專利名稱：油藏中芽孢桿菌(Bacillus)的快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種油藏中芽孢桿菌的檢測(cè)方法，具體涉及依靠培養(yǎng)的微生物學(xué)方法與不依靠培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法相結(jié)合來(lái)揭示油藏中Bacillus多樣性的方法。
背景技術(shù)：
隨著油藏中微生物的分離和檢測(cè)，研究人員發(fā)現(xiàn)油藏中同時(shí)存在著對(duì)原油開采有害和有益的微生物，一些微生物的代謝產(chǎn)物和代謝活性能被用來(lái)提高原油采收率。根據(jù)這一特點(diǎn)，微生物提高原油采收率(MEOR)作為三次采油的一種重要措施被提出并實(shí)施開來(lái)。微生物提高原油采收率的主體是功能微生物菌群。根據(jù)以往的研究,芽孢桿菌(.Bacillus)是微生物提高原油采收率的一類重要的微生物菌群。芽孢桿菌(feci77m)能產(chǎn)生物表面活性劑降低原油與水以及巖石之間的界面張力，從而提高原油的流動(dòng)性達(dá)到增加原油采收率的目的；芽孢桿菌能降解長(zhǎng)鏈烴減低原油粘度提高原油流動(dòng)性來(lái)增加原油采收率；芽孢桿菌還能產(chǎn)生生物聚合物選擇性地堵塞油藏中的大孔道，增加注入水的波及系數(shù)從而增加原油采收率。對(duì)于微生物提高原油采收率的實(shí)驗(yàn)室研究和礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)研究而言，研究棲居在油藏中的微生物是發(fā)現(xiàn)功能微生物菌群以及設(shè)計(jì)微生物提高原油采收率礦場(chǎng)試驗(yàn)實(shí)施方案的 關(guān)鍵步驟。傳統(tǒng)的依靠培養(yǎng)的微生物學(xué)方法已被用來(lái)分離和鑒定油藏中的微生物，但是這些方法對(duì)微生物的富集以及分離過(guò)程復(fù)雜，大部分情況下，需要配制專一性的培養(yǎng)基，選擇專一性的碳原，并且富集過(guò)程有時(shí)要經(jīng)過(guò)幾十輪的培養(yǎng)。另外一個(gè)方面，采用傳統(tǒng)的微生物學(xué)培養(yǎng)方法僅能培養(yǎng)出自然界中很少的一部分微生物(少于l%)(Amann et al.，1995)。因此通過(guò)傳統(tǒng)微生物學(xué)方法僅揭示了油藏中很少的一部分微生物。目前，分子生態(tài)學(xué)技術(shù)為微生物的檢測(cè)提供了新的方法，被廣泛用來(lái)研究自然環(huán)境中的微生物生態(tài)。研究人員也將這些方法用于油藏微生物多樣性研究，油藏中檢測(cè)到大量的不同系統(tǒng)發(fā)育類型的微生物種群。然而，綜觀所有國(guó)內(nèi)外關(guān)于油藏微生物多樣性研究的報(bào)道，出現(xiàn)了一個(gè)令人費(fèi)解的結(jié)果，那就是利用不基于培養(yǎng)的分子生態(tài)學(xué)方法，油藏樣品中很少或幾乎沒(méi)有檢測(cè)到芽孢桿菌{Bacillus、。這些結(jié)果給人們一個(gè)印象就是油藏樣品中芽孢桿菌{Bacillus、很少或油藏中不存在芽孢桿菌當(dāng)利用分子生態(tài)學(xué)方法研究環(huán)境樣品中微生物群落多樣性的時(shí)候，有兩個(gè)方面的原因可能造成油藏樣品中檢測(cè)不到芽孢桿菌Ofeci77m)，第一是，芽孢桿菌是一類革蘭氏陽(yáng)性、能形成芽孢的微生物菌群，DNA抽提過(guò)程中芽孢的破壁率要比其它微生物小，因此芽孢桿菌在整個(gè)分析過(guò)程中很可能被忽略；第二，分子生態(tài)學(xué)方法不能檢測(cè)到環(huán)境樣品僅占比例為O. 1%-1%微生物菌群(Head et al.，1998)。芽孢桿菌是一類革蘭氏陽(yáng)性、能形成芽孢、對(duì)微生物提高原油采收率有益的功能微生物菌群。