一個(gè)來(lái)源于玉米的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因的新用途
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)來(lái)源于玉米的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因的新用途。本發(fā)明所提供的一種新用途是利用ZmNLP1;1的編碼核酸分子培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。該方法是培育具有如下1）-4）中至少一種性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入ZmNLP1;1基因的步驟：1）地上部分生物量高于所述受體植物；2）受硝酸鹽誘導(dǎo)后，硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量高于所述受體植物；3）受硝酸鹽誘導(dǎo)后，硝酸鹽還原酶基因表達(dá)量高于所述受體植物；4）受硝酸鹽誘導(dǎo)后，亞硝酸鹽還原酶基因表達(dá)量高于所述受體植物；所述ZmNLP1;1基因編碼SEQ?ID?No.2所示的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，在以硝態(tài)氮（NO3-）為唯一氮源的條件下，轉(zhuǎn)入ZmNLP1;1基因的擬南芥與受體擬南芥相比，其地上部生物量和總生物量明顯增加。
【專利說(shuō)明】—個(gè)來(lái)源于玉米的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因的新用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一個(gè)來(lái)源于玉米的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因的新用途，特別涉及一個(gè)來(lái)源于玉米的與硝酸鹽吸收利用相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002]氮素是植物必須的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素之一，是合成蛋白質(zhì)、核酸和許多生物活性物質(zhì)的必需組分，與作物產(chǎn)量、品質(zhì)有著密切的關(guān)系。氮肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的使用極大地提高了作物產(chǎn)量。當(dāng)前全球每年施用大約8~9千萬(wàn)噸氮肥，經(jīng)預(yù)測(cè)到2050年可增加至2.4億噸(TiIman et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:5995-6000)。能源費(fèi)用的提高導(dǎo)致了氮肥價(jià)格的不斷上漲從而增加了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，同時(shí)氮肥的流失也在逐步惡化生態(tài)環(huán)境?；诮?jīng)濟(jì)效益和環(huán)境保護(hù)的雙重考慮，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中種植氮高效作物品種已日益重要。
[0003]硝態(tài)氮是植物的主要氮源，它既作為營(yíng)養(yǎng)，又作為信號(hào)對(duì)植物的代謝和生長(zhǎng)有重要的影響。土壤中根可利用的N03_濃度是不穩(wěn)定的，變化可達(dá)100倍(Lark等2004)。植物需要不同的硝酸鹽吸收系統(tǒng)，以適應(yīng)N03_濃度的變化，從而更有效的利用土壤中的NO3'植物有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRTl和NRT2兩個(gè)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族。在擬南芥中，NRTl家族有53個(gè)基因，NRT2家族有7個(gè)基因。NRTl是低親和性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(low-affinity transport system, LATS)中的組成成分,NRT2是高親和性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(high-aff inity transport system, HATS)中的組成成分。在 AtNRTl 家族的 53 個(gè)同源蛋白中，AtNRTl.1主要負(fù)責(zé)外部NOf濃度為5mmol *L-1的NOf吸收(Tsay等1993; Okamoto等2003)。AtNRTl.1是一個(gè)雙親和性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，AtNRTl.1能適應(yīng)環(huán)境中硝酸鹽的濃度而進(jìn)行高親和性和低親和性的轉(zhuǎn)換，由低親和性轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和性是通過(guò)該蛋白質(zhì)序列的第101位的蘇氨酸(thereonine, Thr)的磷酸化進(jìn)行調(diào)控(Martin等2008)。當(dāng)外界硝酸鹽濃度低時(shí)，ThrlOl磷酸 化，促使AtNRTl.1具有高親和硝酸鹽吸收的活性；當(dāng)外界硝酸鹽濃度高時(shí)，ThrlOl去磷酸化，以致AtNRTl.1具有低親和硝酸鹽吸收的活性，這樣的機(jī)制可導(dǎo)致植物能快速適應(yīng)外界硝酸鹽濃度的變化而改變硝酸鹽的吸收方式。