專利名稱：一種建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及建立雞的永生化前脂肪細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
脂肪不僅是能量儲(chǔ)藏組織，而且是機(jī)體生長發(fā)育過程中重要的內(nèi)分泌器官。脂肪的功能發(fā)生紊亂可導(dǎo)致肥胖癥，并可引發(fā)代謝綜合癥以及多種復(fù)雜疾病，如糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、血脂異常、高血壓和惡性腫瘤等。由于肥胖癥及其相關(guān)疾病在全球發(fā)病率逐年上升，脂肪細(xì)胞分化和脂肪細(xì)胞功能研究成為了當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，腹脂過度蓄積是肉雞業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)難題。為了解決實(shí)際生產(chǎn)中肉雞腹脂過度蓄積的問題，培育優(yōu)質(zhì)低脂肉雞，我們需要有針對(duì)性地開展肉雞腹部脂肪細(xì)胞分化的研究。目前，雞脂肪細(xì)胞分化研究仍然依賴于體外培養(yǎng)的原代雞前脂肪細(xì)胞，而原 代培養(yǎng)的細(xì)胞本身存在不能無限傳代、異質(zhì)性(混合了巨噬細(xì)胞、間皮細(xì)胞或者其它一些細(xì)胞類型)、不同來源的細(xì)胞存在遺傳背景差異等難以克服的缺點(diǎn)和不足，從而導(dǎo)致了研究難以獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果。脂肪細(xì)胞分化的理想研究模型是永生化的前脂肪細(xì)胞。與體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞相比，永生化的前脂肪細(xì)胞既具有無限增殖能力，又具有正常前脂肪細(xì)胞的特征，它能提供大量穩(wěn)定均一、性狀一致的細(xì)胞來源，排除由于不同發(fā)育階段、不同生理?xiàng)l件以及不同細(xì)胞群體間的影響，保證了研究的重復(fù)性和可比性。目前，人類已通過多種方法建立了人(包括白色脂肪和棕色脂肪)、鼠、牛和豬等物種的永生化前脂肪細(xì)胞系，而雞的永生化前脂肪細(xì)胞至今尚未建立。建立永生化細(xì)胞系主要有自發(fā)突變、射線照射、化學(xué)誘變、病毒感染、病毒癌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和端粒酶活性重建等方法，其中端粒酶活性重建被認(rèn)為是目前建立永生化細(xì)胞的首選方法。人的端粒酶基因hTERT已被廣泛用于人及多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的永生化。截至目前，國內(nèi)、外尚無應(yīng)用hTERT建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的研究報(bào)道，更無利用雞的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(chTERT)和端粒酶RNA (chTR)建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決原代雞前脂肪細(xì)胞不能無限傳代、異質(zhì)性、不同來源的細(xì)胞存在遺傳背景差異等導(dǎo)致研究難以獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果的問題而提供一種建立永生化的雞前脂肪細(xì)胞的方法。本發(fā)明一種建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法按以下步驟進(jìn)行一、克隆chTERT的全長編碼區(qū)序列首先利用RNA提取試劑盒提取4日齡AA肉雞雞胚組織總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的雞胚組織總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到雞胚組織cDNA，分別設(shè)計(jì)三對(duì)擴(kuò)增引物，以雞胚組織cDNA為模板，分三段PCR擴(kuò)增chTERT的全部編碼區(qū)序列chTERT_Tl、chTERT_T2和chTERT-T3，將三段擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測及膠回收試劑盒進(jìn)行回收、純化，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物P7并利用重疊延伸PCR的方法將chTERT-Tl和chTERT_T2兩個(gè)片段拼接起來，得到 chTERT-TIT2，將 chTERT_TlT2 連接至 pMD18_TSimple 載體，將 chTERT_T3連接至PMD18-T載體，然后將兩種連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽性克隆子的篩選與鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的菌液分別擴(kuò)培并提取質(zhì)粒DNA得到PMD18TS-T1T2與PMD18T-T3，然后對(duì)pMD18TS-TlT2質(zhì)粒進(jìn)行SalI-NcoI雙酶切鑒定，對(duì)pMD18T_T3質(zhì)粒進(jìn)行SalI-NcoI和SalI-XhoI雙酶切鑒定，酶切鑒定無誤后將質(zhì)粒送交測序公司進(jìn)行測序，驗(yàn)證目的基因的正確性，將測序正確的PMD18TS-T1T2質(zhì)粒和pMD18T_T3質(zhì)粒分別進(jìn)行SalI-NcoI雙酶切，分別回收chTERT-TlT2片段與pMD18T_T3載體片段，將回收得到的chTERT-TlT2 片段與 pMD18T_T3 載體片段連接，得到 pMD18T_chTERT ；二、克隆雞端粒酶RNA基因chT R 