專利名稱：一種三疣梭子蟹內(nèi)生芽枝霉菌Pt-2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三疣梭子蟹內(nèi)生芽枝霉菌Pt-2。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease,AD)是一種常見的老年性腦神經(jīng)退行性病變，發(fā)病率較高，已成為現(xiàn)代社會(huì)嚴(yán)重威脅老年人生命的疾病之一。其死亡率僅次于心血管病、癌癥及中風(fēng)而位居第四。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是一種多病因的疾病，典型的病理變化包括β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Αβ )沉積形成老年斑(senile plaque, SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)、基底前腦膽堿能功能障礙和皮層、海馬廣泛的神經(jīng)元丟失及突觸形態(tài)的改變。近年來，根據(jù)AD的病因、病理及分子生物學(xué)研究進(jìn)展，許多學(xué)者從不同角度提出了多種病因假說和相應(yīng)的治療策略，主要有膽堿能學(xué)說、Αβ毒性作用、炎性病變、自由基氧化損傷、腦能量代謝障礙、基因缺陷與突變等。目前臨床治療AD主要采 用基于膽堿能假說即以乙酰膽堿酯酶(acetylcho-1 inesterase, AchE)為祀點(diǎn)的乙酸膽喊酯酶抑制劑(acetylcholinesteraseinhibitors, AChEIs),包括他克林(tetra-hydroaminoacridine, THA)、多奈哌齊、利凡斯的明和加蘭他敏等藥物。這些藥物價(jià)格昂貴，具有一定的副作用，且化學(xué)合成新的藥物難度大，因而如何從天然藥物中開發(fā)AChEIs成為研究的重點(diǎn)。目前主要集中于中草藥及植物內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物的研究，如劉平等研究了銀杏提取物(EGB)對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)元凋亡的影響；史大華等以24味中藥為研究對(duì)象，檢測(cè)水提物對(duì)兔大腦乙酰膽堿酯酶的抑制活性；汪涯等從蛇足石杉中分離到11株具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的內(nèi)生真菌。海洋來源的內(nèi)生真菌抗老年癡呆的報(bào)道相對(duì)較少,而來自三疣梭子蟹的內(nèi)生真菌更是未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明以三疣梭子蟹內(nèi)生真菌一芽枝霉菌(Cladosporium sp.)Pt_2，CGMCC No. 6562為研究對(duì)象，優(yōu)化發(fā)酵條件，并采用有機(jī)溶劑萃取，色譜學(xué)的手段進(jìn)行分離，制備對(duì)AchE抑制率達(dá)70% 90%的芽枝霉的次生代謝產(chǎn)物，與陽(yáng)性對(duì)照他克林相比，具有顯著的抑制效果。本發(fā)明的目的在于公開了一種三疣梭子蟹內(nèi)生芽枝霉菌Pt-2。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種三疣梭子蟹內(nèi)生芽枝霉菌Pt-2，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6562，其18S rDNA序列如SEQ No.1所示。一種三疣梭子蟹內(nèi)生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代謝產(chǎn)物，所述次生代謝產(chǎn)物是通過下述方法制備所得(I)、以三疣梭子蟹的內(nèi)生芽枝霉菌為菌種，采用液體發(fā)酵的方法，在接種量10%、裝液量200mL/500mL三角瓶、28°C條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵9天，獲得發(fā)酵物；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為30g 葡萄糖，3g NaNO3,0. 5g KCl，0.5g MgSO4 · 7H20，O. Olg FeSO4, IgK2HPO4, Ig 酵母膏，IOOOmL 海水；(2)、將發(fā)酵液在40°C下真空濃縮至原體積的1/3，再用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取液濃縮至干；(3)、經(jīng)濃縮至干的芽枝霉菌Pt-2發(fā)酵產(chǎn)物的有機(jī)相萃取物，采用硅膠柱層析，氯仿/甲醇體系梯度洗脫，獲得6個(gè)極性段，對(duì)活性最高段采用C18反相柱和葡聚糖凝膠層析進(jìn)行分離，獲得AchE抑制率達(dá)70 90%的次生代謝產(chǎn)物。上述技術(shù)方案所述的次生代謝產(chǎn)物，其中，AchE抑制率是以他克林作為陽(yáng)性對(duì)照，通過DTNB法測(cè)定。上述技術(shù)方案所述的次生代謝產(chǎn)物，其中，AchE抑制率是通過DTNB法測(cè)定。