利用不基于培養(yǎng)的微生物學(xué)方法沒(méi)有檢測(cè)到芽孢桿菌OfeCiBm)的油藏是否真的不存在芽孢桿菌？能通過(guò)怎樣的方法來(lái)快速檢測(cè)油藏樣品中的少量芽孢桿菌菌群是目前研究人員所面臨的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題就在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種油藏中芽孢桿M(Mcillus)的快速檢測(cè)方法，它將傳統(tǒng)的微生物學(xué)和分子生物學(xué)的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，提成了一種快速檢測(cè)油藏中的芽孢桿菌方法。本發(fā)明所述的方法能有效地檢測(cè)油藏中的芽孢桿菌Ofeci77M)，為油藏中采用功能芽孢桿菌的發(fā)現(xiàn)，以及油藏中芽孢桿菌(Mcillus )的生態(tài)學(xué)研究提供了新的可行方法。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
本發(fā)明提供了一種油藏中芽孢桿菌的快速檢測(cè)方法，所述方法包括下列步
驟
(1)油藏樣品的采集；
(2)通過(guò)高溫滅活樣品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物；
(3)收集滅活后樣品中的牙抱；
(4)將收集的芽孢接種于培養(yǎng)基、在油藏原位溫度條件下對(duì)芽孢菌進(jìn)行復(fù)活培養(yǎng)；
(5)通過(guò)分子生物學(xué)方法檢測(cè)復(fù)活的芽孢菌菌群。本發(fā)明所述油藏為不同地質(zhì)條件、不同開采方法的各類油藏。本發(fā)明的油減樣品包括注水井井口樣品，油井井口樣品，地層水樣品，油井返排樣品以及巖芯樣品。油藏樣品的采集步驟為將采集的油藏樣品裝入已滅菌的樣品瓶中，裝滿樣品瓶，密封，記錄樣品采集的油藏原位溫度。通過(guò)高溫滅活樣品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物步驟為，在無(wú)菌條件下取500ml的油藏樣品到無(wú)菌燒瓶中，燒瓶口覆蓋上有透氣孔的無(wú)菌微生物培養(yǎng)膜；將燒瓶加熱，保持沸騰10分鐘，室溫冷卻。收集滅活后樣品中的芽孢步驟具體操作為待燒瓶中樣品冷卻后，在無(wú)菌條件下將燒瓶中的樣品轉(zhuǎn)移到多個(gè)50ml的無(wú)菌離心管中，IOOOOg離心力離心15分鐘，在無(wú)菌條件下將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的無(wú)菌容器中保存為待用上清液；
然后在每個(gè)離心管中加入Iml的無(wú)菌水、重懸浮離心管底部收集到的沉淀物，將所有離心管中的重懸浮液收集到一起成為IOml的混合液；混合液中包含有芽孢。將收集的芽孢接種于培養(yǎng)基、在油藏原位溫度條件下對(duì)芽孢菌進(jìn)行復(fù)活培養(yǎng)步驟具體為將收集到的IOml的混合液作為種子，在無(wú)菌條件下接種到裝有30ml培養(yǎng)基的IOOml培養(yǎng)瓶中，密封瓶口，在樣品采集的油藏原位溫度10°C -110°C條件下，搖菌(150rmp)對(duì)芽孢菌進(jìn)行復(fù)活培養(yǎng)7-15天，得復(fù)活培養(yǎng)液；
所述的培養(yǎng)基是指與微生物原來(lái)生長(zhǎng)環(huán)境相匹配，并能為芽孢復(fù)活提供營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為糖蜜2g, (NH4)2HPO4 O. 16g，KNO3 O. 2g，用待用上清液配制并定容到100ml，加入原油2g;121°C滅菌20分鐘高壓蒸汽滅菌，原油來(lái)自樣品采集油藏。通過(guò)分子生物學(xué)方法檢測(cè)復(fù)活的芽孢菌菌群步驟具體操作為在無(wú)菌條件下吸取5ml復(fù)活培養(yǎng)液于離心管中，IOOOOg離心力離心10分鐘，移除上清，在離心管中加入Iml無(wú)菌水，重懸浮離心管底沉淀；
