專利名稱：枯草芽孢菌在高產(chǎn)腺苷且聯(lián)產(chǎn)乙偶姻中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及枯草芽孢菌在高產(chǎn)腺苷且聯(lián)產(chǎn)乙偶姻中的應用。
背景技術(shù)：
腺苷(Adenosine)又稱腺嘌呤核苷，由糖苷鍵連接腺嘌呤和核糖而成，是人體細胞中具有重要生理功能的內(nèi)源性核苷。腺苷以其擴張血管作用而被人們所熟知，具有廣泛的心臟效應以及快速顯著的冠脈擴張作用，大量研究表明，腺苷還具有觸發(fā)或介導缺血預適應、減少再灌注損傷等心臟保護效應。在美國，腺苷是經(jīng)FDA批準的轉(zhuǎn)復陣發(fā)性室上性心動過速(PSVT)的一線藥物，也是經(jīng)FDA批準的用于心臟藥物負荷試驗的兩種藥物之一，已成為急診處理快速心律失常和藥物負荷試驗的常規(guī)用藥。另外腺苷還是重要的醫(yī)藥中間體，可合成8-氯腺苷、嘌呤毒素、高瓜氨基腺苷、賴氨酰氨基腺苷、S-甲硫腺苷、阿糖腺苷、環(huán)磷酸腺苷、三磷酸腺苷等。因此，腺苷具有廣闊的市場和開發(fā)前景。乙偶姻(Acetoin)，即3_羥基丁酮，自然地存在于玉米、葡萄酒、蜂蜜、可可、黃油、咖啡、草莓和醋栗等物質(zhì)中。由于其具有特有的奶油香味，因此多用于奶油、干酪、咖啡、堅果的香味增強劑，同時也可以用于配制奶油、乳品、酸乳和草莓型香精等，啤酒風味、奶酪香味均與乙偶姻有關(guān)。因此，乙偶姻在食品、制藥、香料以及化妝品等行業(yè)都有著非常重要的用途，同時作為一種新興的平臺化合物，也廣泛應用于其他行業(yè)。目前，腺苷和乙偶姻的生產(chǎn)方法主要有化學合成法、酶法和發(fā)酵法三種。腺苷的化學合成法主要是以次黃嘌呤、肌苷、2-甲基硫代腺苷、2，8-二氯嘌呤、2'，3'，5'-三乙?；吸S苷等為起始原料，經(jīng)過多步反應合成的。乙偶姻的化學合成方法主要是丁二酮部分加氫還原和2，3- 丁二醇選擇性氧化生產(chǎn)?；瘜W法合成腺苷及乙偶姻此方法溶劑損耗量大，收率低，成本高，產(chǎn)量小，且環(huán)境污染嚴重。腺苷的酶解法就是用酶將RNA降解得到的腺苷，但是RNA降解過程產(chǎn)生4種核苷的混合物，給提取分離帶來很大困難，也增加了成本。乙偶姻的酶轉(zhuǎn)化法主要是通過分離純化丁二酮還原酶，催化丁二酮的還原，得到乙偶姻，但該法獲得大量特異性的酶比較困難，并且原料與化學法相同，都為丁二酮或2，3- 丁二醇，存在同樣的原料限制。腺苷發(fā)酵工藝技術(shù)首推日本，早在70年代就開始了該領(lǐng)域的研究，取得了一系列成果，迄今已進入大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)階段；國內(nèi)發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷起步較晚，目前有少數(shù)幾家研究單位進行研究，主要采用物理、化學方法對肌苷產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌進行誘變處理，選育出特定營養(yǎng)缺陷型菌，進行發(fā)酵生產(chǎn)腺苷。自然界中某些細菌具有產(chǎn)乙偶姻的能力，能以糖質(zhì)為原料進行發(fā)酵生產(chǎn)，但通常乙偶姻是作為丁二酮和2，3 丁二酮的副產(chǎn)物，產(chǎn)量較少。因此通過菌株的篩選分離或分子改造，可以選育到高產(chǎn)乙偶姻的菌株，進行大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。綜上所述，現(xiàn)有的技術(shù)都是利用枯草芽孢桿菌單獨生產(chǎn)腺苷或乙偶姻，存在原料利用率低、成本高的問題。發(fā)酵法高產(chǎn)腺苷且聯(lián)產(chǎn)乙偶姻避免了這些問題，以期待減輕資源和環(huán)境壓力，提聞廣品質(zhì)量。申請人:于2011年I月5日申請過一項專利“一種高產(chǎn)腺苷的枯草芽孢菌”(201110000716. 8)，并對其中的生產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌(BaciIIus subtilis)A_409進行了保藏。目前該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼為100101，其保藏編號為CGMCC No. 4484，保藏日期為2010年12月17日。申請人:在無意間發(fā)現(xiàn)該菌株不但可以高產(chǎn) 腺苷，還可以用于聯(lián)產(chǎn)乙偶姻，因此產(chǎn)生了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供枯草芽孢菌在高產(chǎn)腺苷且聯(lián)產(chǎn)乙偶姻中的應用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下枯草芽孢菌在高產(chǎn)腺苷且聯(lián)產(chǎn)乙偶姻中的應用，所述的枯草芽孢菌(Bacillussubtilis)為 CGMCC No. 4484。