專利名稱：一種章魚(yú)腸道產(chǎn)蛋白霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種章魚(yú)腸道產(chǎn)蛋白霉菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
章魚(yú)屬軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)JUig(Octopoda)、章魚(yú)科(octopodidae)，學(xué)名“蛸”，俗稱“八爪魚(yú)”、“八帶魚(yú)”。其體短，卵圓形，無(wú)鰭，頭上生八腕，腕間有膜相連，腕長(zhǎng)短相等或不相等，腕上吸盤(pán)無(wú)柄。廣泛分布世界各海域，從寒帶至熱帶海域均有分布，全球大約有140種，大部分為淺海性種類，也有少數(shù)深海性種類。章魚(yú)廣泛分布于我國(guó)南北沿岸海域，主要有8種，分別為短蛸、卵蛸、雙點(diǎn)蛸、真蛸、環(huán)蛸、長(zhǎng)蛸、紡錘蛸、嘉庚蛸。最常見(jiàn)為短蛸、長(zhǎng)蛸和真蛸[12]。本實(shí)驗(yàn)所選用的章魚(yú)為長(zhǎng)蛸。長(zhǎng)蛾(Octopus variabilis)俗稱長(zhǎng)腿蛾、馬蛾、石拒、長(zhǎng)爪章,屬軟體動(dòng)物頭足綱、章魚(yú)科、蛸屬[13]。在我國(guó)南北各海區(qū)均有廣泛分布，其中北部海區(qū)略多。長(zhǎng)蛸個(gè)體大、肉質(zhì)肥厚鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)和氨基酸，可食用部分占總體的90%以上。肉除鮮食外，還可以加工成干制品，食用方式多種多樣。長(zhǎng)蛸具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[14]。春季長(zhǎng)蛸多在低潮線以上活動(dòng)，夏秋兩季多在潮間帶中區(qū)，冬季則在潮下帶深潛，具有短距離的生殖和越冬洄游習(xí)性。其多利用腕足在海底爬行，也能憑借漏斗噴水的反作用短暫游行于底層海水中。長(zhǎng)蛸可用其腕足挖洞棲居。天然海區(qū)長(zhǎng)蛸多將卵產(chǎn)在自挖的洞中孵化，少數(shù)產(chǎn)在礁石縫隙及海螺殼中。長(zhǎng)蛸食性較兇猛，以蟹類、貝類、蝦類等貝殼類生物為主食，腸道中存在的微生物菌群能夠分泌各種酶類，幫助章魚(yú)消化食物，將食物中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為自身的蛋白質(zhì)。

章魚(yú)最主要的消費(fèi)國(guó)家和地區(qū)為日本、韓國(guó)，其次是阿根廷、中國(guó)和中國(guó)臺(tái)灣省、摩洛哥等。近些年，我國(guó)對(duì)章魚(yú)的消費(fèi)量有了大幅度的提高，隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和中國(guó)人喜愛(ài)海產(chǎn)的飲食習(xí)慣，使中國(guó)對(duì)章魚(yú)的消費(fèi)大有超過(guò)日韓的勢(shì)頭；同時(shí)，由于廉價(jià)而高素質(zhì)的勞動(dòng)力，使中國(guó)成為世界的章魚(yú)加工廠，原本在摩洛哥、日本的章魚(yú)加工廠，逐漸向中國(guó)轉(zhuǎn)移，我國(guó)從事章魚(yú)加工的工廠數(shù)量有了大幅提高。隨著章魚(yú)加工廠規(guī)模和數(shù)量的增力口,加工過(guò)程中產(chǎn)生的下腳料(主要是章魚(yú)的內(nèi)臟)約占個(gè)體總重的50% [15]，年產(chǎn)量巨大，僅山東一家水產(chǎn)品公司章魚(yú)內(nèi)臟的年產(chǎn)量達(dá)近千噸。而這些內(nèi)臟常占用企業(yè)大量的庫(kù)存，最后作為廢棄物丟棄于海中，這不僅造成了海洋環(huán)境的污染，而且增加了企業(yè)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，這些下腳料中含有豐富的蛋白資源，如果能夠?qū)⑦@些下腳料通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄞD(zhuǎn)化成高附加值的產(chǎn)品，不僅解決了環(huán)境污染問(wèn)題，同時(shí)能夠?yàn)槠髽I(yè)創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益。以往人們用市售蛋白酶對(duì)下腳料進(jìn)行水解以獲得高附加值的產(chǎn)品，成本過(guò)高，本研究從章魚(yú)自身腸道中分離篩選出高產(chǎn)蛋白酶的菌株，對(duì)其進(jìn)行鑒定，并將菌株應(yīng)用于發(fā)酵章魚(yú)下腳料，獲得具有抗氧化活性的多肽，既降低了成本，又可獲得高附加值產(chǎn)品，更具有工業(yè)化應(yīng)用的價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種章魚(yú)腸道內(nèi)的產(chǎn)蛋白酶菌株。