三疣梭子蟹內(nèi)生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代謝產(chǎn)物的制備方法，包括下述步驟(I)、以三疣梭子蟹的內(nèi)生芽枝霉菌Pt-2為菌種，采用液體發(fā)酵的方法，在接種量10%、裝液量200mL/500mL三角瓶、28°C條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵9天，獲得發(fā)酵物；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為30g 葡萄糖，3g NaNO3,0. 5g KCl，0.5g MgSO4 · 7H20,0. OlgFeSO4,IgK2HPO4, Ig 酵母膏，IOOOmL 海水；(2)、將發(fā)酵液在40°C下真空濃縮至原體積的1/3，再用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取液濃縮至干；(3)、經(jīng)濃縮至干的芽枝霉菌Pt-2發(fā)酵產(chǎn)物的有機(jī)相萃取物，采用硅膠柱層析，氯仿/甲醇體系梯度洗脫，獲得6個(gè)極性段，對(duì)活性最高段采用C18反相柱和葡聚糖凝膠層析進(jìn)行分離，獲得AchE抑制率達(dá)70 90%的次生代謝產(chǎn)物。上述技術(shù)方案所述的制備方法，其中，AchE抑制率是以他克林作為陽(yáng)性對(duì)照，通過DTNB法測(cè)定。上述技術(shù)方案所述的制備方法，其中，AchE抑制率是通過DTNB法測(cè)定。本發(fā)明所采用的三撫梭子蟹內(nèi)生芽枝霉菌為芽枝霉菌(Cladosporium sp.)Pt_2,該菌種的菌學(xué)特征如下1、芽枝霉菌Pt-2菌株形態(tài)學(xué)特征如圖10所示，芽枝霉菌Pt-2菌菌落形態(tài)規(guī)則，生長(zhǎng)速度中等，培養(yǎng)兩天后菌落直徑為2. 3cm，菌落表面有短絨毛狀氣生菌絲，菌落中間隆起，顏色為墨綠色，最邊緣為一圈白色菌絲，生長(zhǎng)整齊，背面呈墨綠色至黑色。2、芽枝霉菌Pt-2菌株的孢子形態(tài)特征如圖11所示的顯微鏡下(放大400倍)的孢子形態(tài)，分生孢子梗呈深色，長(zhǎng)度不等，末端和外側(cè)可產(chǎn)生分生孢子，分生孢子桿形、橢圓形或檸檬形，壁光滑或輕微粗糙，單細(xì)胞伴有黑色痕跡，易散開。本發(fā)明具有以下有益效果1、本發(fā)明通過對(duì)三疣梭子蟹的內(nèi)生芽枝霉菌Pt-2次生代謝產(chǎn)物的分離和純化，獲得了 AchE抑制率達(dá)70 90%的組分，為預(yù)防老年癡呆病生物藥品的開發(fā)提供理論依據(jù)。2、本發(fā)明所制備的次生 代謝產(chǎn)物克服了目前常用乙酰膽堿酯酶抑制劑類藥物價(jià)格昂貴，具有一定的副作用，且化學(xué)合成新的藥物難度大的缺點(diǎn)，提供了一種新的抑制乙酰膽堿酯酶活性的藥物，并提供了一種新的制備方法。


圖1為碳源對(duì)發(fā)酵液提取物AchE抑制率的影響效果柱形圖；圖2為氮源對(duì)發(fā)酵液提取物AchE抑制率的影響效果柱形圖；圖3為接種量對(duì)發(fā)酵液提取物AchE抑制率的影響效果柱形圖；圖4為裝液量對(duì)發(fā)酵液提取物AchE抑制率的影響效果柱形圖；圖5為培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵液提取物AchE抑制率的影響效果柱形圖；圖6為發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液提取物抑制AchE活性的影響效果柱形圖；圖7為硅膠柱層析分離流程圖；圖8為各洗脫組分對(duì)AchE抑制率的影響效果柱狀圖；圖9為反相柱和葡聚糖凝膠柱分離流程圖；圖10為芽枝霉菌Pt-2菌的菌落形態(tài)；圖11為芽枝霉菌Pt-2菌在顯微鏡下放大400倍觀察到的孢子形態(tài)；圖12為芽枝霉菌Pt-2菌的18S rDNA片段凝膠電泳圖；圖13為芽枝霉 菌Pt-2菌的進(jìn)化樹。菌株保藏信息本發(fā)明芽枝霉菌Pt-2 (Cladosporium sp. Pt_2)，分類命名為芽枝霉Cladosporium sp.,已經(jīng)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行保藏，保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6562，保藏日期為2012年9月11日。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗(yàn)例對(duì)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1 :芽枝霍菌Pt-2 (Cladosporium sp. Pt-2)的篩選獲得一、菌株的分離1.1、培養(yǎng)基分離用培養(yǎng)基馬鈴薯瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，加入終濃度為200U/mL的青霉素鉀和150U/ml硫酸鏈霉素。液體發(fā)酵培養(yǎng)基(改良查氏培養(yǎng)基)30g蔗糖，3g NaNO3,0. 5g KCL，0. 5gMgSO4 ·7Η20，0. Olg FeSO4, Ig K2HPO4依次加入IOOOmL海水中攪勻溶解，再加Ig酵母膏略加熱溶解，121°C滅菌20min備用。1. 