專利名稱：一種用于同時(shí)檢測5種豬病病毒的多重連接探針擴(kuò)增檢測試劑盒及引物和探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種用于檢測豬流感病毒、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、口蹄疫病毒的多重連接探針擴(kuò)增檢測試劑盒及引物和探針，可實(shí)現(xiàn)一次采樣，一次分析，同時(shí)檢測5種豬病的目的，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬流感病毒(SIV)、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、口蹄疫病毒(FMDV)是引起豬呼吸道疾病、繁殖障礙和消化道疾病的主要常見病原，是危害養(yǎng)豬業(yè)最為嚴(yán)重的幾種病原，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織規(guī)定為跨界傳播病原，也是我國動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品國際貿(mào)易中重要的檢疫對(duì)象。
目前，針對(duì)上述5種豬病病原建立了多種分子檢測技術(shù)，如PCR和熒光PCR技術(shù)等，在這些疫病的診斷和防控中發(fā)揮了重要的作用。但目前所建立的方法多是針對(duì)一種病原的單獨(dú)檢測技術(shù)，在實(shí)際檢測中需要重復(fù)多次完成檢測不同病原的目的，檢測工作量大且時(shí)間長，不能滿足大批量動(dòng)物檢疫快速通關(guān)的實(shí)際需要。且難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)地樣品中大量存在的混合感染以及癥狀相似疫病的鑒別診斷。在建立單獨(dú)疫病檢測技術(shù)的同時(shí)，各國獸醫(yī)機(jī)構(gòu)也相繼研制了可同時(shí)檢測豬常見病毒的多重PCR及多重?zé)晒釶CR，但傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏度低、結(jié)果不易判定等缺點(diǎn)限制了其在多重檢測中的應(yīng)用，而熒光PCR由于不同探針采用的突光集團(tuán)所發(fā)射的突光存在相互干擾，且突光PCR儀對(duì)不同波長突光分辨的局限性也限制了熒光PCR多重檢測技術(shù)的發(fā)展。多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(Multiplexligation-dependent probeamplification, MLPA)由荷蘭的Schouten博士首先發(fā)明，是一種操作簡便、成本低廉的新型技術(shù)，目前在遺傳疾病、基因甲基化分析等多個(gè)領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。MLPA的原理是將核酸的雜交檢測和PCR鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)靶分子的高效特異性分析。其核心技術(shù)是合成序列特異的長探針和短探針。短探針由兩段核苷酸組成，一段是PCR擴(kuò)增的通用引物，一段是病毒特異性序列。長探針由三段核苷酸組成，除了 PCR擴(kuò)增的通用引物和病毒特異性序列外，在兩者之間還加入特定大小的填充序列(指紋序列)。當(dāng)MLPA的兩種探針結(jié)合到彼此相鄰的靶序列上的時(shí)候，在連接反應(yīng)時(shí)，長探針就和短探針發(fā)生連接，生成一條兩端分別含有上下游通用引物的全長探針，并在通用引物的擴(kuò)增之下，使模板成鏈?zhǔn)椒糯螅瑢?shí)現(xiàn)靶分子的高靈敏度檢測，其檢測極限可達(dá)3000-6000個(gè)靶分子拷貝。MLPA并不是擴(kuò)增病毒特異的靶序列，而是擴(kuò)增與病毒靶序列結(jié)合的探針，換句話說，首先是給每種病毒的長探針加入特定大小的指紋序列，然后通過通用引物將不同的“指紋”擴(kuò)增表現(xiàn)出來，最后通過對(duì)“指紋”的分析，實(shí)現(xiàn)多種核酸的檢測，同時(shí)序列特異的兩段探針確保了每種病原的指紋具有高度的特異性。MLPA在擴(kuò)增靈敏性、特異性等方面是對(duì)傳統(tǒng)PCR方法的顯著改進(jìn)，同時(shí)其良好的多重性能，一次反應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)45種以上靶分子的檢測，也突破了實(shí)時(shí)熒光PCR在多重性方面的“瓶頸”。
本研究利用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)在核酸檢測方面具有的特異、敏感，適合多重檢測等優(yōu)點(diǎn)，建立了 SIV、PRRSV, PRV、TGEV, FMDV五種豬病病原的MLPA檢測方法并組裝成試劑盒，在國內(nèi)外首次實(shí)現(xiàn)一次采樣，一次分析，檢測5種重要豬病的目的，不僅減少了檢測的工作量和成本，且能在最短的時(shí)間內(nèi)完成疫病的檢測，為疾病防制爭得時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供特異性強(qiáng)、靈敏度高的同時(shí)檢測豬流感病毒(SIV)、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和口蹄疫病毒(FMDV)的多重連接探針及一對(duì)通用引物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供快速、準(zhǔn)確、使用方便的同時(shí)檢測豬流感病毒(SIV)、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和