利用AA肉雞基因組DNA為模板，以P8和P9為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進(jìn)行回收、純化，獲得chTR的基因序列，將chTR與TA克隆載體pMD18-T進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行陽性克隆子的篩選與鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的菌液進(jìn)行擴(kuò)培并提取質(zhì)粒DNA得到pMD18T-chTR,然后對(duì)pMD18T-chTR質(zhì)粒進(jìn)行BglII-Cla I雙酶切鑒定，酶切鑒定無誤后將質(zhì)粒送交測序公司進(jìn)行測序，驗(yàn)證目的基因chTR的正確性；三、構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體分別對(duì)pMD18T_chTERT和病毒載體pLXRN進(jìn)行SalI-XhoI雙酶切，分別回收chTERT和pLXRN的線性DNA片段并連接，構(gòu)建了表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXRN-chTERT,分別對(duì) pMD18T_chTR 和 pLPCX 進(jìn)行 BglII-Cla I 雙酶切，分別回收 chTR 和PLPCX的線性DNA片段并連接，構(gòu)建了表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLPCX_chTR，將構(gòu)建好的表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXRN-chTERT和表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLPCX-chTR送交測序公司進(jìn)行測序，再次驗(yàn)證目的基因克隆和載體構(gòu)建的正確性；四、包裝制備逆轉(zhuǎn)錄病毒采用轉(zhuǎn)染試劑將步驟三中制備的表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXRN-chTERT和表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLPCX-chTR分別與被膜蛋白載體PVSV-G共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞GP2-293，培養(yǎng)細(xì)胞，在24h、48h和72h收集細(xì)胞上清，過濾去除細(xì)胞碎片后加入病毒濃縮試劑，離心濃縮病毒，得到了分別表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒和表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，測定兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度，_80°C保存?zhèn)溆?；五、逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染和篩選培養(yǎng)原代雞前脂肪細(xì)胞，按照5X105cellS/ml的細(xì)胞密度鋪于培養(yǎng)皿中，用步驟四制備的表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代雞前脂肪細(xì)胞，感染48h后加入含有400 μ g/ml G418的選擇培養(yǎng)基篩選表達(dá)chTERT基因的陽性細(xì)胞，對(duì)表達(dá)chTERT基因的陽性細(xì)胞換液培養(yǎng)6個(gè)月可獲得永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-I ;或者先用步驟四制備的表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代雞前脂肪細(xì)胞，感染48h后加入含有400 μ g/mlG418的選擇培養(yǎng)基篩選表達(dá)chTERT基因的陽性細(xì)胞，篩選結(jié)束后將表達(dá)chTERT基因的陽性細(xì)胞重新鋪板，加入步驟四制備的表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染48h后加入含有2. 5 μ g/ml嘌呤霉素的選擇培養(yǎng)基篩選表達(dá)chTERT基因和chTR基因的陽性細(xì)胞，對(duì)表達(dá)chTERT基因和chTR基因的陽性細(xì)胞傳代培養(yǎng)2至3代，即可獲得永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-2 ；其中步驟一中PCR擴(kuò)增ChTERT-Tl片段所用上游引物Pl為5’-AAGTCGACCGTGGGGCCCGCTGCACGGCAG-3’，下游引物 P2 為 5 ’-GCTCTGACTGGATAACTGCTGGAAGCAGATGGGCCGGGG-3 ’，步驟一中 PCR 擴(kuò)增 chTERT-T2 所用上游引物 P3 為 5 ’-TTCCAGCAGTTATCCAGTCAGAGCGAAGTCATC-3’，下游引物 P4 為 5’ -CCATACGCAGTCATTCACTCTCATCTTCCACATC-3’，步驟一中 PCR 擴(kuò)增chTERT-T3 所用上游引物 P5 為 5’ -GCCATAACAAATGCCGGTTCTTTAAAAACGTG-3’，下游引物 P6為 5’-CGCTCGAGAGACCTTCATCCCTTAGTCCAG-3’，步驟一中重疊延伸 PCR 擴(kuò)增 chTERT_TlT2 片段所用上游引物P7為5’ -GTCGACTTGTGGGGTCCGCTGCAC-3’，下游引物為P4 ；其中步驟二中PCR擴(kuò)增雞端粒酶RNA基因chTR所用上游引物P8為5’_ACGCGTCGACACGCGTGGCGGGTGGAAGGC-3’，下游引物 P9 為 5’ -CCGCTCGAGGCGTGTGGGAGCGACGCCGTC-3’。發(fā)明效果本發(fā)明一種建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法通過導(dǎo)入chTERT基因(或先后導(dǎo)入chTERT基因和chTR基因)激活了雞前脂肪細(xì)胞自身的端粒酶活性，能夠迅速、有效的建立永生化的雞前脂肪細(xì)胞，所建立的永生化雞前脂肪細(xì)胞成功越過了復(fù)制衰老，獲得了永生性，并且該永生化雞前脂肪細(xì)胞保持了與原代雞前脂肪細(xì)胞十分相近的表型，保持了細(xì)胞 運(yùn)動(dòng)的接觸抑制和細(xì)胞增殖的密度限制，體外利用油酸誘導(dǎo)能夠分化形成脂滴，并能夠凍存和長期保存。


