專利名稱：一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因mif及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲殼類免疫器官中表達(dá)的基因序列，具體涉及一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的基因序列及其用途。
背景技術(shù)：
甲殼類動(dòng)物免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩種方式。細(xì)胞免疫包括吞噬作用、包圍化及結(jié)節(jié)的形成；體液免疫系統(tǒng)包括粉氧化酶原激活系統(tǒng)、各種凝集素及抗菌肽等。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子最早是在1966年研究遲發(fā)型超敏反應(yīng)的時(shí)候發(fā)現(xiàn)的一種分子，它具有多種生物活性，既是一種細(xì)胞因子，又是一種源于垂體的激素，還可以作為糖皮質(zhì)激素生理活動(dòng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑。在脊椎動(dòng)物體免疫體統(tǒng)方面，巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子參與遲發(fā)型超敏反應(yīng)、刺激T細(xì)胞增殖，并在自身免疫系統(tǒng)疾病中參與作用。另外，巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。擬穴青蟹是四種青蟹之一，屬節(jié)肢動(dòng)物門，甲殼綱，十足目，爬行亞綱，短尾派，梭子蟹科。具有很高的營養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和工業(yè)價(jià)值，是我國三大經(jīng)濟(jì)蟹類之一。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，在養(yǎng)殖過程中，由于水質(zhì)、苗種質(zhì)量以及細(xì)菌感染等原因容易導(dǎo)致青蟹的大量死亡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的基因序列及其用途。該基因的獲得不僅為研究甲殼類巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子在免疫反應(yīng)中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的蛋白產(chǎn)物，為進(jìn)一步研究MIF的免疫功能提供理論基礎(chǔ)；該 基因還可以用于擬穴青蟹的抗病相關(guān)研究。本發(fā)明提供了從擬穴青蟹肝胰腺SMART cDNA文庫中篩選出的一個(gè)巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的核苷酸序列、氨基酸序列及其時(shí)空表達(dá)圖譜以及在擬穴青蟹抵抗病原微生物入侵產(chǎn)品中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，發(fā)明人提供如下技術(shù)方案一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF，它所編碼的蛋白質(zhì)具有如SEQ IDNo. 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明所述的擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF是從擬穴青蟹肝胰腺的SMARTcDNA質(zhì)粒文庫中篩選到的一個(gè)基因。該基因cDNA長734bp，自99bp到461bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼120個(gè)氨基酸。擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF的cDNA序列如SEQ ID No.1所示。擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID No. 2所
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本發(fā)明還提供一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF ORF的核苷酸克隆方法，其中，所涉及的引物序列如下上游引物5’ -CCGAAGAACCTCACTCCA-3 ’，下游引物5，-CAGCCGACAATCGAAATAT-3，。本發(fā)明還提供一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF轉(zhuǎn)錄水平的檢測方法，其中，所述的檢測方法為使用一對熒光定量PCR引物進(jìn)行PCR檢測，所述的一對熒光定量PCR引物由上游引物和下游引物組成，其中，所述的引物如下上游引物5’ -CGAACCTGCCCAAGGAGAA-3 ’，下游引物5’ -ACTGGTGCCGCCGAAAG-3 ’。本發(fā)明還提供了上述的一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF在制備擬穴青蟹抵抗病原微生物入侵產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中，所述的病原微生物為副溶血性弧菌。本發(fā)明利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了 MIF在擬穴青蟹的血細(xì)胞、肝胰腺、心臟、精巢、心臟、鰓中的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明該基因在所檢測的六個(gè)組織中均有mRNA存在，其中在肝胰腺中的豐度最高，其次在血細(xì)胞和鰓中。另外還檢測到經(jīng)副溶血性弧菌刺激后的血細(xì)胞中的MIF基因表達(dá)量呈上升趨勢，明顯較正常水平高，這顯示該基因在擬穴青蟹抵抗病原微生物入侵中具有重要功能。有益.效果

