣法，第一階段氧化反應(yīng)，攪拌槳轉(zhuǎn)速40(T600rpm通氣量I I. 2vvm時長5 9h ;第二階段還原反應(yīng)，補(bǔ)加5 20g/L葡萄糖作為輔底物提供還原力，攪拌槳轉(zhuǎn)速15(T200rpm，停止通入空氣或者改通入一定量氮?dú)猓撾A段反應(yīng)4(T60h。氧化葡糖酸桿菌工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件如下?lián)u瓶發(fā)酵分別以RSM/YPG培養(yǎng)基，在搖瓶中加入適量培養(yǎng)基，優(yōu)化調(diào)節(jié)溫度和搖床轉(zhuǎn)速，YPG培養(yǎng)基中加入碳酸鈣調(diào)控pH。發(fā)酵罐發(fā)酵YPG培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度28 33° C，ρΗ5· 9 6. I。種子培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨3 ;固體培養(yǎng)基中瓊脂添加量I. 5%。YPG培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30，酵母粉10，山梨醇10，硫酸銨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂微量。培養(yǎng)基調(diào)節(jié)ρΗ6. (Γ6. 5后，121° C高溫滅菌；用來培養(yǎng)重組菌的培養(yǎng)基溫度降至5(T60° C時加入相應(yīng)濃度的慶大霉素50 μ g/L和頭孢霉素25 μ g/L。關(guān)鍵酶酶活測定方法酶活單位定義為25° C時，每分鐘生成I μ mo I的NADH或者NAD所需的酶量。酶活測定反應(yīng)體系(Iml) 5mmo 1/L的NAD+溶液，O. lmol/L的底物溶液及l(fā)OOmmol/L pH7. O磷酸鈉緩沖液。D-阿拉伯糖醇、D-木酮糖、木糖醇的含量測定高效液相色譜法，色譜條件Agilent HPLC,不差折光檢測器(Shodex RI-101),色譜柱為 Rezex:RCM_MonosaccharideCa2+ (Phenomenex, USA),柱溫 80° C,流動相為純水，流速 0. 5mL/min。顯著效果研究數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明的工程菌靜息細(xì)胞制備木糖醇的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到60%-90%，而原始菌細(xì)胞制備效率不足25%。本發(fā)明方法較好地解決了生物轉(zhuǎn)化法制備木糖醇存在的轉(zhuǎn)化率不高，木糖醇濃度低的難題，并且具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)適用、節(jié)能環(huán)保等諸多優(yōu)點(diǎn)。


圖I重組表達(dá)載體構(gòu)建流程示意圖。圖中所示的質(zhì)粒pRtB-zwf所指即構(gòu)建的表達(dá)載體 pBBR-PtufB-gox0145。圖2關(guān)鍵酶基因gox0145基因克隆與質(zhì)粒驗證。Lane M 5000bp DNA標(biāo)準(zhǔn)marker ；Lanel: gox0145PCR 片段；Lane2&3 gox0145 連接 pMD_18T 載體克隆驗證。圖3克隆和雙酶切驗證表達(dá)載體的構(gòu)建。Lane M : 2000bp和15000bp標(biāo)準(zhǔn)DNAmarker ;克隆驗證:Lanel, PtufB ；Lane2, gox0145 ；Lane3, PtufB+gox0145;雙酶切驗證Lane4, Kpn I 和 BamH I 酶切表達(dá)質(zhì)粒 pBBR-PtutB-gox0145。圖4氧化葡糖酸桿菌工程菌的磷酸戊糖途徑輔酶循環(huán)再生過程與木糖醇轉(zhuǎn)化制備的關(guān)系不意圖。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例I :表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫 Gluconobacter oxydans621H 基因組注釋的 PtufB、gox0145 基因序列設(shè)計引物克隆各基因片段，所采用的引物序列見表I ;表I
權(quán)利要求
1.一種氧化葡糖酸桿菌工程菌，其特征在于，該菌是導(dǎo)入了啟動子ptufB和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因gox0145的氧化葡糖酸桿菌，所述基因gox0145位于啟動子Ptufe的下游，受其調(diào)控節(jié)制。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氧化葡糖酸桿菌工程菌，其特征在于，所述的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因gox0145的核苷酸序列如SEQ IDNo. I所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氧化葡糖酸桿菌工程菌，其特征在于，所述的啟動子PtufB是tufB基因的啟動子，核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氧化葡糖酸桿菌工程菌，其特征在于，所采用的起始受體菌株為氧化葡糖酸桿菌Gluconobacter oxydans NH-10。