本發(fā)明的另一目的在于公開(kāi)了該菌株在生產(chǎn)用于發(fā)酵章魚(yú)下腳料的蛋白酶方面的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種章魚(yú)腸道產(chǎn)蛋白酶菌株，其中，所述菌株為Bacillus sp. QDV-3, CGMCCNo. 6561,其16S rRNA序列如序列表I所示,所述Bacillus sp. QDV-3菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀，兩端鈍圓，有芽孢；菌落為乳白色、圓形、凸起、邊緣整齊濕潤(rùn)的光滑型小菌落。Bacillus sp. QDV-3菌株在生產(chǎn)用于發(fā)酵章魚(yú)下腳料的蛋白酶方面的應(yīng)用，Bacillus sp. QDV-3菌株的液體發(fā)酵條件為液體培養(yǎng)基中各物質(zhì)的質(zhì)量濃度為果糖
O.5 %，蛋白胨O. 5 %，酵母膏O.1 %，磷酸高鐵O. 01 %培養(yǎng)基初始pH8. O,培養(yǎng)溫度30°C的條件下振蕩培養(yǎng)3. 5天。上述技術(shù)方案所述的Bacillus sp. QDV-3菌株在生產(chǎn)用于發(fā)酵章魚(yú)下腳料的蛋白酶方面的應(yīng)用，其中，培養(yǎng)基中還加入金屬離子Mn2+或Ba2+。本發(fā)明具有以下有益效果1、本發(fā)明從章魚(yú)腸道內(nèi)篩選了一種產(chǎn)蛋白酶菌株Bacillus sp. QDV-3，有效地發(fā)酵章魚(yú)下腳料，避免了海洋環(huán)境的污染，減輕了企業(yè)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。


圖1為各發(fā)酵液的蛋白酶活力圖；圖2為菌株Bacillus sp. QDV-3經(jīng)革蘭氏染色后圖；圖3為不同碳源對(duì)Bacillus sp. QDV-3菌株產(chǎn)蛋白酶的影響；

圖4為不同氮源對(duì)Bacillus sp. QDV-3菌株產(chǎn)蛋白酶的影響；圖5為培養(yǎng)基起始pH值對(duì)Bacillus sp. QDV-3菌株產(chǎn)蛋白酶的影響；圖6為培養(yǎng)溫度對(duì)Bacillus sp. QDV-3菌株產(chǎn)蛋白酶活力的影響；圖7為培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Bacillus sp. QDV-3菌株產(chǎn)蛋白酶活力的影響。菌株保藏信息本發(fā)明Bacillus sp. QDV-3，分類命名為彎曲芽孢桿菌Bacillusflexus，已經(jīng)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行保藏，保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 6561，保藏日期為2012年9月11日。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗(yàn)例對(duì)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1 jBacillus sp. QDV-3 菌株的制備一、材料與培養(yǎng)基1、材料章魚(yú)2、培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基2216E培養(yǎng)基和VNSS培養(yǎng)基，兩個(gè)培養(yǎng)基的制備方法見(jiàn)ChristerO.1ntestinal Colonization Potential of Turbot(Scophthalmus maximus)-andDab(Limanda Iimanda)-Associated Bacteria with Inhibitory Effects against VibrioanguiIlarum[J]. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,1992 (58) :551-556.；酪蛋白培養(yǎng)基酪蛋白1%，酵母膏0. 1%，瓊脂1.5%，pH7. 2，海水配制，以上為質(zhì)量濃度，即酪蛋白為lg/100mL ；液體發(fā)酵培養(yǎng)基果糖0. 5 %，蛋白胨0. 5 %，酵母膏0.1%，磷酸高鐵0.01%，培養(yǎng)基起始PH8. 0，該培養(yǎng)基用海水配制，以上為質(zhì)量濃度，即果糖為0. 5g/100mL ；固體培養(yǎng)基稱取3. 3g LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基溶解于100ml海水中。