通過(guò)DNA試劑盒FastDNA Spin Kit for Soil來(lái)抽提重懸浮液中的DNA，構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)，基因測(cè)序以及微生物系統(tǒng)發(fā)育分析來(lái)完成對(duì)芽孢桿菌的檢測(cè)和分析。油田中大部分芽孢桿菌(ifeci77M)由于其形成芽孢的特性和檢測(cè)方法的不足而被忽視，本發(fā)明將傳統(tǒng)的微生物學(xué)和分子生物學(xué)的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，提出了一種快速檢測(cè)油藏中的芽孢桿菌的方法。本發(fā)明所述的方法能有效地檢測(cè)油藏中的芽孢桿菌為油藏中采用功能芽孢桿菌的發(fā)現(xiàn)，以及油藏中芽孢桿菌(.Bacillus)的生態(tài)學(xué)研究提供了新的可行方法。


圖I為實(shí)施例I收集得到的某個(gè)芽孢的透射電鏡照片。
具體實(shí)施例方式不同的油藏原位溫度不同，本發(fā)明選取了 4個(gè)不同原位溫度的油藏，每個(gè)油藏中取了注水井以及油井樣品。同時(shí)還選取了一個(gè)聚合物驅(qū)后油藏，取注水井以及油井樣品。所有實(shí)例中的樣品的共同特點(diǎn)是，在沒(méi)有經(jīng)過(guò)本專利方法處理過(guò)的樣品中，沒(méi)有檢測(cè)到芽孢桿菌Ofeci77m)。根據(jù)本專利中的方法對(duì)上述樣品進(jìn)行處理，通過(guò)多個(gè)實(shí)例來(lái)證明本發(fā)明中的方法的可行性。實(shí)施例I 低溫油藏中芽孢桿菌iBacillus )檢測(cè)
從新疆油田低溫No. 6油藏(25°C)分別采集了注水井T6186和油井T6073的井口樣品。以前研究報(bào)道表明，通過(guò)分子生態(tài)學(xué)方法，兩個(gè)原始樣品中沒(méi)有檢測(cè)到芽孢桿菌{Bacillus')。對(duì)該實(shí)例中的兩個(gè)樣品進(jìn)行處理，具體檢測(cè)步驟為
I、油藏樣品的采集將采集的油藏樣品裝入已滅菌的樣品瓶中，裝滿樣品瓶，密封，記錄樣品采集的油藏原位溫度25°C。然后以最快速度運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2、通過(guò)高溫滅活樣品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物在無(wú)菌條件下取500ml的油藏樣品到一個(gè)2L的無(wú)菌燒瓶中，燒瓶口覆蓋上有透氣孔的無(wú)菌微生物培養(yǎng)膜。將燒瓶放置在鋪有石棉網(wǎng)的電加熱爐加熱，保持沸騰10分鐘后關(guān)掉電爐室溫冷卻。3、收集滅活后樣品中的芽孢待燒瓶中樣品冷卻后，在無(wú)菌條件下將燒瓶中的樣品轉(zhuǎn)移到多個(gè)50ml的無(wú)菌離心管中，IOOOOg離心力離心15分鐘，在無(wú)菌條件下將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的無(wú)菌容器中保存為待用上清液；
然后在每個(gè)離心管中加入Iml的無(wú)菌水、重懸浮離心管底部收集到的沉淀物，將所有離心管中的重懸浮液收集到一起成為IOml的混合液；混合液中包含有芽孢。收集得到的某個(gè)芽孢的透射電鏡照片見圖I。4、將收集的芽孢接種于培養(yǎng)基、在油藏原位溫度條件下對(duì)芽孢菌進(jìn)行復(fù)活將收集到的IOml的混合液作為種子，在無(wú)菌條件下接種到裝有30ml培養(yǎng)基的IOOml培養(yǎng)瓶中，密封瓶口，在樣品采集的油藏原位溫度25°C條件下，搖菌(150rmp)對(duì)芽孢菌進(jìn)行復(fù)活培養(yǎng)7天，得復(fù)活培養(yǎng)液；