具體的操作方法是，將CGMCC No. 4484接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，再將種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)腺苷及乙偶姻。其中，所述的種子培養(yǎng)基包含如下組分葡萄糖10_30g/L，蛋白胨5_15g/L，玉米漿 10-20ml/L,酵母膏 10-20g/L, MgSO4 · 7H20 O. 1-lg/L，NaCl 3_5g/L，鳥苷 0. 01-0. 05g/L,其余為水，pH 6. 0-7. O。其中，種子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-40°C，優(yōu)選為32-35°C;培養(yǎng)時間為12-24小時，優(yōu)選20-22小時。其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下組分葡萄糖60_120g/L，酵母膏10_20g/L，(NH4)2SO4 10-20g/L,尿素 2-6g/L，KH2PO4 2_6g/L，KCl 2_6g/L，MgSO4 · 7H20 0. 1-lg/L,MnSO4 · H2O 0. 01-0. 05g/L，豆餅水解物 5_30ml/L，CaCO3 10_40g/L，其余為水，ρΗ6· 0-7. 0。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加檸檬酸鈉，檸檬酸鈉的添加濃度為l_5g/L。其中，發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25_40°C，優(yōu)選為32-35°C;培養(yǎng)時間為48_72小時，優(yōu)選為60-66小時。發(fā)酵罐通氣攪拌的溶氧范圍控制在30%-60%，優(yōu)選為45%。其中，所述的發(fā)酵生產(chǎn)條件為接種量5 20% (v/v)，優(yōu)選接種量為8-10%。菌株的生長、腺苷及乙偶姻含量曲線見附圖I。如圖I所示，發(fā)酵前期0_6h，菌體生長緩慢，伴隨著一個明顯的延滯期，由于菌體量比較小，且剛適應培養(yǎng)基環(huán)境，因此菌體生長比較緩慢，基本沒有腺苷及乙偶姻的生成，葡萄糖消耗速率也較??；6h后菌體進入對數(shù)生長期，由于需要消耗葡萄糖來滿足菌體生長的要求以及合成各前體物質(zhì)來滿足腺苷及乙偶姻的生成，培養(yǎng)基中的葡萄糖含量急劇下降，菌體濃度迅速增加，腺苷及乙偶姻快速增長，菌體在生長過程中代謝產(chǎn)生有機酸使培養(yǎng)液PH下降；30h以后，菌進入穩(wěn)定期，葡萄糖消耗減慢，菌體總量的增長幅度不再明顯，腺苷及乙偶姻平穩(wěn)增長。54h進入發(fā)酵后期，菌體逐漸衰亡，已無法再消耗葡萄糖，而腺苷及乙偶姻的產(chǎn)量稍有增加，說明該菌是生長半耦聯(lián)型。本發(fā)明的有益效果
I.本發(fā)明篩選到了一株高產(chǎn)腺苷且聯(lián)產(chǎn)乙偶姻的枯草芽孢桿菌，該菌能利用多種碳源和氮源發(fā)酵生產(chǎn)腺苷并聯(lián)產(chǎn)乙偶姻，操作方便簡單，培養(yǎng)條件粗放。2.采用本發(fā)明方法選育出的高產(chǎn)腺苷聯(lián)產(chǎn)乙偶姻的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) A409 (CGMCC No. 4484)，具有高產(chǎn)性狀穩(wěn)定的特點，該菌株經(jīng)過10代以上傳代，生產(chǎn)腺苷及乙偶姻的性能保持穩(wěn)定，具有很強的工業(yè)使用性價值。3.本發(fā)明還獲得了發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的最優(yōu)發(fā)酵條件，使用本發(fā)明篩選的高產(chǎn)菌，選擇最適的碳源和氮源的濃度，最佳pH,在33°C下發(fā)酵60小時,腺苷的產(chǎn)量穩(wěn)定在25g/L,乙偶姻的產(chǎn)量穩(wěn)定在16g/L，操作方便簡單。4.本發(fā)明通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加檸檬酸鈉，使腺苷的產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高到25. lg/L，乙偶姻提高到16. 2g/L。該菌具有較高的合成腺苷和乙偶姻的能力，其中乙偶姻的還原態(tài)副產(chǎn)物2，3- 丁二醇的產(chǎn)量很低，為O. 2g/L左右。
5.本發(fā)明篩選到的腺昔聞廣菌株還能副廣聞價值的乙偶姻，提聞了廣品生廣效率。