圖I是具體實(shí)施方式
一中利用Sal I、Xho I限制性內(nèi)切酶對(duì)pLXRN-chTERT逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖片，其中，M為DNA MarkerDL10000，I為雙酶切后的產(chǎn)物，2為pLXRN-chTERT逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體質(zhì)粒；圖2是具體實(shí)施方式
一中利用Bgl II、Cla I限制性內(nèi)切酶對(duì)pLPCX-chTR逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后2%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖片，其中，M為DNA MarkerDL5000,1為雙酶切后的產(chǎn)物，2為pLPCX-chTR逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體質(zhì)粒；圖3是具體實(shí)施方式
一中永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-I和ICPA-2中chTERT基因的表達(dá)檢測圖，其中，I為ICPA-1，2為ICPA-2，3為CPA，4為pLXRN，5為β-actin ;圖4是具體實(shí)施方式
一中永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-I和ICPA-2中chTR基因的表達(dá)檢測圖，其中，I為ICPA-1，2為ICPA-2，3為CPA，4為pLPCX ；圖5是具體實(shí)施方式
一中永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-1、ICPA-2的生長曲線，其中，—為 ICPA-I，為 ICPA-II為 CPA_1，~^為 CPA-2 ；圖6是具體實(shí)施方式
一中永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-I在累積群體倍增數(shù)為22 (PD22)時(shí)的亞匯合形態(tài)學(xué)圖；圖7是具體實(shí)施方式
一中永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-I在累積群體倍增數(shù)為22 (PD22)時(shí)的匯合形態(tài)學(xué)圖；圖8是具體實(shí)施方式
一中永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-2在累積群體倍增數(shù)為6 (roe)時(shí)的亞匯合形態(tài)學(xué)圖；圖9是具體實(shí)施方式
一中永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-2在累積群體倍增數(shù)為6 (roe)時(shí)的匯合形態(tài)學(xué)圖；圖10是具體實(shí)施方式
一中感染pLXRN病毒空載體的對(duì)照雞前脂肪細(xì)胞在累積群體倍增數(shù)為2(ro2)時(shí)的形態(tài)學(xué)圖11是具體實(shí)施方式
一中原代培養(yǎng)的雞前脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)圖；圖12是具體實(shí)施方式
一中為I代雞前脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)圖；圖13是具體實(shí)施方式
一中為3代雞前脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)圖；圖14是具體實(shí)施方式
一中永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-I、ICPA-2端粒酶活性的檢測結(jié)果圖；其中，Positive為2000個(gè)Hela細(xì)胞所具有的端粒酶活性，ICPA-1為單獨(dú)感染chTERT病毒獲得的永生化雞前脂肪細(xì)胞的 端粒酶活性、ICPA-2為先后感染chTERT病毒和chTR病毒獲得的永生化雞前脂肪細(xì)胞的端粒酶活性，chTR為單獨(dú)感染chTR病毒的雞前脂肪細(xì)胞的端粒酶活性，PLXRN為感染pLXRN病毒空載體的雞前脂肪細(xì)胞的端粒酶活性，PLPCX為感染pLPCX病毒空載體的雞前脂肪細(xì)胞的端粒酶活性，帶有HT標(biāo)記為熱失活后的樣品；MTC為端粒酶陰性對(duì)照，NTC為無模板對(duì)照；圖15是具體實(shí)施方式
一中永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-I在群體倍增數(shù)為29 (PD29)時(shí)的衰老檢測圖；圖16是具體實(shí)施方式
一中原代雞前脂肪細(xì)胞在群體倍增數(shù)為8 (PD8)時(shí)的衰老檢測圖；圖17是具體實(shí)施方式
一中永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-2在群體倍增數(shù)為13 (PD13)時(shí)的衰老檢測圖；圖18是具體實(shí)施方式
一中感染pLXRN病毒空載體的雞前脂肪細(xì)胞在群體倍增數(shù)為2(ro2)時(shí)的衰老檢測圖；圖19是具體實(shí)施方式
一中對(duì)永生化雞前脂肪細(xì)胞ICPA-I進(jìn)行體外油酸誘導(dǎo)分化圖；圖20是具體實(shí)施方式
一中對(duì)永生化雞前脂肪細(xì)胞ICPA-2進(jìn)行體外油酸誘導(dǎo)分化圖；圖21是具體實(shí)施方式
一中對(duì)永生化雞前脂肪細(xì)胞ICPA-I進(jìn)行油紅氧染色的結(jié)果圖；其中，I為經(jīng)過油酸誘導(dǎo)的ICPA-I細(xì)胞進(jìn)行油紅氧染色的結(jié)果圖，2為未經(jīng)過油酸誘導(dǎo)的ICPA-I細(xì)胞進(jìn)行油紅氧染色的結(jié)果圖；圖22是具體實(shí)施方式