二、章魚(yú)腸道產(chǎn)蛋白酶菌的篩選選用酪蛋白培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基的主要原理是該菌種在酪蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，利用自己產(chǎn)的蛋白酶來(lái)水解培養(yǎng)基中的酪蛋白，產(chǎn)生透明圈。因此，以酪蛋白水解透明圈的大小來(lái)進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選。1、初篩將活章魚(yú)解剖，取其腸道，用無(wú)菌海水沖洗數(shù)次，去掉腸道雜物，將腸道剪碎，加入無(wú)菌海水研磨，得到菌液原液，將原液稀釋成10—1，10_2濃度梯度，分別涂布于2216E培養(yǎng)基和VNSS培養(yǎng)基上，于25 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)基上的單菌落，稀釋劃線培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)ld，得到純的單菌落，將單菌落點(diǎn)種于酪蛋白培養(yǎng)基上，觀察各菌株產(chǎn)透明圈情況。結(jié)果酪蛋白培養(yǎng)基上水解透明圈直徑與菌落直徑的比值(D% d值)越大說(shuō)明產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。菌株的初篩結(jié)果如表1所示，共得到6株在酪蛋白培養(yǎng)基上產(chǎn)透明圈的菌株，其中VNSS培養(yǎng)基篩選出來(lái)的有2株，分別為命名QDV-1和QDV-3。2216E培養(yǎng)基篩選出來(lái)的菌株為4株，分別為QDE-1，QDE-2，QDE-5，QDE-7。其中QDV-3和QDE-5菌株所產(chǎn)透明圈直徑和菌落直徑比值較大。表I章魚(yú)腸道產(chǎn)蛋白酶菌株初篩結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種章魚(yú)腸道產(chǎn)蛋白酶菌株，其特征在于所述菌株為Bacillus sp. QDV-3，CGMCCNo. 6561,其16S rRNA序列如序列表I所示,所述Bacillus sp. QDV-3菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀，兩端鈍圓，有芽孢；菌落為乳白色、圓形、凸起、邊緣整齊濕潤(rùn)的光滑型小菌落。
2.Bacillus sp. QDV-3菌株在生產(chǎn)用于發(fā)酵章魚(yú)下腳料的蛋白酶方面的應(yīng)用，Bacillus sp. QDV-3菌株的發(fā)酵條件為液體培養(yǎng)基中各物質(zhì)的質(zhì)量濃度為果糖O. 5%，蛋白胨O. 5%，酵母膏O.1 %，磷酸高鐵O. Ol % ;培養(yǎng)基初始pH8. O,培養(yǎng)溫度30°C的條件下振蕩培養(yǎng)3. 5天。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Bacillussp. QDV-3菌株在生產(chǎn)用于發(fā)酵章魚(yú)下腳料的蛋白酶方面的應(yīng)用，其特征在于培養(yǎng)基中還加入金屬離子Mn2+或Ba2+。
全文摘要
本發(fā)明一種章魚(yú)腸道產(chǎn)蛋白酶菌株及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。該章魚(yú)腸道產(chǎn)蛋白酶菌株Bacillus sp.QDV-3，CGMCC No.6561，為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀，兩端鈍圓，有芽孢，菌落為乳白色、圓形、凸起、邊緣整齊濕潤(rùn)的光滑型小菌落。該菌株用于章魚(yú)下腳料發(fā)酵中產(chǎn)蛋白酶方面的應(yīng)用，其液體發(fā)酵條件為液體培養(yǎng)基中各物質(zhì)的質(zhì)量濃度為果糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，磷酸高鐵0.01％；培養(yǎng)基初始pH8.0，培養(yǎng)溫度30℃的條件下振蕩培養(yǎng)3.5天。本發(fā)明篩選得到的Bacillus sp.QDV-3菌株具有有效地發(fā)酵章魚(yú)下腳料，避免了海洋環(huán)境的污染，減輕了企業(yè)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/54GK103060226SQ20121040246
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日
發(fā)明者樸美子, 王鳳舞, 金玉蘭 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)