專利名稱：一種利用離體葉片鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種快速、簡(jiǎn)捷、高效的番茄黃化曲葉病毒抗性鑒定方法。
背景技術(shù)：
目前鑒定番茄黃化曲葉病抗性的方法有煙粉虱傳毒、嫁接接種和機(jī)械傳毒等。嫁接法以嫩病葉做接穗，采用腹接法接種到健康番茄上，其優(yōu)點(diǎn)是能夠?yàn)榇b定植株提供高含量的TYLCV病毒，但該方法耗時(shí)耗力，只適于少量鑒定。機(jī)械傳播是在人工環(huán)境下把感染TYLCV的曼陀羅、心葉煙或潘那利番茄作為毒源，通過機(jī)械傳播侵染健康番茄植株，成功率較低，且病毒從番茄傳到番茄上成功的例子只有很少的報(bào)道，因此在接種中一般不用該方TYLCV病毒。在育種進(jìn)程中最常用的接種方法是煙粉虱接種鑒定法，包括溫室中煙粉虱接種、回型籠中煙粉虱接種、露地?zé)煼凼臃N3種類型，但這個(gè)方法也有一些缺點(diǎn)1.蟲ロ密度不均一對(duì)抗性鑒定的影響。若蟲ロ密度過大，一些抗病品種也會(huì)表現(xiàn)出感病來(lái)；若蟲ロ密度太小，又區(qū)分不出抗感品種，目前對(duì)蟲ロ密度的要求還沒有ー個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。2.蟲子逃逸引起病害的大面積發(fā)生。煙粉虱的體長(zhǎng)一般為1_2_，它可隨著調(diào)查人員的進(jìn)出而逃逸出來(lái)，從而給周圍番茄產(chǎn)區(qū)帶來(lái)災(zāi)害。3.受季節(jié)限制。煙粉虱的最佳活動(dòng)溫度是26-28°C，低于15°C蟲子基本不活動(dòng)，也就不能傳毒，這就會(huì)延緩接種鑒定的進(jìn)程。農(nóng)桿菌接種法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的ー種病毒抗性鑒定方法。利用TYLCV-DNA侵染性克隆，通過根瘤農(nóng)桿菌侵染待鑒定植株，病毒DNA可在植物體內(nèi)形成、復(fù)制、運(yùn)輸并誘發(fā)癥狀。侵染性克隆技術(shù)首先在噬菌體病毒QP、脊髄灰質(zhì)炎病毒中獲得成功，植物病毒侵染性克隆由Ahlquist等(1984)在雀麥花葉病毒mosaic virus, BMV)首次報(bào)道，至今國(guó)內(nèi)外已有大量的植物病毒被成功地構(gòu)建出全長(zhǎng)cDNA侵染性克隆，并證明通過農(nóng)桿菌注射能誘導(dǎo)出病毒侵染癥狀(Zhang et al.，2010，2009 ；Jin et al.，2011)。但該方法在注射接種后需放置在有防蟲設(shè)施的防蟲網(wǎng)內(nèi)，且發(fā)病周期較長(zhǎng)要ー個(gè)月左右才能表現(xiàn)出癥狀。因此，鑒于以上TYLCV接種方法的不足之處，在番茄抗病育種的生產(chǎn)上迫切需要ー種快速方便的抗性鑒定方法，本研究利用離體葉片通過農(nóng)桿菌侵染即可鑒定出番茄對(duì)TYLCV的抗性，本方法從而加快抗病育種進(jìn)程，對(duì)推進(jìn)蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)不能準(zhǔn)確地對(duì)TYLCV抗性進(jìn)行鑒定的問題，本發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究工作，利用天津地區(qū)TYLCV的侵染性克隆，通過離體葉片接種番茄黃化曲葉病毒，鑒定不同番茄材料對(duì)該病毒的抗性。此方法無(wú)需飼養(yǎng)煙粉虱、操作簡(jiǎn)單、效率高、重復(fù)性好、可控性好，能提供相對(duì)一致的接種壓力， 結(jié)果準(zhǔn)確，是ー種簡(jiǎn)便有效的接種鑒定方法。本發(fā)明旨在提供一種簡(jiǎn)便的接種鑒定方法，通過該方法能科學(xué)高效準(zhǔn)確地鑒定出番茄對(duì)TYLCV的抗性。
為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容
ー種利用離體葉片鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，按如下的步驟進(jìn)行
(1)侵染性克隆菌液的培養(yǎng)將含有病毒DNA-A侵染性克隆的農(nóng)桿菌LBA4404接種在含50 ug/mL Kan和50 ug/mL Rif的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)48 h ；
(2)菌液的收集用5000rpm離心機(jī)離心收集菌體，用液體MS培養(yǎng)基重新懸浮菌體，調(diào)0D600值為0. 5 ;其中MS培養(yǎng)基配方如下
權(quán)利要求
1.一種利用離體葉片鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行 (1)侵染性克隆菌液的培養(yǎng)將含有病毒DNA-A侵染性克隆的農(nóng)桿菌LBA4404接種在含50 ug/mL Kan和50 ug/mL Rif的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)48 h ； (2)菌液的收集用5000rpm離心機(jī)離心收集菌體，用液體MS培養(yǎng)基重新懸浮菌體，調(diào)OD600值為O. 5 ;其中所述的MS培養(yǎng)基配方如下
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用離體葉片鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，包括侵染性克隆菌液的培養(yǎng)，菌液的收集，葉片處理離體葉片接種等步驟。本發(fā)明主要利用天津地區(qū)TYLCV的侵染性克隆，通過離體葉片接種番茄黃化曲葉病毒，鑒定不同番茄材料對(duì)該病毒的抗性。此方法無(wú)需飼養(yǎng)煙粉虱、操作簡(jiǎn)單、效率高、重復(fù)性好、可控性好，能提供相對(duì)一致的接種壓力，結(jié)果準(zhǔn)確，是一種簡(jiǎn)便有效的接種鑒定方法。通過該方法能科學(xué)高效準(zhǔn)確地鑒定出番茄對(duì)TYLCV的抗性。
文檔編號(hào)C12N1/21GK103026966SQ20121054675
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者金鳳媚, 薛琳, 薛俊, 楊迎霞, 吉立柱, 郝志愚 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心