專利名稱：一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法，具體涉及以交聯(lián)劑三羥甲基磷(THP)通過共價鍵將凝血酶固定在活化的桑蠶絲素上制成固定化凝血酶，屬于中藥制備技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
凝血酶即凝血因子，臨床上凝血酶主要用于各種原因引起的出血的快速止血。雖然凝血酶具有良好的促凝血性能，但由于其本質(zhì)是蛋白質(zhì)，因此易變性失活，穩(wěn)定性較差，從而使凝血酶的應用受到了極大地限制，需要進行固定化研究。凝血酶也能直接與血液中的纖維蛋白原結(jié)合將其水解生成纖維蛋白，使血液凝固，此乃導致人體內(nèi)血栓形成、誘發(fā)心腦血管疾病發(fā)生的重要病理基礎。凝血酶的分子表面 有一個富含堿性氨基酸的纖維蛋白原識別結(jié)合位點，水蛭素是到目前為止發(fā)現(xiàn)的最有效的凝血酶抑制劑，其肽鏈C端含有較多的酸性氨基酸，在一定條件下可以結(jié)合在纖維蛋白原識別結(jié)合位點上，阻止凝血酶、纖維蛋白原二者結(jié)合，有效的抗血液凝固。水蛭素對多種血栓疾病如靜脈血栓、彌散性血管內(nèi)凝血、腦凝血、血栓靜脈炎、及冠狀動脈血栓都有預防和治療效果，特別是對外科手術(shù)后及深栓治療后的再栓塞有重要的預防和治療效果。要將水蛭素開發(fā)成抗凝、溶栓藥物，首先要研究開發(fā)制備高純度的水蛭素制備工藝。目前，水蛭素制備常用水或有機溶劑處理水蛭消化液或水蛭勻漿，得到水蛭素粗提液后，再使用離子交換、凝膠層析結(jié)合等電聚焦，離子交換結(jié)合親和色譜，DEAE-纖維素層析結(jié)合反相液相色譜等方法純化。這些方法雖然可以獲得高純度的產(chǎn)品，但需要使用昂貴的設備，且產(chǎn)量低，無法推廣。《兩種反膠束體系的水蛭素萃取效果比較》文中方富永等采用反膠束萃取、雙水相萃取等方法制備水蛭素，雖然工藝簡單，但產(chǎn)品純度相對較低。根據(jù)水蛭素能與凝血酶專一結(jié)合的特異性，可以固定化凝血酶萃取水蛭素粗提液，其原理是在一定PH值條件下，纖維蛋白原識別結(jié)合位點的堿性氨基酸帶正電、水蛭素肽鏈C端的酸性氨基酸帶負電,通過靜電引力產(chǎn)生離子鍵,形成凝血酶-水蛭素復合物；分離該復合物并調(diào)整pH值，破壞離子鍵使凝血酶-水蛭素復合物分開?！赌傅墓潭ɑ捌浞€(wěn)定性研究》文中李平等使用戊二醛為交聯(lián)劑進行過凝血酶的殼聚糖固定化研究；《海藻酸鈉-殼聚糖固定化凝血酶微球的制備及穩(wěn)定性研究》中郎軼詠以海藻酸鈉-殼聚糖微球為載體，以物理吸附法對凝血酶進行固定化研究。利用活化絲素為載體，以自制的交聯(lián)劑THP通過共價鍵將凝血酶固定在活化的桑蠶絲素(以下簡稱活化絲素)上制成固定化凝血酶的方法還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法，提供一種工藝簡單易行、生產(chǎn)周期較短、固定化效果好制備方法；用該固定化凝血酶萃取水蛭素粗提液，離心回收固定化凝血酶可獲得高純度水蛭素。
為實現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法，包括以下幾個步驟
(I)THP的制備利用阻燃劑四羥甲基氯化磷(THPC)與氫氧化鉀(KOH)反應得到，具體是取等摩爾量的THPC與KOH分別溶于90 mL和10 mL水中，劇烈攪拌下將KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完畢反應結(jié)束，得THP。(2)絲素脫膠將已除雜的桑蠶繭隨機切碎，按桑蠶繭質(zhì)量I g加50 mL的比例加入質(zhì)量分數(shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液，于100 °〇溫度下以300 r · mirT1攪拌25 35min，取出，按碳酸鈉溶液3倍的量加入蒸餾水洗滌3次，每次25 35 min。重復質(zhì)量分數(shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液處理和蒸餾水洗滌步驟各I次，于45飛5°C真空干燥25 35 min得脫膠絲素。