當(dāng)生長(zhǎng)介質(zhì)中N03_濃度(〈lmmol *L-1)較低時(shí)，根系吸收主要依賴于高親和吸收轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，高親和N03_轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白主要由NRT2家族編碼，在根部特異表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄受N03_的誘導(dǎo)。AtNRT2.1在根部的表達(dá)最強(qiáng)，是高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的主要成員。植物經(jīng)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)吸收I個(gè)N03_分子同時(shí)協(xié)同吸收2個(gè)H+，根系吸收的N03_可暫時(shí)儲(chǔ)藏在根細(xì)胞液泡內(nèi)或隨蒸騰流有木質(zhì)部導(dǎo)管輸送到地上部，也可在硝酸還原酶(NR)的作用下還原為亞硝酸根(N02_)，進(jìn)入質(zhì)體中還原為NH4+,進(jìn)入谷氨酰胺與天冬酰胺合成反應(yīng)，進(jìn)而合成植物所需的氨基酸。
[0004]玉米是重要的飼料、經(jīng)濟(jì)及生物能源作物，其在國(guó)際范圍內(nèi)的需求量與日俱增。在我國(guó)玉米生產(chǎn)中，氮肥的施用量過(guò)高，氮肥的生產(chǎn)率低下是普遍存在的現(xiàn)象(Juetal., 2009, Proc Natl Acad Sci USA, 106:3041-3046)。由于氮肥的大量施用，隨之也帶來(lái)了環(huán)境問(wèn)題(張維理等，1995，植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)1(2):80-87)。種植氮高效的玉米品種，是解決氮肥利用率低，降低生產(chǎn)成本，減小環(huán)境污染的有效途徑，也是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和增強(qiáng)產(chǎn)品國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的基本要求，但傳統(tǒng)選育新品種是個(gè)非常長(zhǎng)期的過(guò)程，現(xiàn)如今基因工程，特別是玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，使得我們有可能通過(guò)基因工程的手段快速的獲得氮高效品種。能否快速有效地獲得轉(zhuǎn)基因氮高效新品種在很大程度上取決于良好的功能基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供來(lái)源于玉米的一個(gè)蛋白質(zhì)ZmNLPl; I及編碼核酸分子的新用途，所述ZmNLPl ；1是SEQ ID N0.2所示的蛋白質(zhì)。
[0006]本發(fā)明所提供的一種新用途是利用ZmNLPl; I的編碼核酸分子培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0007]該方法具體可為培育具有如下I) -4)中至少一種性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入ZmNLPl; I基因的步驟:1)地上部分生物量高于所述受體植物；2)受硝酸鹽誘導(dǎo)后，硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量高于所述受體植物；3)受硝酸鹽誘導(dǎo)后，硝酸鹽還原酶基因表達(dá)量高于所述受體植物；4)受硝酸鹽誘導(dǎo)后，亞硝酸鹽還原酶基因表達(dá)量高于所述受體植物；
[0008]所述ZmNLPl; I基因編碼SEQ IDN0.2所示的蛋白質(zhì)。
[0009]所述受硝酸鹽誘導(dǎo)是指所述受體植物和所述轉(zhuǎn)基因植物均受硝酸鹽誘導(dǎo)。
[0010]所述硝酸鹽誘導(dǎo)可為NCV誘導(dǎo)。
[0011]所述地上部分生 物量是指除根系以外的植株部分的生物量，所述總生物量是指整個(gè)植株(由地上部分和地下部分組成)的生物量；所述生物量以鮮重或干重表示。
[0012]其中所述ZmNLPl; I基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入受體植物中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果:
[0013]I)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛(ài)的密碼子，在保持本發(fā)明所述ZmNLPl ；1基因的氨基酸序列的同時(shí)改變其密碼子以符合植物偏愛(ài)性；優(yōu)化過(guò)程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35%、多于45%、多于50%或多于約60% ；
[0014]2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；
[0015]3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來(lái)源于雙子葉植物的許多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；
[0016]4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來(lái)源于CaMV的tml，來(lái)源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接；