所述的培養(yǎng)基是指與微生物原來(lái)生長(zhǎng)環(huán)境相匹配，并能為芽孢復(fù)活提供營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為糖蜜2g, (NH4)2HPO4 O. 16g，KNO3 O. 2g，用待用上清液配制并定容到100ml,加入原油2g ; 121/C滅菌20分鐘高壓蒸汽滅菌,原油來(lái)自No. 6油藏。5、通過(guò)分子生物學(xué)方法檢測(cè)復(fù)活的芽孢菌菌群在無(wú)菌條件下吸取5ml復(fù)活培養(yǎng)液于離心管中，IOOOOg離心力離心10分鐘，移除上清，在離心管中加入Iml無(wú)菌水，重懸浮離心管底沉淀；
通過(guò)DNA試劑盒FastDNA Spin Kit for Soil來(lái)抽提重懸浮液中的DNA，構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)，基因測(cè)序以及微生物系統(tǒng)發(fā)育分析來(lái)完成對(duì)芽孢桿菌的檢測(cè)和分析。
兩個(gè)樣品中均檢測(cè)到了芽孢桿菌(Mcillus )。得到了兩個(gè)芽孢桿菌(MeiciIIus)16S rRNA基因克隆文庫(kù)(N6PB和N6IB)。N6ro和N6IB克隆文庫(kù)中分別有5個(gè)和6個(gè)芽孢桿菌系統(tǒng)發(fā)育類型(表I和表2)。在N6PB克隆文庫(kù)中98. 8%的序列被鑒定為芽孢桿菌Uaci77m)，其中sp.為該樣品中的優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌；在N6IB克隆文庫(kù)中95. 4%的序列被鑒定為芽孢桿菌(ifeci77i/5·),其中Bacillus flexus為該樣品中的優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌。表I根據(jù)本專利方法油井T6073樣品中檢測(cè)到的芽孢桿菌(MciIIus)
權(quán)利要求
1.一種油藏中芽孢桿菌(Mcillus)的快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟 (1)油藏樣品的采集； (2)通過(guò)高溫滅活樣品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物； (3)收集滅活后樣品中的牙抱； (4)將收集的芽孢接種于培養(yǎng)基、在油藏原位溫度條件下對(duì)芽孢菌進(jìn)行復(fù)活培養(yǎng)； (5)通過(guò)分子生物學(xué)方法檢測(cè)復(fù)活的芽孢菌菌群。
2.如權(quán)利要求I所述的油藏中芽孢桿菌OfeciBm)的快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述油藏為不同地質(zhì)條件、不同開采方法的各類油藏。
3.如權(quán)利要求2所述的油藏中芽孢桿菌OfeciBm)的快速檢測(cè)方法，其特征在于，油減樣品包括注水井井口樣品，油井井口樣品，地層水樣品，油井返排樣品以及巖芯樣品。
4.如權(quán)利要求3所述的油藏中芽孢桿菌OfeciBm)的快速檢測(cè)方法，其特征在于，油藏樣品的采集步驟為將采集的油藏樣品裝入已滅菌的樣品瓶中，裝滿樣品瓶，密封，記錄樣品采集的油藏原位溫度。
5.如權(quán)利要求4所述的油藏中芽孢桿菌的快速檢測(cè)方法，其特征在于，通過(guò)高溫滅活樣品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物步驟為，在無(wú)菌條件下取500ml的油藏樣品到無(wú)菌燒瓶中，燒瓶口覆蓋上有透氣孔的無(wú)菌微生物培養(yǎng)膜；將燒瓶加熱，保持沸騰10分鐘，室溫冷卻。