一中對(duì)永生化雞前脂肪細(xì)胞ICPA-2進(jìn)行油紅氧染色的結(jié)果圖；其中，I為經(jīng)過油酸誘導(dǎo)的ICPA-2細(xì)胞進(jìn)行油紅氧染色的結(jié)果圖，2為未經(jīng)過油酸誘導(dǎo)的ICPA-2細(xì)胞進(jìn)行油紅氧染色的結(jié)果圖；圖23是具體實(shí)施方式
一中對(duì)永生化雞前脂肪細(xì)胞ICPA-I進(jìn)行油紅氧提取比色的結(jié)果圖，其中，I為經(jīng)過油酸誘導(dǎo)的ICPA-I細(xì)胞進(jìn)行油紅氧提取后在510nm下的比色值，2為未經(jīng)油酸誘導(dǎo)的ICPA-I細(xì)胞進(jìn)行油紅氧提取后在510nm下的比色值。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法按以下步驟進(jìn)行一、克隆chTERT的全長編碼區(qū)序列首先利用RNA提取試劑盒提取4日齡AA肉雞雞胚組織總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的雞胚組織總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到雞胚組織cDNA，分別設(shè)計(jì)三對(duì)擴(kuò)增引物，以雞胚組織cDNA為模板，分三段PCR擴(kuò)增chTERT的全部編碼區(qū)序列chTERT-Tl、chTERT_T2和chTERT-T3，將三段擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測及膠回收試劑盒進(jìn)行回收、純化，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物P7并利用重疊延伸PCR的方法將chTERT-Tl和chTERT_T2兩個(gè)片段拼接起來，得到 chTERT-T IT2，將 chTERT-T IT2 連接至 pMD18_TSimple 載體，將 chTERT_T3連接至PMD18-T載體，然后將兩種連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽性克隆子的篩選與鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的菌液分別擴(kuò)培并提取質(zhì)粒DNA得到PMD18TS-T1T2與PMD18T-T3，然后對(duì)pMD18TS-TlT2質(zhì)粒進(jìn)行SalI-NcoI雙酶切鑒定，對(duì)pMD18T_T3質(zhì)粒進(jìn)行SalI-NcoI和SalI-XhoI雙酶切鑒定，酶切鑒定無誤后將質(zhì)粒送交測序公司進(jìn)行測序，驗(yàn)證目的基因的正確性，將測序正確的PMD18TS-T1T2質(zhì)粒和pMD18T_T3質(zhì)粒分別進(jìn)行SalI-NcoI雙酶切，分別回收chTERT-TlT2片段與pMD18T_T3載體片段，將回收得到的chTERT-TlT2 片段與 pMD18T_T3 載體片段連接，得到 pMD18T_chTERT ；二、克隆雞端粒酶RNA基因chTR 利用AA肉雞基因組DNA為模板，以P8和P9為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進(jìn)行回收、純化，獲得chTR的基因序列，將chTR與TA克隆載體pMD18-T進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，然后 進(jìn)行陽性克隆子的篩選與鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的菌液進(jìn)行擴(kuò)培并提取質(zhì)粒DNA得到pMD18T-chTR，然后對(duì)pMD18T-chTR質(zhì)粒進(jìn)行Bgl II-Cla I雙酶切鑒定，酶切鑒定無誤后將質(zhì)粒送交測序公司進(jìn)行測序，驗(yàn)證目的基因chTR的正確性；三、構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體 分別對(duì)pMD18T_chTERT和病毒載體pLXRN進(jìn)行SalI-XhoI雙酶切，分別回收chTERT和pLXRN的線性DNA片段并連接，構(gòu)建了表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXRN-chTERT，分別對(duì) pMD18T-chTR 和 pLPCX 進(jìn)行 Bgl II-Cla I 雙酶切，分別回收 chTR 和pLPCX的線性DNA片段并連接，構(gòu)建了表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLPCX-chTR，將構(gòu)建好的表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXRN-chTERT和表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLPCX-chTR送交測序公司進(jìn)行測序，再次驗(yàn)證目的基因克隆和載體構(gòu)建的正確性；四、包裝制備逆轉(zhuǎn)錄病毒采用轉(zhuǎn)染試劑將步驟三中制備的表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXRN-chTERT和表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLPCX-chTR分別與被膜蛋白載體PVSV-G共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞GP2-293，培養(yǎng)細(xì)胞，在24h、48h和72h收集細(xì)胞上清，過濾去除細(xì)胞碎片后加入病毒濃縮試劑，離心濃縮病毒，得到了分別表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒和表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，測定兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度，_80°C保存?zhèn)溆?