[0017]5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來(lái)源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來(lái)源于TMV, MCMV和AMV )。[0018]本發(fā)明中所述ZmNLPl; I基因的編碼序列具體為序列表中序列I的第355-3216位
核苷酸。
[0019]所述ZmNLPl; I基因可通過(guò)ZmNLPl; I基因表達(dá)盒或含有所述ZmNLPl; I基因表達(dá)盒的ZmNLPl ；1基因表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物。
[0020]本發(fā)明中所述ZmNLPl ；1基因表達(dá)盒均可含有所述ZmNLPl; I基因和啟動(dòng)所述ZmNLPl; I基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。本發(fā)明中所述ZmNLPl; I基因表達(dá)盒均指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)SEQ ID N0.2所示的ZmNLPl; I的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)所述ZmNLPl; I基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止所述ZmNLPl; I基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述ZmNLPl; I基因表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于:組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于:花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S;來(lái)自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶("LAP"，Chao等人(1999)Plant Physioll20:979-992);來(lái)自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)I (PRl)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子(PIN2)或LAP啟動(dòng)子(均可用茉莉酮酸曱酯誘導(dǎo))；熱休克啟動(dòng)子(美國(guó)專利5，187，267);四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(美國(guó)專利5，057，422);種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子pF128(CN101063139B(中國(guó)專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆beta conglycin的啟動(dòng)子(Beachy等人(1985)EMB0 J.4:3047-3053))。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于:農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(N0S終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚(yú)氨酸合酶終止子(參見(jiàn),例如:0dell 等人(I985)Nature313:810 ；Rosenberg 等 A(1987)Gene, 56:125 ；Guerineau 等人(1991)Mol.Gen.Genet, 262:141;Proudfoot (1991)Cell, 64:671;Sanfacon 等人 GenesDev.，5:141;Mogen 等人(1990)Plant Cell, 2:1261 ;Munroe 等人(1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人(1989)Nu`cleic Acids Res.17:7891 ；Joshi 等人(1987)Nucleic AcidRes.，15:9627)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述ZmNLPl; I基因表達(dá)盒中啟動(dòng)所述ZmNLPl; I基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S，終止所述ZmNLPl; I基因轉(zhuǎn)錄的終止子為NOS。
[0021]可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述ZmNLPl; I基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pROKI1、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對(duì)methatrexate抗性的dhfr基因,賦予對(duì)草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。
[0022]在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述選擇標(biāo)記基因?yàn)橘x予對(duì)抗生素潮霉素抗性的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hph)基因hyg。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述ZmNLPl;l基因通過(guò)含有所述ZmNLPl; I基因表達(dá)盒的ZmNLPl; I基因表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物。所述ZmNLPl; I基因表達(dá)載體是在pPTKan的BamHI位點(diǎn)插入潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hph)基因hyg,在SpeI位點(diǎn)插入SEQ ID N0.1的第355-3216位核苷酸所示的ZmNLPl; I編碼序列得到的重組表達(dá)載體。
