一種鑒別紫萁貫眾的特異性引物、其試劑盒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鑒別紫萁貫眾的特異性引物、其試劑盒及應(yīng)用。所述引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1-2所示。本發(fā)明為紫萁貫眾的藥材鑒別提供了分子鑒定依據(jù)，可從多種藥材中快速、準(zhǔn)確地檢測出紫萁貫眾。該方法構(gòu)建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)對(duì)紫萁貫眾的莖、葉或植物其它部位以及藥材的檢測，適于廣泛的推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種鑒別紫萁貫眾的特異性引物、其試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種鑒別紫萁貫眾的特異性引物、其試劑盒及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]紫萁貫眾，2010版藥典新增品種，《中華本草》中指出早在《爾雅》《后漢書》等著名典籍中就已有記載。又名大貫眾(《山東中草藥手冊》)等，性苦，微寒，有小毒；歸肺、胃、肝經(jīng)，具有清熱解毒、止血、殺蟲等功效?！吨袊幍洹?2010版)收載的紫萁貫眾為紫萁科植物紫萁(Osmunda japonica Thunb.)的干燥根莖和葉柄殘基。現(xiàn)代藥理作用研究表明，紫萁根狀莖中的多糖成分具有一定廣譜的抑菌作用和驅(qū)蟲作用；含有的留體類化合物有明顯的抗病毒活性；含有的蛻皮留酮、紫萁酮等有明顯的抗氧化活性；紫萁的生品和炭品都有一定的凝血作用；以及其他改善記憶、抗癌、提高機(jī)體免疫力等作用。紫萁貫眾經(jīng)常作為貫眾的一種主要商品流通品種，隨著2010版藥典的單獨(dú)收載，在使用過程中應(yīng)特別注意其與貫眾類藥材的混淆問題。
[0003]傳統(tǒng)的鑒別方法如薄層鑒別、顯微鑒別、化學(xué)成分鑒別等，以及藥典上給出的水分、灰分、酸不溶性灰分的檢查標(biāo)準(zhǔn)都可以對(duì)紫萁進(jìn)行鑒別，但都不能很準(zhǔn)確的鑒別紫萁貫眾，特別是紫萁貫眾偽品較多，如貫眾、莢果蕨、鐵線蕨等，增加了鑒別的難度。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)成為鑒別植物的熱門生物技術(shù)。限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA (RAPD)、ISSR標(biāo)記、AFLP技術(shù)等得到了廣泛的發(fā)展和應(yīng)用。但存在成本及操作難易度問題，以及靈敏性和特異性問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種可快速、準(zhǔn)確地鑒別紫萁貫眾的特異性引物及含有該引物的試劑盒。
[0005]本發(fā)明另一目的是提供采用上述特異性引物PCR檢測紫萁貫眾的方法。
[0006]本發(fā)明又一目的是提供上述引物或試劑盒在鑒別紫萁貫眾中的應(yīng)用。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的紫萁貫眾(Osmunda rhizoma)的PCR檢測特異性引物，其包括
[0008]上游引物F: 5 ’ -TAGAATTAGTGTCAGTAGGAT-3，和
[0009]下游引物R: 5 ’ -GAAAATCAGAGAGACCCTAA-3，。
[0010]本發(fā)明還提供含有上述PCR引物的用于檢測紫萁貫眾的試劑盒。
[0011]所述試劑盒中還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。
[0012]優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
[0013]本發(fā)明還提供所述試劑盒在檢測紫萁貫眾中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明進(jìn)一步 提供采用上述特異性引物PCR檢測紫萁貫眾的方法，包括以下步驟:I)提取樣品中的DNA ; 2 )以步驟I)中提取的DNA為模板，使用上述引物F和R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)分析PCR產(chǎn)物，即對(duì)上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳檢測結(jié)果判定樣品中是否含有紫萁貫眾。
[0015]其中，PCR反應(yīng)體系以26 μ I計(jì)為:
[0016]
[0017]
【權(quán)利要求】
1.用于鑒別紫萁貫眾的特異性引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.1-2所
2.含有權(quán)利要求1所述引物的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
5.權(quán)利要求1所述引物或權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述試劑盒在鑒別紫萁貫眾中的應(yīng)用。
6.一種鑒別紫萁貫眾的方法，包括利用權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的體系以26μ1計(jì)為:模板DNA 2μ I ；2.5Μ dNTPs 2 μ I ;2.5Μ 引物各 I μ I ；5U/1 Taq DNA 聚合酶 0.2 μ I ;10XPCR 反應(yīng)緩沖液 2.5 μ I ；25mmol/L Mg2+2 μ I ；ddH20 補(bǔ)足至 26 μ L.
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的體系進(jìn)一步包括Dye染料2μ 1，ddH20 補(bǔ)足至 26 μ I。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的條件為:94°C30s, 46°Clmin,72°C Imin0
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103725770SQ201210391751
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月15日
【發(fā)明者】陳士林, 黃林芳, 鄭司浩, 楊大堅(jiān), 徐宏喜, 卞兆祥, 陳新滋 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所, 香港浸會(huì)大學(xué)