；五、逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染和篩選培養(yǎng)原代雞前脂肪細(xì)胞，按照5X105cellS/ml的細(xì)胞密度鋪于培養(yǎng)皿中，用步驟四制備的表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代雞前脂肪細(xì)胞，感染48h后加入含有400 μ g/ml G418的選擇培養(yǎng)基篩選表達(dá)chTERT基因的陽性細(xì)胞，對(duì)表達(dá)chTERT基因的陽性細(xì)胞換液培養(yǎng)6個(gè)月可獲得永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-I ;或者先用步驟四制備的表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代雞前脂肪細(xì)胞，感染48h后加入含有400 μ g/mlG418的選擇培養(yǎng)基篩選表達(dá)chTERT基因的陽性細(xì)胞，篩選結(jié)束后將表達(dá)chTERT基因的陽性細(xì)胞重新鋪板，加入步驟四制備的表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染48h后加入含有2. 5 μ g/ml嘌呤霉素的選擇培養(yǎng)基篩選表達(dá)chTERT基因和chTR基因的陽性細(xì)胞，對(duì)表達(dá)chTERT基因和chTR基因的陽性細(xì)胞傳代培養(yǎng)2至3代，即可獲得永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-2 ；其中步驟一中PCR擴(kuò)增chTERT-Tl片段所用上游引物Pl為5’-AAGTCGACCGTGGGGCCCGCTGCACGGCAG-3’，下游引物 P2 為 5’-GCTCTGACTGGATAACTGCTGGAAGCAGATGGGCCGGGG-3’，步驟一中 PCR 擴(kuò)增 chTERT-T2 所用上游引物 P3 為 5 ’-TTCCAGCAGTTATCCAGTCAGAGCGAAGTCATC-3’，下游引物 P4 為 5’ -CCATACGCAGTCATTCACTCTCATCTTCCACATC-3’，步驟一中 PCR 擴(kuò)增chTERT-T3 所用上游引物 P5 為 5’ -GCCATAACAAATGCCGGTTCTTTAAAAACGTG-3’，下游引物 P6為 5’-CGCTCGAGAGACCTTCATCCCTTAGTCCAG-3’，步驟一中重疊延伸 PCR 擴(kuò)增 chTERT_TlT2 片段所用上游引物P7為5’ -GTCGACTTGTGGGGTCCGCTGCAC-3’，下游引物為P4 ；其中步驟二中PCR擴(kuò) 增雞端粒酶RNA基因chTR所用上游引物P8為5’_ACGCGTCGACACGCGTGGCGGGTGGAAGGC-3’，下游引物 P9 為 5’ -CCGCTCGAGGCGTGTGGGAGCGACGCCGTC-3’。本實(shí)施方式效果本發(fā)明一種建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法通過導(dǎo)入chTERT基因(或先后導(dǎo)入chTERT基因和chTR基因)激活了雞前脂肪細(xì)胞自身的端粒酶活性，能夠迅速、有效的建立永生化的雞前脂肪細(xì)胞，所建立的永生化雞前脂肪細(xì)胞成功越過了復(fù)制衰老，獲得了永生性，并且該永生化雞前脂肪細(xì)胞保持了與原代雞前脂肪細(xì)胞十分相近的表型，保持了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的接觸抑制和細(xì)胞增殖的密度限制，體外利用油酸誘導(dǎo)能夠分化形成脂滴，并能夠凍存和長期保存。本實(shí)施方式步驟一中的chTERT基因的全長編碼區(qū)序列為GenBank中發(fā)表的原雞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(chTERT)mRNA序列NM_001031007，其序列如Seq ID No 1所示，本實(shí)施方式步驟二中的chTR基因序列為GenBank中發(fā)表的原雞端粒酶RNA(chTR)序列NR_001594，其序列如Seq ID No 2所不； 本實(shí)施方式步驟一中提取4日齡AA肉雞雞胚組織總RNA的試劑盒為購買自O(shè)MEGA公司的OMEGA E. Z. N. A. Total RNA Kit II，具體操作步驟參照說明書；步驟一中使用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒為購買自Promega公司的Promega ImProm-II,具體操作步驟參照說明書；步驟一中使用的膠回收試劑盒為購買自Axygen公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒,具體操作步驟參照說明書；本實(shí)施方式中的大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細(xì)胞購買自哈爾濱海基公司；本實(shí)施方式中的轉(zhuǎn)化方法為熱激法；質(zhì)粒DNA提取使用的試劑盒購買自Axygen公司的AxyPrep質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒；AA肉雞購買自哈爾濱益農(nóng)禽業(yè)有限公司；本實(shí)施方式中的pLXRN和pLPCX逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體、pVSV-G被膜蛋白載體、GP2-293病毒包裝細(xì)胞購買自Clontech公司；本實(shí)施方式中pMD18-T Simple載體和pMD18_T載體購買自TaKaRa公司；本實(shí)施方式中細(xì)胞端粒酶活性檢測試劑盒購買自Chemicon公司的TRAPEZERTTelomerase Detection Kit,具體操作步驟參照說明書；本實(shí)施方式中的細(xì)胞衰老檢測試劑盒為碧云天公司的細(xì)胞衰老半乳糖苷酶染色試劑盒，具體操作步驟參照說明書；本實(shí)施方式所用的完全培養(yǎng)基成分為DMEM/F12添加了 100units/ml的青霉素G鈉，100 μ g/ml的鏈霉素和10%的胎牛血清，其中DMEM/F12購買自Gibco公司，胎牛血清購買自TBD公司。