[0023]所述ZmNLPl; I基因表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach, 1998, Method forPlantMolecular Biology VIII，Academy Press,New York,pp.411—463;GeisersonandCorey,1998，Plant Molecular Biology (2nd Edition)。
[0024]所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。當(dāng)所述目的植物為擬南芥等雙子葉植物時(shí)，所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下I) -5)中的至少一種特性:1)地上部分生物量高于所述受體植物；2)總生物量高于所述受體植物；3)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量高于所述受體植物；4)硝酸鹽還原酶基因表達(dá)量高于所述受體植物；5)亞硝酸鹽還原酶基因表達(dá)量高于所述受體植物。
[0025]所述硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為AtNRT2.1，其氨基酸序列和基因序列如Atlg08090(FilleurS, Daniel-Vedele F(1999)Expression analysis of a high-affinity nitratetransporter isolatedfrom Arabidopsis thaliana by differential display.Planta207:461 - 469)；；;所述硝酸鹽還原酶為AtNIAl，其氨基酸序列和基因序列如Atlg77760(Gutierrez RA, Giff ordML, Poultney C，Wang R, Shasha DE, CoruzziGM, CrawfordNM(2007)Insights into thegenomic nitrate response using genetics and theSungear Software System.J Exp Bot 58:2359-2367);所述亞硝酸鹽還原酶為AtNIR,其氨基酸序列和基因序列如 At2gl5620(Gutierrez RA, GiffordML, Poultney C，Wang R, ShashaDE, CoruzziGM, Crawford NM(2007)Insights into the genomic nitrate response usinggenetics and the Sungear SoftwareSystem.J Exp Bot 58:2359-2367)。
[0026]上述方法還包括在所述向受體植物中導(dǎo)入ZmNLPl; I基因后從導(dǎo)入所述ZmNLPl; I基因的植株中篩選表達(dá)ZmNLPl; I基因的植株得到所述轉(zhuǎn)基因植物的步驟。
[0027]所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。
[0028]本發(fā)明所提供的另一種新用途是ZmNLPl ；1的應(yīng)用。
[0029]本發(fā)明所提供的ZmNLPl ；I的應(yīng)用，為A至D中的至少一種:
[0030]A、調(diào)控受體植物地上部分生物量；
[0031]B、調(diào)控受體植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)；[0032]C、調(diào)控受體植物硝酸鹽還原酶基因表達(dá)；
[0033]D、調(diào)控受體植物調(diào)控亞硝酸鹽還原酶基因表達(dá)；
[0034]所述ZmNLPl; I是SEQ ID N0.2所示的蛋白質(zhì)。
[0035]本發(fā)明所提供的再一種新用途是與表達(dá)ZmNLPl; I的生物材料的應(yīng)用。
[0036]本發(fā)明所提供的表達(dá)ZmNLPl; I的生物材料的應(yīng)用為A至D中的至少一種:
[0037]A、調(diào)控受體植物地上部分生物量；
[0038]B、調(diào)控受體植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)；
[0039]C、調(diào)控受體植物硝酸鹽還原酶基因表達(dá)；
[0040]D、調(diào)控受體植物調(diào)控亞硝酸鹽還原酶基因表達(dá)；
[0041 ] 所述生物材料為I)或2 )或3 ):
[0042]I)編碼ZmNLPl; I的核酸分子，所述ZmNLPl ;1是SEQ ID N0.2所示的蛋白質(zhì)；
[0043]2)含有I)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0044]3)含有I)所述核酸分子的載體。
[0045]所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等`。所述核酸分子具體可為編碼ZmNLPl; I的基因，所述基因的編碼序列具體可為SEQ ID N0.1的第355-3216位核苷酸。
[0046]上述應(yīng)用中，2)所述的表達(dá)盒具體可為上述ZmNLPl; I基因表達(dá)盒，3)所述的載體具體可為上述ZmNLPl; I基因表達(dá)載體。