本發(fā)明的基因的獲得不僅為研究甲殼類巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子在免疫反應(yīng)中的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的蛋白產(chǎn)物，為進(jìn)一步研究MIF的免疫功能提供理論基礎(chǔ)。此外，本發(fā)明的基因還可以用于擬穴青蟹的抗病相關(guān)研究。


圖1是采用TaKaRa rTaq擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2是熒光定量檢測MIF在擬穴青蟹六個(gè)組織中的表達(dá)情況；圖3是擬穴青蟹經(jīng)副溶血性弧菌感染后血細(xì)胞中MIF的時(shí)空表達(dá)譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1RNA的提取和SMART cDNA文庫的構(gòu)建。肝膜腺總RNA 使用 Unizol Reagents (Biostar, Shanghai, China)提取，具體步驟如下取新鮮肝胰腺組織進(jìn)行液氮研磨，加入ImL Unizol Reagents,充分勻衆(zhòng)后,加入O. 2mL氯仿劇烈震蕩15s,室溫靜置5min后12000r/min離心15min。取上清,加入等體積的異戊醇，混勻，冰上靜置IOmin后12000r/min離心lOmin，棄上清。使用lmL75%乙醇洗漆沉淀，7500r/min離心3min后棄上清。室溫放置晾干后加入30 μ L RNase free dH20,溶解。取3 μ L電泳檢測總RNA濃度和質(zhì)量。SMART cDNA 的合成用 SMART cDNA Library Construction Kit (Clontech, PaloAlto, CA, USA)試劑盒。具體步驟如下取2 μ g RNA，加入 IyL SMART IV Oligonucleotide和I μ LCDS 111/3，PCR Primer，加水補(bǔ)足5 μ L，混勻離心后72°C溫浴2min后冰浴。離心后加入 2 μ L5X First-Strand Buffer, I μ L DTT (20mM), I μ L dNTP Mix (IOmM)和 I μ LPowerScriptReverse Transcriptase, 42°C溫浴 Ih 合成第一鏈 cDNA。取 2 μ L 第一鏈 cDNA和 80 μ L 去離子水，10 μ L 10Χ Advantage 2PCR Buffer,2y L 50X dNTP Μ χ,2μ L 5’PCRPrimer, 2 μ L CDSI11/3' PCR Primer 和 2 μ L 50Χ Advantage 2Polymerase Mix 進(jìn)行如下PCR循環(huán)95°C Imin后，以95°C 15sec、68°C 6min反應(yīng)26個(gè)循環(huán)。取5μ L進(jìn)行電泳檢測。合成的SMART cDNA和pBluescript II SK( + )載體連接，并轉(zhuǎn)化入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中。搖菌后取25(^1^菌液涂布于15011培養(yǎng)皿上(4 1:-1 了6八1&1 LB固體培養(yǎng)基)，37°C過夜。通過藍(lán)白斑鑒定后篩選cDNA插入片段的陽性重組子，分別接種到ImL含氨芐濃度為IOOyg/mL的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行菌液測序。對得到的序列進(jìn)行BLAST比對后，共檢測到該基因的一個(gè)克隆。該基因cDNA全長734bp，自99bp到461bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼120個(gè)氨基酸。實(shí)施例2擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子MIF基因ORF序列的高保真克隆。本發(fā)明人設(shè)計(jì)了一對特異性引物，以擬穴青蟹血液總cDNA為模板，可快速、準(zhǔn)確地克隆出編碼擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子MIF的ORF序列，用于后續(xù)基因工程。1、用于擴(kuò)增編碼擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子MIF的ORF序列的特異性引物上游引物5’ -CCGAAGAACCTCACTCCA-3 ’，

下游引物5，-CAGCCGACAATCGAAATAT-3，。2、PCR 反應(yīng)體系(TakaRa )
IO X PCR Buffer (Mg2.' plus)5 μ
dNTP Mixture t2.5 mM)4 pL