圖I為枯草芽孢菌A409發(fā)酵生產(chǎn)腺苷且聯(lián)產(chǎn)乙偶姻的過程曲線圖。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。以下實施例使用的分析方法如下發(fā)酵液中的產(chǎn)物腺苷采用Agilent 1100高效液相色譜儀測定，色譜柱為江蘇淮陰漢邦科技有限公司Lichrospher C18 [4. 6x250mm, 5um],流動相V(甲醇):V(pH6. 6的磷酸三乙胺溶液)=30 :70，柱溫:室溫，檢測波長254nm，流速0. 8mL · min—1，進樣量:20 μ L。乙偶姻以及各種副產(chǎn)物如乙酸、乳酸等采用Agilent 1100高效液相色譜儀測定，色譜柱為Aminex HPX-87H離子排斥色譜柱(300mmX7. 8mmX9 μ m),流動相為3mmol/LH2SO4,流速O. 4mL/min，柱溫60° C，檢測波長210nm，進樣量為20 μ L。2，3- 丁二醇采用Agilent7890A氣相色譜儀測定，色譜柱為安捷倫HP-5(30mX0. 25mmX0. 25 μ m)，氫焰離子化檢測器(FID)，載氣為N2 (純度為99. 99%)，流速為I. 5ml/min，汽化溫度為250° C，柱溫為230° C，檢測溫度為270° C，分流比為40:1，H2流量為30ml/min，空氣流量為400ml/min，尾吹流量為25ml/min，進樣量為Iul。實施例I :斜面培養(yǎng)基葡萄糖15g/L,蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,玉米衆(zhòng)10ml/L,MgSO4 · 7H20 O. lg/L, NaCl 3g/L，鳥苷 0. 03g/L,瓊脂 15g/L，其余為水，ρΗ7· O ；種子培養(yǎng)基葡萄糖15g/L,蛋白胨10g/L,酵母膏10g/L,玉米衆(zhòng)10ml/L,MgSO4 · 7H20 0. lg/L, NaCl 4g/L，鳥苷 0. 03g/L，其余為水，ρΗ7· O ；發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80g/L，酵母膏 15g/L，(NH4) 2S04 16g/L，尿素 3g/L，KH2P044g/L, KCl 4g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, MnSO4 · H2O 0. 01g/L，豆餅水解物 20ml/L, CaCO3 30g/L,其余為水，ρΗ7· O ；將菌株Α409從斜面轉(zhuǎn)接一環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，于32°C下200rpm往復式搖床培養(yǎng)20小時。轉(zhuǎn)接3mL于裝有30mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，于33°C下250rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)66小時。腺苷產(chǎn)量達到20g/L，乙偶姻的產(chǎn)量達到13g/L。實施例2 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖100g/L，酵母膏 15g/L，(NH4) 2S04 16g/L，尿素 3g/L，KH2P044g/L, KCl 4g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, MnSO4 · H2O 0. 01g/L，豆餅水解物 20ml/L, CaCO3 30g/L,其余為水，ρΗ7· 0 ；將菌株Α409從斜面轉(zhuǎn)接一環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(同實施例I)的500mL 搖瓶中，于32°C下200rpm往復式搖床培養(yǎng)20小時。轉(zhuǎn)接2mL于裝有20mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，于33°C下250rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)66小時。腺苷產(chǎn)量達到21. 6g/L，乙偶姻產(chǎn)量達到13. 6g/L。實施例3:以枯草芽孢桿菌A409在5L發(fā)酵罐中合成腺苷,配制種子培養(yǎng)基，配方與培養(yǎng)方法同實施例I，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，配方與培養(yǎng)方法同實施例2,將種子液按發(fā)酵液體積的10%(v/v)的接種量接入冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)液中，發(fā)酵培養(yǎng)基體積為3L，通氣量控制為2vvm，攪拌轉(zhuǎn)速500rmp，用濃度為20%的氨水調(diào)pH 6. 5，35°C發(fā)酵66h，最后得到的發(fā)酵液中腺苷的含量為23g/L，乙偶姻含量為15g/L ；對比例I :與實施例3的方法相同，所不同的是利用的培養(yǎng)基添為加了 2g/L檸檬酸鈉的培養(yǎng)基，腺苷與乙偶姻的產(chǎn)量分別提高了 9. 1%和8%。實施例4 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖100g/L，酵母膏 15g/L，(NH4) 2S04 16g/L，尿素 3g/L，KH2P044g/L，KCl 4g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，MnSO4 · H2O 0. 