[0047]上述方法和上述應(yīng)用中提到的所述ZmNLPl; I基因表達(dá)盒或所述ZmNLPl; I基因表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0048]導(dǎo)入上文所述ZmNLPl; I基因表達(dá)盒的重組微生物或?qū)肷衔乃鯶mNLPl; I基因表達(dá)載體的重組微生物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0049]其中，所述重組微生物具體可為細(xì)菌，酵母，藻和真菌。其中，細(xì)菌可來(lái)自埃希氏菌屬(Escherichia)，歐文氏菌(Erwinia),根癌農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium),產(chǎn)喊菌屬(Alcaligenes)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，芽胞桿菌屬(Bacillus)等。
[0050]實(shí)驗(yàn)證明，在以硝態(tài)氮(N03_)為唯一氮源的條件下，轉(zhuǎn)入ZmNLPl; I基因的擬南芥與受體擬南芥相比，其地上部生物量和總生物量明顯增加，硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量、硝酸鹽還原酶基因表達(dá)量和亞硝酸鹽還原酶基因表達(dá)量升高。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0051]圖1為ZmNLPl; I基因在玉米不同組織部位的表達(dá)特性，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)分析ZmNLPl; I基因在玉米不同組織部位中的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況。
[0052]圖中，從左至右依次為苗期玉米根部、苗期玉米地上部、授粉前新葉、授粉前老葉、授粉前穗位葉、授粉前雄穗、授粉前雌穗、授粉后15天新葉、授粉后15天老葉、授粉后15天穗位葉、授粉后15天穗軸樣品。
[0053]圖2為植物過(guò)表達(dá)載體pPT-Hyg的構(gòu)建流程。
[0054]圖3為pPT-ZmNLPl; I的構(gòu)建流程。
[0055]圖4為表達(dá)ZmNLPl; I基因的轉(zhuǎn)基因系擬南芥植株的RT-PCR分子驗(yàn)證結(jié)果。[0056]圖5為在6mmol/L N03_條件下進(jìn)行水培培養(yǎng)42天收取樣品時(shí)的照片。
[0057]圖6為在6mmol/L N03_條件下進(jìn)行水培培養(yǎng)42天的地上部鮮重統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0058]圖7為表達(dá)ZmNLPl; I基因的轉(zhuǎn)基因系硝酸鹽吸收利用標(biāo)志基因的表達(dá)情況。
[0059]其中，A為硝酸鹽誘導(dǎo)后氮代謝重要關(guān)鍵基因硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRT2.1的表達(dá)變化情況，B為硝酸鹽誘導(dǎo)后氮代謝重要關(guān)鍵基因硝酸還原酶基因NIAl的表達(dá)變化情況，C為硝酸鹽誘導(dǎo)后氮代謝重要關(guān)鍵基因亞硝酸還原酶基因NIR的表達(dá)變化情況。其中橫坐標(biāo)0min、30min、60min、120min為全營(yíng)養(yǎng)液正常培養(yǎng)30天,缺氮5天后硝酸鹽處理第Omin、30min、60min、120mino
[0060]上述各圖中，Col-O表示哥倫比亞生態(tài)型擬南芥；nlp7_l為擬南芥突變體nlp7_l ；18-5，26-6和28-11為3個(gè)轉(zhuǎn)pPT-ZmNLPl; I的純合體株系。
【具體實(shí)施方式】
[0061]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0062]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0063]下述實(shí)施例中的生物材料如下:
[0064]擬南芥突變體nlp7_l 購(gòu)自 ABRC,網(wǎng)址是 http://www.arabidopsis.0rg/servlets/TairOb ject?type=germplasm&id=4628722 ;大腸桿菌 DH5 α 和根癌農(nóng)桿菌GV3101 (購(gòu)自天根生化科技有限公司)；pGEM T-Easy克隆載體購(gòu)自Promega公司；植物表達(dá)載體pPTKan和pCAMBIA1302 (Sutter et al., Selective Mobility and Sensitivity toSNAREs Is Exhibited by the ArabidopsisKATl Kl Channel at the Plasma Membrane,2006,Plant Cell 18:935-954)均從國(guó)外實(shí)驗(yàn)室免費(fèi)獲得，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。
[0065]2、工具酶及生化試劑
[0066]各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Promega公司；cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒購(gòu)自invitrogen公司；各種Taq酶和Trizol RNA小量提取試劑盒購(gòu)自Takara公司；dNTP混合物購(gòu)自上海生工；T4DNA連接酶購(gòu)自Promega公司；氨節(jié)青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、壯觀霉素(Spe)、利福平(Rif )購(gòu)自欣經(jīng)科公司。
