專利名稱：檢測雪白絲衣霉菌的實(shí)時(shí)熒光pcr試劑盒和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測雪白絲衣霉菌的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒和檢測方法。
背景技術(shù)：
雪白絲衣霉(byssochlamys nivea)是果汁生產(chǎn)過程中易污染的耐熱霉菌之一。雪白絲衣霉可產(chǎn)生真菌毒素棒曲霉素/展青霉毒素和絲衣霉酸，真菌毒素對(duì)許多生物系統(tǒng)都有毒害作用，可致畸、致癌。被耐熱霉菌污染的果汁在貯存過程中易出現(xiàn)變色、異味、分層沉淀等現(xiàn)象，甚至胖聽爆裂，出現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量問題。雪白絲衣霉目前主要通過培養(yǎng)法分離，生化方法鑒定，整個(gè)過程操作繁瑣，檢測周期長，不利于生產(chǎn)時(shí)的產(chǎn)品監(jiān)控，以及食品安全事件的應(yīng)急處理，不能滿足果汁產(chǎn)品出口中快速準(zhǔn)確檢測的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足展開的實(shí)驗(yàn)研究，根據(jù)雪白絲衣霉的Beta tubulin的部分基因序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針,提供一種檢測雪白絲衣霉菌的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，可實(shí)現(xiàn)對(duì)雪白絲衣霉菌的快速、準(zhǔn)確、特異性檢測。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案所述試劑盒包括特異性引物、熒光探針、PCR緩沖液、dNTP混合物、MgCl2和DNA聚合酶；所述dNTP混合物由三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸組成，它們的摩爾比為1:1:1:1混合，其特征在于所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5'-GGTTGTTGTTGACTTCCCTGATG-3'下游引物5'-CCATGGTACCAGGCTCAAGGT-3'熒光探針5'-FAM-ACGCTCCATATGCTGACCCTCCTCCTAG-BHQ1-3'其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl為熒光淬滅基團(tuán)。本發(fā)明另一個(gè)所要解決的技術(shù)問題是提供一種采用上述實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的一種檢測雪白絲衣霉菌的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案所述方法包括以下步驟(I)提取樣品 DNA;(2)以待測樣品DNA為模板，與權(quán)利要求I所述的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒混合配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物置于實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行熒光檢測；(3)選擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調(diào)整取3 15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長，小于Ct值，則判斷為陽性，所述Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。在采用上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可采用以下進(jìn)一步的技術(shù)方案所述Ct值為35。
所述方法的步驟(2)中PCR體系終濃度組成如下
權(quán)利要求
1.一種檢測雪白絲衣霉菌(Byssochlamys nivea)的實(shí)時(shí)突光PCR試劑盒,所述試劑盒包括特異性引物、熒光探針、PCR緩沖液、dNTP混合物、MgCl2和DNA聚合酶；所述dNTP混合物由三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸組成，它們的摩爾比為1:1:1:1混合，其特征在于所述特異性引物和熒光探針序列如下 上游引物5' -GGTTGTTGTTGACTTCCCTGATG-3' 下游引物5' -CCATGGTACCAGGCTCAAGGT-3' 熒光探針5' -FAM-ACGCTCCATATGCTGACCCTCCTCCTAG-BHQ1-3' 其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl為熒光淬滅基團(tuán)。
2.一種檢測雪白絲衣霉菌的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其特征在于所述方法包括以下步驟 (1)提取樣品DNA； (2)以待測樣品DNA為模板，與權(quán)利要求I所述的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒混合配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物置于實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行熒光檢測； (3)選擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調(diào)整取3 15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長，小于Ct值，則判斷為陽性，所述Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
3.如權(quán)利2所述的方法，其特征在于所述Ct值為35。
4.如權(quán)利2所述的方法，其特征在于所述方法的步驟(2)中PCR體系終濃度組成如下
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法的步驟(2)中PCR反應(yīng)條件如下 95°C預(yù)變性3min ;95°C變性15s，59°C退火40s，40個(gè)循環(huán)。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法的步驟(2)中PCR反應(yīng)體系中加有ROX染料，可適用于需要使用ROX校正染料的實(shí)時(shí)熒光PCR儀器，所述ROX染料在PCR體系終濃度為O. 05 O. 8 μ mol/L 。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測雪白絲衣霉菌(Byssochlamys nivea)的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒和檢測方法。所述試劑盒主要包括特異性引物和熒光探針、PCR緩沖溶液、dNTP混合物(三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的摩爾比為1:1:1:1混合)、MgCl2和DNA聚合酶，所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5′-GGTTGTTGTTGACTTCCCTGATG-3′，下游引物5′-CCATGGTACCAGGCTCAAGGT-3′，熒光探針5′-FAM-ACGCTCCATATGCTGACCCTCCTCCTAG-BHQ1-3′，其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQ1為熒光淬滅基團(tuán)。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在檢測敏感性高，特異性好，具有操作簡單、省時(shí)省力、結(jié)果可靠和準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102952887SQ20121051257
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者張慧, 姜侃, 陳小珍, 汪新 申請(qǐng)人:浙江省質(zhì)量檢測科學(xué)研究院