6.如權(quán)利要求5所述的油藏中芽孢桿菌(ifeci77M)的快速檢測(cè)方法，其特征在于，收集滅活后樣品中的芽孢步驟具體操作為待燒瓶中樣品冷卻后，在無(wú)菌條件下將燒瓶中的樣品轉(zhuǎn)移到多個(gè)50ml的無(wú)菌離心管中，IOOOOg離心力離心15分鐘，在無(wú)菌條件下將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的無(wú)菌容器中保存為待用上清液； 然后在每個(gè)離心管中加入Iml的無(wú)菌水、重懸浮離心管底部收集到的沉淀物，將所有離心管中的重懸浮液收集到一起成為IOml的混合液；混合液中包含有芽孢。
7.如權(quán)利要求6所述的油藏中芽孢桿菌OfeciBm)的快速檢測(cè)方法，其特征在于，將收集的芽孢接種于培養(yǎng)基、在油藏原位溫度條件下對(duì)芽孢菌進(jìn)行復(fù)活培養(yǎng)步驟具體為將收集到的IOml的混合液作為種子，在無(wú)菌條件下接種到裝有30ml培養(yǎng)基的IOOml培養(yǎng)瓶中，密封瓶口，在樣品采集的油藏原位溫度10°C -110°C條件下，搖菌(150rmp)對(duì)芽孢菌進(jìn)行復(fù)活培養(yǎng)7-15天，得復(fù)活培養(yǎng)液； 所述的培養(yǎng)基是指與微生物原來(lái)生長(zhǎng)環(huán)境相匹配，并能為芽孢復(fù)活提供營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為糖蜜2g, (NH4) 2HP04 O. 16g，KN03 O. 2g，用待用上清液配制并定容到100ml，加入原油2g;121°C滅菌20分鐘高壓蒸汽滅菌，原油來(lái)自樣品采集油藏。
8.如權(quán)利要求7所述的油藏中芽孢桿菌的快速檢測(cè)方法，其特征在于，通過(guò)分子生物學(xué)方法檢測(cè)復(fù)活的芽孢菌菌群步驟具體操作為在無(wú)菌條件下吸取5ml復(fù)活培養(yǎng)液于離心管中，IOOOOg離心力離心10分鐘，移除上清，在離心管中加入Iml無(wú)菌水，重懸浮離心管底沉淀； 通過(guò)DNA試劑盒FastDNA Spin Kit for Soil來(lái)抽提重懸浮液中的DNA，構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)，基因測(cè)序以及微生物系統(tǒng)發(fā)育分析來(lái)完成對(duì)芽孢桿菌的檢測(cè)和分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種油藏中芽孢桿菌(Bacillus)的快速檢測(cè)方法，所述方法包括下列步驟(1)油藏樣品的采集；(2)通過(guò)高溫滅活樣品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物；(3)收集滅活后樣品中的芽孢；(4)將收集的芽孢接種于培養(yǎng)基，在油藏原位溫度條件下對(duì)芽孢菌進(jìn)行復(fù)活培養(yǎng)；(5)通過(guò)分子生物學(xué)方法檢測(cè)復(fù)活的芽孢菌菌群。本發(fā)明所述的方法能有效地檢測(cè)油藏中的芽孢桿菌(Bacillus)，為油藏中采用功能芽孢桿菌(Bacillus)的發(fā)現(xiàn)，以及油藏中芽孢桿菌(Bacillus)的生態(tài)學(xué)研究提供了一種新的可行方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102936630SQ201210499739
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者張凡, 佘躍惠, 侯讀杰, 柴陸軍 申請(qǐng)人:中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(北京)