[0067]實(shí)施例1、熒光實(shí)時(shí)定量PCR (Real-Time PCR)分析玉米ZmNLPl; I基因組織部位表達(dá)特性
[0068]選用玉米自交系B73 (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所種質(zhì)資源中心)。分別提取苗期玉米根部、苗期玉米地上部、授粉前新葉、授粉前老葉、授粉前穗位葉、授粉前雌穗、授粉前雄穗、授粉后15天新葉、授粉后15天老葉、授粉后15天穗位葉、授粉后15天穗軸、授粉后15天籽粒樣品，提取總RNA。所得總RNA經(jīng)過(guò)DNase I酶(TaKaRa公司)去除總RNA中的DNA污染后，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)和oligo d(T) 18反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。利用Real-time PCR的方法，以引物P2-F和P2-R擴(kuò)增玉米ZmNLPl; I基因，以P3-F和P3-R擴(kuò)增玉米ZmTUBI基因作為內(nèi)參對(duì)照，用同一樣品中的ZmNLPI; I基因的表達(dá)量除以ZmTUBI基因的表達(dá)量作為ZmNLPl; I基因的相對(duì)表達(dá)量，研究ZmNLPl; I基因在玉米不同組織部位中表達(dá)特性。[0069]其中，引物序列如下:P2-F:5’-ACCTGTTCGATGAAATGCCCTTAG-3’，P2_R:5’ -CGATCTCTGGTATGATTGCTCGGT-3’ ；P3_F:5’-GCTATCCTGTGATCTGCCCTGA-3’，P3_R:5’-CGCCAAACTTAATAACCCAGTA-3，。
[0070]結(jié)果如圖1所示，玉米ZmNLPl; I基因發(fā)現(xiàn)在玉米苗根、授粉前幼葉、授粉前老葉、授粉15天后老葉以及授粉15天后穗軸的表達(dá)量相對(duì)高。
[0071]上述的Real-Time PCR操作步驟:
[0072]1、提取不同樣品中的總RNA ；
[0073]2、取50μ g總RNA，用DNase I (TaKaRa公司，目錄號(hào):D2215)去除基因組DNA，方法如下:
[0074]反應(yīng)體系(50μ I):
【權(quán)利要求】
1.培育具有如下1)-4)中至少一種性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入ZmNLPl; I基因的步驟:1)地上部分生物量高于所述受體植物；2)受硝酸鹽誘導(dǎo)后，硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量高于所述受體植物；3)受硝酸鹽誘導(dǎo)后，硝酸鹽還原酶基因表達(dá)量高于所述受體植物；4)受硝酸鹽誘導(dǎo)后，亞硝酸鹽還原酶基因表達(dá)量高于所述受體植物； 所述ZmNLPl; I基因編碼SEQ ID N0.2所示的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述ZmNLPl;I基因的編碼序列是SEQ IDN0.1的第355-3216位核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述受體植物為雙子葉植物或單子葉植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于:所述方法還包括在所述向受體植物中導(dǎo)入ZmNLPl; 1基因后從導(dǎo)入所述ZmNLPl ；1基因的植株中篩選表達(dá)ZmNLPl; I基因的植株得到所述轉(zhuǎn)基因植物的步驟。
5.ZmNLPl; I的應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用為A至D中的至少一種: A、調(diào)控受體植物地上部分生物量； B、調(diào)控受體植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)； C、調(diào)控受體植物硝酸鹽還原酶基因表達(dá)； D、調(diào)控受體植物調(diào)控亞硝酸鹽還原酶基因表達(dá)； 所述ZmNLPl; I是SEQ ID N0.2所示的蛋白質(zhì)。
6.生物材料的應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用為A至D中的至少一種: A、調(diào)控受體植物地上部分生物量； B、調(diào)控受體植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)； C、調(diào)控受體植物硝酸鹽還原酶基因表達(dá)； D、調(diào)控受體植物調(diào)控亞硝酸鹽還原酶基因表達(dá)； 所述生物材料為I)或2)或3): 1)編碼ZmNLPl;I的核酸分子，所述ZmNLPl; I是SEQ ID N0.2所示的蛋白質(zhì)； 2)含有I)所述核酸分子的表達(dá)盒； 3)含有I)所述核酸分子的載體。
7.含有編碼ZmNLPl；1的核酸分子的表達(dá)盒，所述ZmNLPl; I是SEQ ID N0.2所示的蛋白質(zhì)。
8.含有編碼ZmNLPl;I的核酸分子的載體，所述ZmNLPl; I是SEQ ID N0.2所示的蛋白質(zhì)；或?qū)胨鲚d體的重組微生物。
9.含有權(quán)利要求7所述表達(dá)盒的ZmNLPl;I基因表達(dá)載體或?qū)胨鯶mNLPl; I基因表達(dá)載體的重組微生物。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK103834682SQ201210478768
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月22日
【發(fā)明者】袁力行, 王章奎, 張蕾, 顧日良, 米國(guó)華, 張福鎖 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)