口蹄疫病毒(FMDV)的多重連接探針擴(kuò)增檢測試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案在序列比對(duì)分析的基礎(chǔ)上，針對(duì)豬流感病毒M基因、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒N基因、偽狂犬病病毒gB基因、豬傳染性胃腸炎病毒S基因、口蹄疫病毒3D基因，分別設(shè)計(jì)一對(duì)長探針和短探針(序列見表I )，同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增的通用引物(序列見表2)。短探針由兩段核苷酸組成，一段是PCR擴(kuò)增的通用引物，一段是病毒特異性序列；長探針由三段核苷酸組成，除了 PCR擴(kuò)增的通用引物和病毒特異性序列外，在兩者之間還加入特定大小的填充序列；且位于右側(cè)的探針5'端進(jìn)行磷酸化處理。通過在上述5種病毒的長探針中加入不同長度的填充序列，然后通過病毒模板變性、探針雜交、連接及通用引物PCR擴(kuò)增得到不同大小的PCR產(chǎn)物，通過毛細(xì)管電泳分析后實(shí)現(xiàn)對(duì)5種病毒的同時(shí)檢測。表I 豬流感病毒、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、口蹄疫病毒短探針和長探針名稱和序列
權(quán)利要求
1.用于同時(shí)檢測豬流感病毒、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和口蹄疫病毒的引物和多重連接探針，其特征在于，所述多重連接探針如序列表SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO : 10 所示，所述引物如序列表 SEQ ID ΝΟ:11 至 SEQ ID NO:12 所/Jn ο
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物和多重連接探針，其特征在于，所述序列SEQID ΝΟ1和SEQ ID NO 2分別為檢測豬流感病毒的短探針和長探針；所述序列SEQ ID NO 3和SEQID NO :4分別為檢測豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的短探針和長探針；所述序列SEQ ID NO5和SEQ ID NO 6分別為檢測偽狂犬病病毒的短探針和長探針；所述序列SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :8分別為檢測豬傳染性胃腸炎病毒的短探針和長探針；所述序列SEQ ID NO 9和SEQ ID NO: 10分別為檢測口蹄疫病毒的短探針和長探針，其中，所述SEQ ID NO :2，SEQID NO :3，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO 8 和 SEQ IDNO 10 的 5’ 端進(jìn)行磷酸化處理。
3.—種檢測豬流感病毒、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和口蹄疫病毒的多重連接探針擴(kuò)增檢測試劑盒，其包括以下組分 (1)MLPA緩沖液； (2)探針混合物，其包括如序列表SEQID NO: I至SEQ ID NO :10所示的用于檢測豬流感病毒、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和口蹄疫病毒的多重連接探針，其中，所述 SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO :8 和 SEQID NO : 10的5’端進(jìn)行磷酸化處理； (3)連接反應(yīng)液，其包括Ligase-65緩沖液A和Ligase-65緩沖液B； (4)Ligase_65連接酶； (5)PCR反應(yīng)液，其包括如序列表SEQ ID NO: 11至SEQ ID N0:12所示的引物； (6)SALSA聚合酶； (7)無RNA酶的滅菌純化水； (8)陰性對(duì)照； (9)陽性對(duì)照。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多重連接探針擴(kuò)增檢測試劑盒，其特征在于，所述序列SEQID NO 1和SEQ ID NO 2分別為檢測豬流感病毒的短探針和長探針；所述序列SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4分別為檢測豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的短探針和長探針；所述序列SEQID NO :5和SEQ ID NO :6分別為檢測偽狂犬病病毒的短探針和長探針；所述序列SEQ IDNO :7和SEQ ID NO :8分別為檢測豬傳染性胃腸炎病毒的短探針和長探針；所述序列SEQ IDNO 9和SEQ ID NO 10分別為檢測口蹄疫病毒的短探針和長探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于同時(shí)檢測5種豬病病毒的多重連接探針擴(kuò)增檢測試劑盒及引物和探針。所述多重連接探針如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO10所示，所述引物如序列表SEQ ID NO11至SEQ ID NO12所示。使用本發(fā)明所述的引物、探針，和/或包含該引物和探針的多重連接探針擴(kuò)增檢測試劑盒可同時(shí)檢測豬流感病毒、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、口蹄疫病毒5種重要豬病病原，節(jié)約了檢測時(shí)間和成本，有利于疫病的及時(shí)確診。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102943129SQ20121050596
公開日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者馬貴平, 史喜菊, 喬彩霞, 郭志紅, 張偉 申請(qǐng)人:中華人民共和國北京出入境檢驗(yàn)檢疫局