2、菌株分離方法將蟹去殼，取其腮和腸胃部位，先用75%酒精浸泡5min進(jìn)行表面消毒，然后剪碎加3mL無菌水研磨,涂布于分離培養(yǎng)基上,將平板放置于恒溫培養(yǎng)箱中，28°C倒置培養(yǎng)。待平板長(zhǎng)出菌絲時(shí)，采用菌絲尖端切割法對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化，將純化好的真菌轉(zhuǎn)于斜面，于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. 3、發(fā)酵培養(yǎng)將分離得到的內(nèi)生真菌接種到裝有200mL查氏培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天。培養(yǎng)條件為28°C，120rpm。
發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液進(jìn)行過濾，上清液用乙酸乙酯萃取，所得萃取相采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)、濃縮得提取物。提取物采用DTNB法測(cè)定其抑制乙酰膽堿酯酶的活性.二、菌株的鑒定1、方法1.1、菌株形態(tài)鑒定將保藏的菌種于PDA平板中培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征及產(chǎn)孢情況。菌落特征主要包括菌落的形狀、大小、顏色、隆起、表面狀況、質(zhì)地、光澤等。在顯微鏡下觀察細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及孢子的形狀、著生位置、數(shù)量及排列等。1. 2、芽枝霉菌Pt-2菌株18S rDNA擴(kuò)增及其序列分析(I)、基因組提取及電泳檢測(cè)①、基因組提取按照生工SK1375真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取。②、PCR反應(yīng)PCR 體系建立(50ul)
Template (基因組)I Opmol Primerup (IOuM)Iul
Primer down C10 uM)I ul
dNTPmix (IOMm each) Iul10*Taq reaction Buffer 5ulTaq (5u/ul)0.25 ul
加水至50ulPCR程序設(shè)定預(yù)變性98°C 5min ;循環(huán) 95°C 35S, 55°C 35S, 72°C 40s, 35 個(gè)循環(huán)；延伸 8min。引物序列NSl 5’ GTAGTCATATGCTTGTCTC 3’NS6 5， GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC3’(2)、PCR 產(chǎn)物電泳(3)、DNA瓊脂糖切膠純化由PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果切割所需DNA目的條帶。(4)、目的片斷TA克隆包括連接反應(yīng)、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選，具體步驟參考黃玖利，海南粗榧內(nèi)生真菌S15化學(xué)成分研究[38]。(5)、質(zhì)粒提取后DNA測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。(6)、系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及分析從NCBI的基因庫(kù)中尋找與Pt-2的18S rDNA相關(guān)的序列，將相關(guān)性最高的菌株同Pt-2菌株一同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行同源性比較，進(jìn)而確定菌株的分類。2、芽枝霉菌Pt-2菌株鑒定結(jié)果
2.1、芽枝霉菌Pt-2菌株形態(tài)學(xué)特征如圖10所示的，芽枝霉菌Pt-2菌菌落形態(tài)規(guī)則，生長(zhǎng)速度中等，培養(yǎng)兩天后菌落直徑為2. 3cm，菌落表面有短絨毛狀氣生菌絲，菌落中間隆起，顏色為墨綠色，最邊緣為一圈白色菌絲生長(zhǎng)整齊，背面呈墨綠色至黑色。圖11為顯微鏡下(放大400倍)觀察到的孢子形態(tài)，分生孢子梗呈深色，長(zhǎng)度不等，末端和外側(cè)可產(chǎn)生分生孢子，分生孢子桿形、橢圓形或檸檬形，壁光滑或輕微粗糙，單細(xì)胞伴有黑色痕跡，易散開。2. 2、PCR產(chǎn)物電泳圖譜由圖12可以看出，芽枝霉菌Pt-2菌株18S rDNA片段長(zhǎng)度為1200bp_1500bp之間。2. 3、PCR 測(cè)序結(jié)果芽枝霉菌Pt-2菌株的18S rDNA序列如SEQ No.1所示，菌株的18S rDNA序列長(zhǎng)1418bp，與電泳結(jié)果一致。利用Blast軟件將此序列和美國(guó)生物信息中心(NCBI)進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明與Cladosporium bruhnei strain CPC `5101相似性最高2. 4、進(jìn)化樹的構(gòu)建及分析應(yīng)用MEGA5. 05軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果表明芽枝霉菌Pt_2Pt_2與芽枝霉屬Cladosporium sp. 18S rDNA的相似度在99%以上,結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的結(jié)果,最終確定該菌為芽枝霉屬，命名為Cladosporium sp. Pt_2。2. 5、發(fā)酵液的乙酸乙酯相的抑制乙酰膽堿酯酶活性從螃蟹中分離出的芽枝霉菌Pt-2具有很好的抑制AchE活性，50mg/ml的濃度下，乙酰膽堿酯酶的抑制率達(dá)到60% -80%。實(shí)施例2、三疣梭子蟹內(nèi)牛芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代謝產(chǎn)物的制備三疣梭子蟹內(nèi)生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代謝產(chǎn)物的制備過程為(I)、以三疣梭子蟹的內(nèi)生芽枝霉菌Pt-2為菌種，采用液體發(fā)酵的方法，在接種量10%、裝液量200mL/500mL三角瓶、28°C條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵9天，獲得發(fā)酵物；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為30g 葡萄糖，3g NaNO3,0. 5g KCl，0.5g MgSO4 · 7H20,0. OlgFeSO4,IgK2HPO4, Ig 酵母膏，IOOOmL 海水；(2)、將發(fā)酵液在40°C下真空濃縮至原體積的1/3，再用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取液濃縮至干；(3)、經(jīng)濃縮至干的芽枝霉菌Pt-2發(fā)酵產(chǎn)物的有機(jī)相萃取物，采用硅膠柱層析，氯仿/甲醇體系梯度洗脫，獲得6個(gè)極性段，對(duì)活性最高段采用C18反相柱和葡聚糖凝膠層析進(jìn)行分離，獲得AchE抑制率達(dá)70 90%的次生代謝產(chǎn)物。本實(shí)施例的參數(shù)通過以下方法得到一、本發(fā)明中AchE抑制率的測(cè)定方法采用DTNB法測(cè)定發(fā)酵液對(duì)AchE的抑制率，下述各步驟中抑制率的測(cè)定均采用此方法，具體步驟為將提取物用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配制成濃度為50mg/mL的溶液。取4支IOmL的試管，試管I 4分別對(duì)應(yīng)于空白組、對(duì)照組、樣品組和本底組，將4支試管放于37°C的恒溫水浴中；先向每支試管中添加乙酰膽堿碘代物20 μ L、顯色劑DTNB100 μ L和pH = 8. O磷酸緩沖液，其中試管I 4對(duì)應(yīng)的pH = 8. O磷酸緩沖液體積為2950 μ L、2880 μ L、2880 μ L和2950 μ L ;然后向1、2號(hào)試管中各加入DMSOlOOy L，3、4號(hào)試管中各加入待測(cè)樣品溶液100 μ L，2、3號(hào)試管中再各加入70 μ L的乙酸膽喊酷酶后混勾；在水浴中反應(yīng)4min 20s后再向各試管中分別添加40%的SDS終止劑100 μ L終止反應(yīng)；最后在412nm下測(cè)其OD值，通過計(jì)算公式(一)計(jì)算出樣品對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率，公式權(quán)利要求
1.一種三疣梭子蟹內(nèi)生芽枝霉菌Pt-2，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6562，其18S rDNA序列如SEQ No.1所示。
全文摘要
本發(fā)明一種三疣梭子蟹內(nèi)生芽枝霉菌Pt-2，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該芽枝霉菌Pt-2CGMCC No.6562可以通過下述方法制備抑制AchE的次生代謝產(chǎn)物(1)、以三疣梭子蟹的內(nèi)生芽枝霉菌Pt-2為菌種，進(jìn)行液體發(fā)酵；(2)、將發(fā)酵液在40℃下真空濃縮至原體積的1/3，再用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取液濃縮至干；(3)、經(jīng)濃縮至干的芽枝霉菌Pt-2發(fā)酵產(chǎn)物的有機(jī)相萃取物，采用硅膠柱層析，氯仿/甲醇體系梯度洗脫，獲得6個(gè)極性段，對(duì)活性最高段采用C 18反相柱和葡聚糖凝膠層析進(jìn)行分離，獲得AchE抑制率達(dá)70～90％的次生代謝產(chǎn)物。本發(fā)明具有克服了目前藥物價(jià)格昂貴，有副作用，且化學(xué)合成難度大的缺點(diǎn)，提供了一種新的藥物及制備方法，為預(yù)防老年癡呆病生物藥品的開發(fā)提供理論依據(jù)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/645GK103060200SQ20121040240
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日
發(fā)明者王鳳舞, 樸美子 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)