本實(shí)施方式所用的選擇培養(yǎng)基成分為完全培養(yǎng)基添加了終濃度為400 μ g/ml的G418或者完全培養(yǎng)基添加了終濃度為2. 5 μ g/ml Puromycin,其中G418和Puromycin購買自Clontech公司。本實(shí)施方式步驟四中包裝制備chTERT和chTR逆轉(zhuǎn)錄病毒的具體步驟如下(I)提取逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLXRN-chTERT、pLPCX-chTR、pLXRN 和 pLPCX 的高純質(zhì)粒，_20°C凍存；(2)選擇羅氏FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，具體步驟按照說明書操作；(3)轉(zhuǎn)染前12 24h將GP2-293細(xì)胞接種在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長至80%匯合時(shí)，配制轉(zhuǎn)染混合液進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后8 10小時(shí)吸出培養(yǎng)基，加入3ml完全培養(yǎng)基，分別在24h、48h和72h收集細(xì)胞上清； (4) 500 X g、4°C離心10分鐘，或經(jīng)0.45 μ m濾器(低蛋白結(jié)合)過濾，去除細(xì)胞碎片;(5)將所有病毒上清轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，按照I體積病毒液加入4體積濃縮試劑的比例加入Retro-X Concentrator病毒濃縮試劑,輕輕混勻，置于4°C孵育過夜；(6) 1500父8、4。(離心4511^11;(7)移除上清，不要攪動(dòng)管壁，用原體積O. 5 1%的DMEM/F12培養(yǎng)基輕輕的再懸浮病毒沉淀，按感染用量將濃縮病毒分裝到單獨(dú)的EP管中以免反復(fù)凍融，最后將管凍存于-80°C備用；其中，步驟(3)中的轉(zhuǎn)染混合液配制方法為(I)質(zhì)粒DNA :逆轉(zhuǎn)錄病毒載體5 μ g，pVSV-G被膜蛋白載體5 μ g ;(2) FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑25 μ I ;(3) DMEM/F12培養(yǎng)基加至終體積500 μ I。本實(shí)施方式步驟四中測定逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度的具體步驟如下(I)測定滴度前一天準(zhǔn)備好ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞將細(xì)胞鋪于6孔板中，密度為每孔O. 5 I X IO5個(gè)細(xì)胞，每孔加2ml完全培養(yǎng)基；(2)準(zhǔn)備20ml完全培養(yǎng)基并加入濃度為4mg/ml的聚凝胺60 μ I ;(3)按如下方法準(zhǔn)備6組10倍病毒稀釋液①加I. 35ml步驟(2)中制備的培養(yǎng)基到6個(gè)I. 5ml EP管中；②加150 μ I要測定滴度的病毒液到I管中，混合；③從I管中轉(zhuǎn)移150 μ I病毒稀釋液到2管中，混合，再轉(zhuǎn)移150 μ I稀釋液到下一個(gè)管中連續(xù)稀釋；(4)感染NIH 3Τ3細(xì)胞分別將6組10倍稀釋的病毒液各取Iml加入到步驟(I)中6孔板的I至6孔中；(5)感染24h后，使細(xì)胞在抗生素篩選濃度下培養(yǎng)一周；(6)病毒的滴度等于含有克隆的最高稀釋度下的克隆數(shù)量X稀釋倍數(shù)如在IO6稀釋倍數(shù)下存在4個(gè)克隆可表示為4X 106cfu/ml。本實(shí)施方式步驟五中測定雞前脂肪細(xì)胞的最佳藥物篩選濃度和最佳細(xì)胞鋪板密度的具體步驟如下A藥物最佳篩選濃度的測定(I)將2X IO5的原代雞前脂肪細(xì)胞鋪于6孔板中，每孔加入2ml完全培養(yǎng)基，并加入終濃度為 O，50，100，200，400，800 μ g/ml 的 G418，或加入終濃度為 0，1，2· 5,5,7. 5，10 μ g/ml的Puro (嘌呤霉素)；(2)培養(yǎng)細(xì)胞10 14天，每四天更換一次選擇培養(yǎng)基(或更頻繁)；(3)每兩天檢查一次細(xì)胞活力；選擇在5天內(nèi)使得大量細(xì)胞死亡、在兩周內(nèi)殺死全部細(xì)胞的最低濃度作為該藥物的最佳篩選濃度；B細(xì)胞最佳鋪板密度的測定(I)按照 5 X IO6,1 X IO6, 5 X IO5, 2 X IO5,1 X IO5, 5 X IO4 的細(xì)胞密度將細(xì)胞鋪于 6
孔板中，每孔加入2ml最佳濃度的選擇培養(yǎng)基；(2)培養(yǎng)細(xì)胞5 14天，每四天更換一次選擇培養(yǎng)基；(3)每兩天檢查一次細(xì)胞活力；選擇細(xì)胞大量死亡之前(大約5天)匯合度達(dá)到80%的鋪板密度作為該細(xì)胞的最佳鋪板密度，測定結(jié)果見表I :表I
權(quán)利要求
1.一種建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法，其特征在于建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法按以下步驟實(shí)現(xiàn) 一、克隆ChTERT的全長編碼區(qū)序列 首先利用RNA提取試劑盒提取4日齡AA肉雞雞胚組織總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的雞胚組織總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到雞胚組織cDNA，分別設(shè)計(jì)三對(duì)擴(kuò)增引物，以雞胚組織cDNA為模板，分三段PCR擴(kuò)增chTERT的全部編碼區(qū)序列chTERT_Tl、chTERT_T2和chTERT-T3，將三段擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測及膠回收試劑盒進(jìn)行回收、純化，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物P7并利用重疊延伸PCR的方法將chTERT-Tl和chTERT_T2兩個(gè)片段拼接起來，得到 