專利名稱：一種重組牛朊蛋白bPrP及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種重組牛朊蛋白bPrP及其編碼基因和制備方法，以及含有該編碼基因的重組表達(dá)載體和重組牛朊蛋白bPrP在檢測(cè)朊病毒病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
朊病毒(Prion)病，又稱為傳染性海綿狀腦病(TSEs)，是一種致死性神經(jīng)退行性疾病，以腦空泡化、神經(jīng)元死亡和神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞增生為主要特征。朊蛋白與傳染性海綿狀腦病的的發(fā)生密切相關(guān)，因此，重組朊蛋白對(duì)這類病的診斷試劑的研發(fā)及發(fā)病機(jī)制的研究是必不可少的。目前獲得重組朊蛋白的方法都是通過(guò) 基因工程技術(shù)構(gòu)建朊蛋白表達(dá)載體，通過(guò)大腸桿菌表達(dá)目的蛋白，然后通過(guò)復(fù)性獲得可溶狀態(tài)的重組朊蛋白。然而這些表達(dá)技術(shù)在構(gòu)建載體的環(huán)節(jié)都存在一個(gè)不足目的片段通過(guò)雙酶切技術(shù)連接在表達(dá)載體上之后，上游的酶切位點(diǎn)(構(gòu)建載體的酶切位點(diǎn)和額外的酶切位點(diǎn))沒(méi)有去除，會(huì)與目的基因一起被翻譯，目的蛋白的N端相應(yīng)會(huì)多出幾個(gè)氨基酸O 2)，這樣的蛋白在一般的研究中，如制備相應(yīng)抗體等研究中可能會(huì)有一定的影響，且在對(duì)朊蛋白抗性機(jī)制研究的過(guò)程中，無(wú)法滿足精確氨基酸位點(diǎn)的研究工作。迫切需要一種定點(diǎn)消除了酶切位點(diǎn)的全真朊蛋白，為傳染性海綿狀腦病的抗體研制、疾病檢測(cè)提供有效的反應(yīng)原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種消除多余酶切位點(diǎn)的牛朊蛋白。本發(fā)明的另一目的在于提供一種表達(dá)上述蛋白的重組表達(dá)載體。本發(fā)明提供一種重組牛朊蛋白bPrP，其氨基酸序列為(a) SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；或(b)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)牛員可根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的蛋白bPrP的氨基酸序列(SEQ IDNo. 2)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第108位的賴氨酸(Lysine)替換為丙氨酸(Alanine)，將第119位的甘氨酸(Glycine)缺失，不影響其免疫原性。因此，本發(fā)明的重組牛朊蛋白bPrP還包括SEQID No. 2所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有與重組牛朊蛋白bPrP同等活性的由bPrP衍生得到的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了編碼重組牛朊蛋白bPrP的基因，是如下a)或b)(a)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. I所示；或(b)由SEQ ID No. I所示核苷酸序列經(jīng)取代一個(gè)或幾個(gè)核苷酸,得到編碼bPrP的核苷酸序列。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種重組表達(dá)載體，其為含有以重組牛朊蛋白bPrP的編碼基因?yàn)槟康幕虻谋磉_(dá)盒。優(yōu)選地，本發(fā)明的重組表達(dá)載體為pPROEX-htb-bPrP。本發(fā)明提供了含有上述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌。本發(fā)明提供一種構(gòu)建重組表達(dá)載體pPROEX-htb-bPrP的方法，包括以下步驟(I) PCR方法擴(kuò)增bPrPc基因；(2)將PCR產(chǎn)物和載體pPROEX-htb分別用內(nèi)切酶BamHI和Hind III雙酶切；酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌落，得到前期表達(dá)質(zhì)粒；(3)以前期表達(dá)質(zhì)粒為模板，以除去bPrPc基因前酶切位點(diǎn)為目的設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，選取陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒，得到重組表達(dá)載體 pPROEX-htb-bPrPο其中，步驟(I)所述的PCR方法中所用的引物序列分別為h游引物cgcGGATCCCAAGMGCGCC CGAAGC，劃線部分為保護(hù)堿基及BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物cccAAGCTTACGATCCTCTCTGGTAATAGG CC，劃線部分為保護(hù)堿基及 HindIII酶切位點(diǎn)；50 μ L反應(yīng)體系為10XBuffer 5 μ L，dNTP4 μ L，牛全血基因I μ L，上、下游引物各2 μ L，ddH20 35 μ L,高保真DNA聚合酶IyL;PCR反應(yīng)條件為98 V預(yù)變性5min :94 V變性30s，55 °C退火30s，72 V延伸2. 5min, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0其中，步驟(2)所述的感受態(tài)細(xì)胞優(yōu)選為Tl感受態(tài)細(xì)胞，所述的連接使用T4DNA連接酶，反應(yīng)體系lOyL，T4連接酶IyLAXbuffer 2 μ L，載體和目的片段用量根據(jù)實(shí)際濃度調(diào)整，物質(zhì)量比為1:30，將總體積控制在10yL，16°C過(guò)夜連接。