5.權(quán)利要求I所述的氧化葡糖酸桿菌工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于如下步驟 (1)設(shè)計引物克隆啟動子PfufB、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因gox0145； (2)將啟動子Pt-序列連接到廣宿主型質(zhì)粒上，以構(gòu)建帶有啟動子的表達(dá)載體； (3)將基因gox0145片段連接到啟動子的下游構(gòu)建重組表達(dá)載體； (4)將步驟(3)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化氧化葡糖酸桿菌即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的氧化葡糖酸桿菌工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的廣宿主型表達(dá)載體為pBBRlMCS-5。
7.權(quán)利要求I所述的氧化葡糖酸桿菌工程菌在轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇高效制備木糖醇中的應(yīng)用技術(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，將氧化葡糖酸桿菌工程菌經(jīng)種子培養(yǎng)后接種于搖瓶或發(fā)酵罐，發(fā)酵后離心收獲菌體；將所得菌體加入到D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化體系中，利用菌體靜息細(xì)胞實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇制備木糖醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，對于搖瓶轉(zhuǎn)化體系，D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化體系中，D-阿拉伯糖醇濃度為2(T50g/L，0. IM pH6. 0的磷酸鉀緩沖液作為反應(yīng)介質(zhì)，菌體加入量為5 15(w/v) %，溫度25 35°C ;采用兩階段通氣法，第一階段，搖瓶轉(zhuǎn)速20(T240rpm，反應(yīng)8 14h，第二階段加入5 20g/L葡萄糖作為輔底物，控制pH在5. 5^6. 5，搖瓶轉(zhuǎn)速降低到40 80rpm，反應(yīng)50 70h。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，對于發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化體系，D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化體系中，D-阿拉伯糖醇濃度為4(T60g/L，0. IM pH6. 0的磷酸鉀緩沖液作為反應(yīng)介質(zhì)，并全程控制pH在5. 5飛.5，菌體加入量為1(T15(W/v)%，溫度25 35°C ;采用兩階段通氣法，第一階段氧化反應(yīng)，攪拌槳轉(zhuǎn)速40(T600rpm通氣量1 1. 2vvm時長5 9h ;第二階段還原反應(yīng)，補(bǔ)加5 20g/L葡萄糖作為輔底物提供還原力，攪拌槳轉(zhuǎn)速15(T200rpm，停止通入空氣或者改通入一定量氮?dú)?，該階段反應(yīng)4(T60h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種氧化葡糖酸桿菌工程菌構(gòu)建方法，該方法是通過過量表達(dá)控制磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵限制酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)，提高該途徑的代謝通量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)輔酶NADH的循環(huán)再生。本發(fā)明還公開了上述工程菌的發(fā)酵工藝及其在轉(zhuǎn)化制備木糖醇中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的工程菌轉(zhuǎn)化D-阿拉伯糖醇產(chǎn)木糖醇的效果較出發(fā)菌株具有明顯優(yōu)勢，木糖醇對D-阿拉伯糖醇的轉(zhuǎn)化率可達(dá)60-90%。該技術(shù)在一定程度上解決了生物轉(zhuǎn)化法制備木糖醇存在的轉(zhuǎn)化率不高，木糖醇濃度低的難題，并且具有經(jīng)濟(jì)適用、操作簡便、節(jié)能環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N15/53GK102978148SQ20121054999
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者徐虹, 張金亮, 李莎, 馮小海 申請人:南京工業(yè)大學(xué)