chTERT-TlT2，將 chTERT_TlT2 連接至 pMD18_T Simple 載體，將 chTERT_T3連接至PMD18-T載體，然后將兩種連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽性克隆子的篩選與鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的菌液分別擴(kuò)培并提取質(zhì)粒DNA得到PMD18TS-T1T2與PMD18T-T3，然后對(duì)pMD18TS-TlT2質(zhì)粒進(jìn)行SalI-NcoI雙酶切鑒定，對(duì)pMD18T_T3質(zhì)粒進(jìn)行SalI-NcoI和SalI-XhoI雙酶切鑒定，酶切鑒定無誤后將質(zhì)粒送交測序公司進(jìn)行測序，驗(yàn)證目的基因的正確性，將測序正確的PMD18TS-T1T2質(zhì)粒和pMD18T_T3質(zhì)粒分別進(jìn)行SalI-NcoI雙酶切，分別回收chTERT-TlT2片段與pMD18T_T3載體片段，將回收得到的chTERT-TlT2 片段與 pMD18T_T3 載體片段連接，得到 pMD18T_chTERT ； 二、克隆雞端粒酶RNA基因chTR 利用AA肉雞基因組DNA為模板，以P8和P9為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進(jìn)行回收、純化，獲得chTR的基因序列，將chTR與TA克隆載體pMD18-T進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行陽性克隆子的篩選與鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的菌液進(jìn)行擴(kuò)培并提取質(zhì)粒DNA得到pMD18T-chTR，然后對(duì)pMD18T-chTR質(zhì)粒進(jìn)行Bgl II -Cla I雙酶切鑒定，酶切鑒定無誤后將質(zhì)粒送交測序公司進(jìn)行測序，驗(yàn)證目的基因chTR的正確性； 三、構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體 分別對(duì)pMD18T-chTERT和病毒載體pLXRN進(jìn)行SalI-XhoI雙酶切，分別回收chTERT和PLXRN的線性DNA片段并連接，構(gòu)建了表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXRN-chTERT，分別對(duì)pMD18T-chTR和pLPCX進(jìn)行Bgl II -Cla I雙酶切，分別回收chTR和pLPCX的線性DNA片段并連接，構(gòu)建了表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLPCX-chTR，將構(gòu)建好的表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXRN-chTERT和表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLPCX-chTR送交測序公司進(jìn)行測序，再次驗(yàn)證目的基因克隆和載體構(gòu)建的正確性； 四、包裝制備逆轉(zhuǎn)錄病毒 采用轉(zhuǎn)染試劑將步驟三中制備的表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXRN-chTERT和表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLPCX-chTR分別與被膜蛋白載體pVSV_G共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞GP2-293，培養(yǎng)細(xì)胞，在24h、48h和72h收集細(xì)胞上清，過濾去除細(xì)胞碎片后加入病毒濃縮試劑，離心濃縮病毒，得到了分別表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒和表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，測定兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度，-80°C保存?zhèn)溆茫? 五、逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染和篩選 培養(yǎng)原代雞前脂肪細(xì)胞，按照5X105cellS/ml的細(xì)胞密度鋪于培養(yǎng)皿中，用步驟四制備的表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代雞前脂肪細(xì)胞，感染48h后加入含有400 μ g/mlG418的選擇培養(yǎng)基篩選表達(dá)chTERT基因的陽性細(xì)胞，對(duì)表達(dá)chTERT基因的陽性細(xì)胞換液培養(yǎng)6個(gè)月可獲得永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-I ;或者先用步驟四制備的表達(dá)chTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代雞前脂肪細(xì)胞，感染48h后加入含有400 μ g/ml G418的選擇培養(yǎng)基篩選表達(dá)chTERT基因的陽性細(xì)胞，篩選結(jié)束后將表達(dá)chTERT基因的陽性細(xì)胞重新鋪板，加入步驟四制備的表達(dá)chTR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染48h后加入含有2. 