Sense PrimerI pL
Ant1-sense PrimerI pL
rTaojI pL
H2O37 iiL
總計(jì)50 pL反應(yīng)條件為95°C3min，然后是 35 個(gè)循環(huán)95°C 30s，52°C 45s, 72°C lmin。結(jié)果見圖1瓊脂糖凝膠電泳圖譜，將PCR產(chǎn)物回收與純化，可直接用于后續(xù)基因工程。實(shí)施例3六個(gè)組織和經(jīng)副溶血性弧菌后不同時(shí)期的血細(xì)胞總RNA的提取和熒光定量PCR反應(yīng)。利用上述RNA提取方法提取擬穴青蟹血細(xì)胞、肝胰腺、精巢、心臟、肌肉、鰓及經(jīng)副溶血性弧菌刺激后不同時(shí)間點(diǎn)血細(xì)胞的總RNA。利用Rever TraAce qPCR RT Kit(TOYOBO CO.，LTD. OSAKA JAPAN)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈為模板，使用該基因的特異性引物(Sense Primer :5，-CGAACCTGCCCAAGGAGAA-3，；Anti_sense Primer 5’-ACTGGTGCCGCCGAAAG-3’)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)，試劑盒為 TaKaRa SYBRPremix ExTaq (Perfect Real Time)。反應(yīng)體系為總體積 20 μ L，10 μ L 2Χ SYBR Mix，正反向引物(10 μ Μ)和 ROX各 O. 4 μ L, ddH20 6· 8 μ L15PCR反應(yīng)在 ABI StepOnePlus Detection system上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)樵?5°C變性lOmin，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95°C 15s，60°C lmin,72°C延伸 lmin。最后 72°C延伸 lOmin。使用擬穴青蟹 18S rRNA(GenBank accessionnumberFJ646616. 1，Sense Primer:5’ -GGGGTTTGCAATTGTCTCCC-3’，Ant1-sense Primer:5’ -GGTGTGTACAAAGGGCAGGG-3’)作為對照。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算相對表達(dá)量。結(jié)果顯示該基因在擬穴青蟹六個(gè)組織中都有表達(dá)(圖2)，其中在肝胰腺中的表達(dá)量最高，其次是在血細(xì)胞和鰓中。經(jīng)副溶血性弧菌刺激后血液中的表達(dá)量出現(xiàn)了明顯的上升，較正常水平高，這顯示該基因在擬穴青蟹抵抗病原微生 物入侵中具有重要功能(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF，其特征在于所述基因MIF的CDNA 長734bp，自99bp到461bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼120個(gè)氨基酸，具有如SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF，其特征在于 所述基因MIF編碼的蛋白質(zhì)具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF，其特征在于 所述基因MIF開放閱讀框ORF的克隆方法所涉及的引物序列如下上游引物5 ’ -CCGAAGAACCTCACTCCA-3 ’，下游引物5’ -CAGCCGACAATCGAAATAT-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF，其特征在于 所述基因MIF轉(zhuǎn)錄水平的檢測方法為使用一對熒光定量PCR引物進(jìn)行PCR檢測，所涉及的引物序列如下上游引物5 ’ -CGAACCTGCCCAAGGAGAA-3 ’，下游引物5’ -ACTGGTGCCGCCGAAAG-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF的應(yīng)用，其特征在于用于制備擬穴青蟹抵抗病原微生物入侵產(chǎn)品。
6.如權(quán)利要求5所述一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF的應(yīng)用，其特征在于所述的病原微生物為副溶血性弧菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF及其用途，該基因cDNA長734bp，有一個(gè)363bp的開放閱讀框，編碼120個(gè)氨基酸；可用于制備擬穴青蟹抵抗病原微生物入侵產(chǎn)品；本發(fā)明基因的獲得不僅為研究擬穴青蟹免疫系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的蛋白產(chǎn)物，為進(jìn)一步從蛋白層面對MIF進(jìn)行研究提供理論基礎(chǔ)。該基因在擬穴青蟹抵抗病原微生物入侵中具有重要功能。
文檔編號C12Q1/68GK103045608SQ20121054992
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者房婭博, 蔣科技, 張鳳英, 馬凌波, 宋煒, 馬春艷, 胡敬環(huán) 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所