(3)脫膠絲素的活化使用THP處理使脫膠絲素通過其-NH2與與THP的-CH2OH脫水后結(jié)合。按每I g脫膠絲素用100 mL THP溶液的比例加入后，以300 r· mirT1攪拌,于25 35 °C交聯(lián)35 45 min。交聯(lián)結(jié)束后用O. I mo I · L-1 pH值為7. 5 8. O的磷酸鹽緩沖液·洗l(Tl5min，去除多余的THP，于50°C真空干燥得活化絲素，備用。(4)凝血酶的固定向100 mL濃度為15抗凝血酶活力單位(ATU) · mL—1的凝血酶溶液加入O. Γ0. 3g活化絲素，于25 °〇以300 r · mirT1攪拌，固定3. 5 4. 5 h后，用O. Imo I · Γ1 pH值為7. 5^8. O磷酸緩沖液洗至洗脫液于280 nm波長處無光吸收，吸干，用生理鹽水浸泡，待測定活力回收率。(5)固定化凝血酶活力回收率的測定是用凝血酶滴定改進法測定溶液中的水蛭素濃度。因凝血酶與水蛭素按等摩爾結(jié)合，所以凝血酶的濃度可以用水蛭素的濃度(ATU · mL-1)表示。測定固定化凝血酶活力回收率時，將一定質(zhì)量的固定化凝血酶放入一定體積、濃度已知的水蛭素溶液中于37 °C下作用I min后，分離固定化凝血酶，測定溶液中殘留的水蛭素濃度，用下述公式計算與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素數(shù)量(指ATU數(shù)量，后同)
與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素數(shù)量=固定化作用前溶液中水蛭素數(shù)量一固定化作用后溶液中水蛭素數(shù)量
固定化凝血酶活力回收率=與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素數(shù)量+固定化前溶液中的游離凝血酶數(shù)量(用ATU數(shù)量表示,后同)X 100%
與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的突出實質(zhì)性特點和顯著的進步是
(I)工藝簡單易行、生產(chǎn)周期較短、固定化效果好。(2)用該固定化凝血酶萃取水蛭素粗提液，離心回收固定化凝血酶獲得水蛭素產(chǎn)品純度明顯提高。據(jù)資料介紹，用反膠束萃取和雙水相萃取等方法制備的水蛭素純度(比活力)分別為2389. 54、2459. 98 ATU · mg—1和3210. 27 ATU · mg—1，而用本發(fā)明制備的4批水蛭素樣品純度分別為 4163. 71,4165. 09,4160. 60,4162. 45 ATU · mg-1，平均 4162. 96ATU · mg—1，純度較前兩方法有顯著提高。(3)通常所用的固定化酶交聯(lián)劑為戊二醛，具有一定毒性，長期接觸會損害操作者的健康，本發(fā)明使用的試劑及產(chǎn)物均為無毒，符合環(huán)保要求。
具體實施例方式下面通過實例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實施例I
I、取等摩爾量的THPC與KOH分別溶于90 mL和10 mL水中，劇烈攪拌下將KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完畢反應結(jié)束，得THP。2、將已除雜的桑蠶繭隨機切碎，按桑蠶繭質(zhì)量I g加50 mL的比例加入質(zhì)量分數(shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液，于100 1溫度下以300 r · min—1攪拌25 min，取出，按碳酸鈉溶液3倍的量加入蒸餾水洗滌3次，每次25 min。重復質(zhì)量分數(shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液處理和蒸餾水洗滌步驟各I次，于45°C真空干燥35 min得脫膠絲素。3、使用交聯(lián)劑THP處理使脫膠絲素通過其-NH2與THP的-CH2OH脫水后結(jié)合。按每I g脫膠絲素用100 mL THP溶液的比例加入后，以300 r · min—1攪拌，于25 °C交聯(lián)45min。交聯(lián)結(jié)束后用O. I mo I -Γ1 pH值為7. 8的磷酸鹽緩沖液洗10 min，去除多余的THP，