5 μ g/ml嘌呤霉素的選擇培養(yǎng)基篩選表達(dá)chTERT基因和chTR基因的陽性細(xì)胞，對(duì)表達(dá)chTERT基因和chTR基因的陽性細(xì)胞傳代培養(yǎng)2至3代，即可獲得永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-2 ； 其中步驟一中PCR擴(kuò)增chTERT-Tl片段所用上游引物Pl為5’ -AAGTCGACCGTGGGGCCCGCTGCACGGCAG-3’，下游引物 P2 為 5’ -GCTCTGACTGGATAACTGCTGGAAGCAGATGGGCCGGGG-3’，步驟一中 PCR 擴(kuò)增 chTERT-T2 所用上游引物 P3 為 5 ’-TTCCAGCAGTTATCCAGTCAGAGCGAAGTCATC-3’，下游引物 P4 為 5’ -CCATACGCAGTCATTCACTCTCATCTTCCACATC-3’，步驟一中 PCR 擴(kuò)增chTERT-T3 所用上游引物 P5 為 5’ -GCCATAACAAATGCCGGTTCTTTAAAAACGTG-3’，下游引物 P6為 5’-CGCTCGAGAGACCTTCATCCCTTAGTCCAG-3’，步驟一中重疊延伸 PCR 擴(kuò)增 chTERT_TlT2 片段所用上游引物P7為5’ -GTCGACTTGTGGGGTCCGCTGCAC-3’，下游引物為P4 ； 其中步驟二中PCR擴(kuò)增雞端粒酶RNA基因chTR所用上游引物P8為5 ’-ACGCGTCGACACGCGTGGCGGGTGGAAGGC-3’，下游引物 P9 為 5’ -CCGCTCGAGGCGTGTGGGAGCGACGCCGTC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法，其特征在于步驟一中PCR擴(kuò)增chTERT的編碼區(qū)序列chTERT-Tl的反應(yīng)體系為50 μ L，由下列成分組成
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法，其特征在于步驟一中PCR擴(kuò)增chTERT的編碼區(qū)序列chTERT-T2的反應(yīng)體系為50 μ L，由下列成分組成
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法，其特征在于步驟一中PCR擴(kuò)增chTERT的編碼區(qū)序列chTERT-T3的反應(yīng)體系為50 μ L，由下列成分組成
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法，其特征在于步驟一中利用重疊延伸PCR的方法將chTERT-Tl與chTERT-T2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接獲得chTERT-TlT2,反應(yīng)體系為50 μ L，由下列成分組成
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法，其特征在于步驟二中PCR擴(kuò)增雞端粒酶RNA基因chTR的反應(yīng)體系為50 μ L，由下列成分組成
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法，其特征在于步驟一中PMD18TS-T1T2質(zhì)粒和pMD18T_T3質(zhì)粒分別進(jìn)行SalI-NcoI雙酶切反應(yīng)體系如下成分用量 pMD18TS-TlT2 質(zhì)?；?pMD丨 8T-T3 質(zhì)粒(^L 限制性核酸內(nèi)切酶Sail 限制性核酸內(nèi)切酶NcolI μIOxTbuffer3μL 0.1% BSA2ill 無菌水7pL 酶切反應(yīng)條件37°C水浴，反應(yīng)lh。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法，其特征在于步驟一中PMD18T-T3質(zhì)粒、步驟三中pMD18T-chTERT質(zhì)粒和步驟三中pLXRN病毒載體質(zhì)粒分別進(jìn)行SalI-XhoI雙酶切反應(yīng)體系如下成分用量 pMD18T-T3 質(zhì)?；?pMD18T-chTERT 質(zhì)粒 6μ1, 或pLXRN病毒載體質(zhì)粒限制性核酸內(nèi)切酶SallI μ 限制性核酸內(nèi)切酶JftoIΙμΙ IOx H buffer2‘uL 無囷水IOpL 酶切反應(yīng)條件37°C水浴，反應(yīng)lh。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法，其特征在于步驟二中pMD18T-chTR質(zhì)粒、步驟三中pMD18T-chTR質(zhì)粒和步驟三中pLPCX病毒載體質(zhì)粒分別進(jìn)行Bgl II -Cla I雙酶切反應(yīng)體系如下 成分用量pMD18T-chTR質(zhì)?；騪LPCX病毒載體質(zhì)粒6μ 限制性核酸內(nèi)切酶BgfllIpL 限制性核酸內(nèi)切酶ClalΙμIOx H buffer2μΙ. 無菌水iOpL 酶切反應(yīng)條件37°C水浴，反應(yīng)lh。
全文摘要
一種建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法，本發(fā)明涉及建立雞永生化前脂肪細(xì)胞的方法。本發(fā)明是要解決原代雞前脂肪細(xì)胞不能無限傳代、異質(zhì)性、不同來源的細(xì)胞存在遺傳背景差異等導(dǎo)致研究難以獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果的問題。一、克隆雞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因chTERT；二、克隆雞端粒酶RNA基因chTR；三、構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體；四、包裝制備逆轉(zhuǎn)錄病毒；五、永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-1和永生化雞前脂肪細(xì)胞系ICPA-2的獲得。本發(fā)明應(yīng)用于建立雞永生化前脂肪細(xì)胞領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/867GK102876717SQ201210420889
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月29日
發(fā)明者王偉, 李輝, 閆曉紅, 王寧 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)