01g/L，豆餅水解物 20ml/L，檸檬酸鈉 2g/L，CaCO3 30g/L，其余為水，ρΗ7· 0 ；配制種子培養(yǎng)基，配方與培養(yǎng)方法同實施例1，將種子液按發(fā)酵液體積的10%(ν/ν)的接種量接入冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)液中，發(fā)酵培養(yǎng)基體積為3L，通氣量控制為2vvm，攪拌轉(zhuǎn)速500rmp，用濃度為20%的氨水調(diào)pH 6. 5，，35°C發(fā)酵66h，最后得到的發(fā)酵液中腺苷的含量為25. lg/L,乙偶姻含量為16. 2g/L ；實施例5 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖60g/L，酵母膏 15g/L，(NH4) 2S04 16g/L，尿素 3g/L，KH2P044g/L，KCl 4g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，MnSO4 · H2O 0. 01g/L，豆餅水解物 20ml/L，檸檬酸鈉 5g/L，CaCO3 30g/L，其余為水，ρΗ7· 0 ；配制種子培養(yǎng)基，配方與培養(yǎng)方法同實施例1，將種子液按發(fā)酵液體積的10%(ν/ν)的接種量接入冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)液中，發(fā)酵培養(yǎng)基體積為3L，通氣量控制為2vvm，攪拌轉(zhuǎn)速500rmp，用濃度為20%的氨水調(diào)pH 6. 5，在線監(jiān)測發(fā)酵液中的葡萄糖殘留量，當葡萄糖的含量下降為5g/L時，流加葡萄糖150g至發(fā)酵液中，35°C發(fā)酵66h，最后得到的發(fā)酵液中腺苷的含量為26. 2g/L，乙偶姻含量為16. 8g/L。
權(quán)利要求
1.枯草芽孢菌在高產(chǎn)腺苷且聯(lián)產(chǎn)乙偶姻中的應用，所述的枯草芽孢菌(Bacillussubtil is)為 CGMCC No. 4484。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應用，其特征在于，將CGMCCNo. 4484接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，再將種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)腺苷及乙偶姻。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)基包含如下組分葡萄糖10-30g/L，蛋白胨 5-15g/L，玉米漿 10-20ml/L，酵母膏 10_20g/L，MgSO4 ·7Η200. l_lg/L，NaCl3-5g/L，鳥苷 O. 01-0. 05g/L，其余為水，pH 6. 0-7. O。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，種子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-40°C，培養(yǎng)時間為12-24小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下組分葡萄糖60-120g/L，酵母膏 10-20g/L，(NH4)2SO4 10_20g/L，尿素 2_6g/L，KH2PO4 2_6g/L，KCl 2_6g/L, MgSO4 · 7H20 0. 1-lg/L, MnSO4 · H2O 0. 01-0. 05g/L，豆餅水解物 5_30ml/L，CaCO3 10_40g/L，其余為水，pH 6. 0-7.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用,其特征在于,發(fā)酵培養(yǎng)基中添加朽1檬酸鈉,朽1檬酸鈉的添加濃度為l_5g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-40°C，培養(yǎng)時間為48-72小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述的發(fā)酵生產(chǎn)條件為接種量5 20%(v/V)。
全文摘要
本發(fā)明公開了枯草芽孢菌在高產(chǎn)腺苷且聯(lián)產(chǎn)乙偶姻中的應用，所述的枯草芽孢菌(Bacillus subtilis)為CGMCC No.4484。本發(fā)明篩選到的菌株能利用多種碳源和氮源發(fā)酵生產(chǎn)腺苷且聯(lián)產(chǎn)乙偶姻，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加檸檬酸鈉能顯著提高腺苷及乙偶姻的產(chǎn)量，操作方便簡單，培養(yǎng)條件粗放，在5L發(fā)酵罐上能維持較高的水平，具有大規(guī)模工業(yè)化的潛力。
文檔編號C12P7/26GK102876760SQ201210404399
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日
發(fā)明者應漢杰, 柏建新, 張春偉, 陳曉春, 陳勇, 謝婧婧, 吳菁嵐 申請人:南京工業(yè)大學, 南京同凱兆業(yè)生物技術(shù)有限責任公司