于50 °C真空干燥得活化絲素，備用。4、將100 mL濃度為15 ATU · mL—1的凝血酶溶液加入O. I g活化絲素，于25 °C以300 r · mirT1攪拌，固定3. 5 h后,用O. I mo I · L-1 pH值為7. 5磷酸緩沖液洗至洗脫液于280 nm波長處無光吸收，吸干，用生理鹽水浸泡，待測定活力回收率。5、用凝血酶滴定改進法測定溶液中的水蛭素濃度。將一定質(zhì)量的固定化凝血酶放 入一定體積、濃度已知的水蛭素溶液中于37 °C下作用I min后，分離固定化凝血酶，測定溶液中殘留的水蛭素濃度，用下述公式計算與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素數(shù)量
與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素數(shù)量=固定化作用前溶液中水蛭素數(shù)量一固定化作用后溶液中水蛭素數(shù)量
固定化凝血酶活力回收率=與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素數(shù)量+固定化前溶液中的游離凝血酶數(shù)量X 100%
6、將已測定、計算活力回收率的固定化凝血酶包裝、貼簽，得固定化凝血酶產(chǎn)品，于-18°C保存?zhèn)溆谩?br> 實施例2
I、取等摩爾量的THPC與KOH分別溶于90 mL和10 mL水中，劇烈攪拌下將KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完畢反應結(jié)束，得THP。2、將已除雜的桑蠶繭隨機切碎，按桑蠶繭質(zhì)量I g加50 mL的比例加入質(zhì)量分數(shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液，于100 1溫度下以300 r · min—1攪拌35 min，取出，按碳酸鈉溶液3倍的量加入蒸餾水洗滌3次，每次35 min。重復質(zhì)量分數(shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液處理和蒸餾水洗滌步驟各I次，于55°C真空干燥25 min得脫膠絲素。3、使用交聯(lián)劑THP處理使脫膠絲素通過其-NH2與THP的-CH2OH脫水后結(jié)合。按每I g脫膠絲素用100 mL THP溶液的比例加入后，以300 r · min—1攪拌，于35°C交聯(lián)35min。交聯(lián)結(jié)束后用O. I mo I -Γ1 pH值為8. O的磷酸鹽緩沖液洗15 min，去除多余的THP，
于50 °C真空干燥得活化絲素，備用。4、將100 mL濃度為15 ATU · mL—1的凝血酶溶液加入O. 3g活化絲素，于25 °C以300 r · mirT1攪拌，固定4. 5 h后,用O. I mo I · L-1 pH值為7. 5磷酸緩沖液洗至洗脫液于280 nm波長處無光吸收，吸干，用生理鹽水浸泡，待測定活力回收率。5、用凝血酶滴定改進法測定溶液中的水蛭素濃度。將一定質(zhì)量的固定化凝血酶放入一定體積、濃度已知的水蛭素溶液中于37 °C下作用I min后，分離固定化凝血酶，測定溶液中殘留的水蛭素濃度，用下述公式計算與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素數(shù)量
與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素數(shù)量=固定化作用前溶液中水蛭素數(shù)量一固定化作用后溶液中水蛭素數(shù)量
固定化凝血酶活力回收率=與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素數(shù)量+固定化前溶液中的游離凝血酶數(shù)量X 100% 6、將已測定、計算活力回收率的固定化凝血酶包裝、貼簽，得固定化凝血酶產(chǎn)品，于-18°C保存?zhèn)溆?。實施?
I、取等摩爾量的THPC與KOH分別溶于90 mL和10 mL水中，劇烈攪拌下將KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完畢反應結(jié)束，得THP。2、將已除雜的桑蠶繭隨機切碎，按桑蠶繭質(zhì)量I g加50 mL的比例加入質(zhì)量分數(shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液，于100 1溫度下以300 r · min—1攪拌30 min，取出，按碳酸鈉溶液3倍的量加入蒸餾水洗滌3次，每次30 min。重復質(zhì)量分數(shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液處理和蒸餾水洗滌步驟各I次，于50°C真空干燥30 min得脫膠絲素。3、使用交聯(lián)劑THP處理使脫膠絲素通過其-NH2與THP的-CH2OH脫水后結(jié)合。按每I g脫膠絲素用100 mL THP溶液的比例加入后，以300 r · min—1攪拌，于30°C交聯(lián)40min。交聯(lián)結(jié)束后用O. I mo I -Γ1 pH值為7. 8的磷酸鹽緩沖液洗12 min，去除多余的THP，
于50 °C真空干燥得活化絲素，備用。4、將100 mL濃度為15 ATU · mL—1的凝血酶溶液加入O. 2g活化絲素，于25 °C以300 r IirT1攪拌，固定4 h后，用O. I mo I -T1 pH值為7. 5磷酸緩沖液洗至洗脫液于280nm波長處無光吸收，吸干，用生理鹽水浸泡，待測定活力回收率。5、用凝血酶滴定改進法測定溶液中的水蛭素濃度。將一定質(zhì)量的固定化凝血酶放入一定體積、濃度已知的水蛭素溶液中于37 °C下作用I min后，分離固定化凝血酶，測定溶液中殘留的水蛭素濃度，用下述公式計算與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素數(shù)量
與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素數(shù)量=固定化作用前溶液中水蛭素數(shù)量一固定化作用后溶液中水蛭素數(shù)量
固定化凝血酶活力回收率=與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素數(shù)量+固定化前溶液中的游離凝血酶數(shù)量X 100%
6、將已測定、計算活力回收率的固定化凝血酶包裝、貼簽，得固定化凝血酶產(chǎn)品，于-18°C保存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
1.一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法，其特征在于包括以下幾個步驟三羥甲基磷(THP)的制備、絲素脫膠、脫膠絲素的活化、凝血酶的固定，具體方法如下 (1)THP的制備取等摩爾量的四羥甲基氯化磷(THPC)與氫氧化鉀(KOH)分別溶于90mL和10 mL水中，劇烈攪拌下將KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完畢反應結(jié)束，得THP ； (2)絲素脫膠將已除雜的桑蠶繭隨機切碎，將桑蠶繭加入質(zhì)量分數(shù)為O.5%的碳酸鈉溶液，于100 1溫度下以300 r ^irT1攪拌25 35min，取出，按碳酸鈉溶液3倍的量加入蒸餾水洗滌3次，每次25 35 min,重復質(zhì)量分數(shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液處理和蒸餾水洗滌步驟各I次，然后于45飛5°C真空干燥25 35min得脫膠絲素； (3)脫膠絲素的活化將脫膠絲素加入THP溶液后，以300r ^mirT1攪拌，于25 35°C交 聯(lián)35 45min，交聯(lián)結(jié)束后用O. I mo I · L-1 pH值為7. 5 8. O的磷酸鹽緩沖液洗10 15 min,去除多余的THP，于50 °C真空干燥得活化絲素，備用； (4)凝血酶的固定將100mL濃度為15抗凝血酶活力單位(ATU) -πιΓ1的凝血酶溶液力口入O. I O. 3 g活化絲素，于25°C以300 r .mirf1攪拌，固定3. 5 4. 5 h后，用O. I mo I .171pH值為7. 5 8. O磷酸緩沖液洗至洗脫液于280 nm波長處無光吸收，吸干，用生理鹽水浸泡，準備測定活力回收率。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法，其特征在于步驟(2)所述的碳酸鈉溶液的加入量為按桑蠶絲質(zhì)量Ig加50 mL的比例加入質(zhì)量分數(shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法，其特征在于步驟(3)所述的THP的用量為按每Ig脫膠絲素用100 mL THP溶液的比例加入。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法，屬于醫(yī)藥衛(wèi)生技術(shù)領域，包括三羥甲基磷的制備、絲素脫膠、脫膠絲素的活化、凝血酶的固定四個步驟，具體是利用阻燃劑四羥甲基氯化磷(THPC)與氫氧化鉀(KOH)反應得到三羥甲基磷(THP)；將已除雜的桑蠶繭切碎，加入碳酸鈉溶液處理脫膠，用蒸餾水洗去碳酸鈉，真空干燥得脫膠絲素；加入三羥甲基磷溶液中交聯(lián)，分離，取固體部分用磷酸鹽緩沖液洗，去除多余的三羥甲基磷，真空干燥得活化絲素；取適量加入凝血酶溶液中以固定凝血酶，完成后用磷酸緩沖液洗去游離的凝血酶，吸干，測定活力回收率。本發(fā)明工藝簡單易行，生產(chǎn)周期較短，生產(chǎn)過程環(huán)保無毒；可為批量制備高純度水蛭素提供物質(zhì)基礎。
文檔編號C12N11/06GK102876654SQ20121039839
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者方富永, 苗艷麗, 王宏波, 蘆志剛, 廖艷, 宋文東 申請人:廣東海洋大學