其中，步驟(3)所述引物為PlGAAAACCTGTATTTTCAGGGCAAGAAGCGACCAAAACCTGGAGGP2 CCTCCAGGTTTTGGTCGCTTCTTGCCCTGAAAATACAGGTTTTC ；50 μ L 反應(yīng)體系為10 X Buffer 5 μ L，dNTP4 μ L，前期表達(dá)質(zhì)粒 I μ L，P1、P2 各2 μ L，ddH20 35 μ L,高保真 DNA 聚合酶 IyL;PCR反應(yīng)條件為98 V預(yù)變性5min :94 V變性40s，65 °C退火30s，72 V延伸2. 5min, 18 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0其中步驟(3)所述的感受態(tài)細(xì)胞優(yōu)選為Tl感受態(tài)細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種制備重組牛朊蛋白bPrP的方法，其特征在于，包括以下步驟(I)將含有重組牛朊蛋白bPrP編碼基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，制得牛朊蛋白bPrP表達(dá)工程菌；(2)將牛朊蛋白bPrP表達(dá)工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；將鑒定正確的表達(dá)產(chǎn)物過(guò)鎳-NTA瓊脂糖樹(shù)脂層析柱，洗脫得到純化的牛朊蛋白bPrP ；(3)將純化的牛朊蛋白bPrP復(fù)性后加入rTEV內(nèi)切酶，切除組氨酸標(biāo)簽，然后再次通過(guò)鎳-NTA瓊脂糖樹(shù)脂層析柱除去組氨酸標(biāo)簽和重組rTEV酶，將洗脫收集的液體超濾濃縮，得到重組牛朊蛋白bPrP。
本發(fā)明提供的制備重組牛朊蛋白bPrP的方法中，步驟(I)所述的重組表達(dá)載體優(yōu)選為pPROEX-htb-bPrP ;所述感受態(tài)細(xì)胞優(yōu)選BL21感受態(tài)細(xì)胞。本發(fā)明提供的制備重組牛朊蛋白bPrP的方法中，步驟(2)所述的誘導(dǎo)表達(dá)是將步驟(I)構(gòu)建好的牛朊蛋白工程菌接種至20mL含有氨芐青霉素50mg/mL的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(18h左右)，按1%的量接種2L含50mg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C 200rpm培養(yǎng)至細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期OD6qq=O. 4-0. 6。加入IPTG，使其終濃度為lmmol/L，37°C 160rpm培養(yǎng)，誘導(dǎo)后6h收集菌液。取ImL表達(dá)菌體離心，在沉淀中加入30 μ L PBS懸浮后，再加入30 μ L加樣緩沖液混勻(加樣緩沖液的配方SDS O. 5g，巰基乙醇lmL，甘油3mL，溴酚藍(lán)4mg，IM pH6. 8Tris-HCl緩沖液2mL,加蒸懼水定容至IOmL)裂解變性5min, 8000rpm離心后,取10 μ L上清液上樣，同時(shí)設(shè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量孔，進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測(cè)。本發(fā)明提供的制備重組牛朊蛋白bPrP的方法中，步驟(2)是將鑒定正確的牛朊蛋 白純化，具體為將誘導(dǎo)表達(dá)后的2L菌液進(jìn)行12000rpm 15min離心，收集沉淀，在沉淀中加入200mL結(jié)合緩沖液(8M尿素，20mM Na3PO4^OOmM NaCl、pH8. 0)，超聲破碎一直到菌液變得澄清，O. 45 μ mm濾膜過(guò)濾。IOOmL結(jié)合緩沖液利用重力作用通過(guò)IOmL鎳-NTA瓊脂糖樹(shù)脂層析柱進(jìn)行平衡，過(guò)濾后的菌液通過(guò)鎳-NTA瓊脂糖樹(shù)脂層析柱，用200mL結(jié)合緩沖液(20倍體積)自然沖洗鎳柱以去除雜蛋白，然后用200mL洗脫緩沖液(8M尿素，20mM Na3PO4^OOmMNaCl、pH8. O)進(jìn)行洗脫，洗下的液體即為純化好的牛朊蛋白bPrP。再進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測(cè)，western-blot 鑒定。本發(fā)明提供的制備重組牛朊蛋白bPrP的方法中，步驟(3)所述復(fù)性是將純化好的蛋白裝入透析袋中。透析袋經(jīng)過(guò)常規(guī)方法處理把透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度(10-20cm)的小段，在大體積的2%(W/V)碳酸氫鈉和lmmol/LEDTA(pH 8. O)中將透析袋煮沸10分鐘，用蒸餾水徹底清洗透析袋，放在lmmol/L EDTA(pH 8.0)中將之煮沸10分鐘，冷卻后，存放于40C，必須確保透析袋始終浸沒(méi)在溶液內(nèi)。取用透析袋是必須戴手套，用前在透析袋內(nèi)裝滿水然后排出，將之清洗干凈，將純化好的蛋白裝入透析袋中。放入IL透析液A中透析(透析液A配方含有8M尿素，20mM Na3P04、500mMNaCl、10%甘油pH7. 4、IOmM還原型谷胱甘肽)，之后每隔3h棄去IOOmL液體，同時(shí)加入IOOmL透析液B (析液B配方20mM Na3PO4^OOmMNaCl、10%甘油pH7. 4、IOmM還原型谷胱甘肽)，經(jīng)過(guò)20次透析后棄去500mL透析液，再補(bǔ)充5OOmL透析液B,之后完全在透析液B中透析5h,,然后放入透析液C中(透析液C配方20mMNa3P04、10%甘油PH7. 4)透析5h，收集復(fù)性后的蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定。本發(fā)明提供的制備重組牛朊蛋白bPrP的方法中，步驟(3)所述加入rTEV蛋白酶，切除組氨酸標(biāo)簽的具體步驟為按每Iml濃度為lmg/ml添加500U的rTEV蛋白酶(上海前塵生物科技有限公司)，4°C過(guò)夜消化后，通過(guò)Iml的鎳-NTA瓊脂糖樹(shù)脂層析柱(使用前用IOml透析液C平衡)，收集到的液體就是最終的牛朊蛋白bPrP，即除去了組氨酸標(biāo)簽及rTEV蛋白酶的牛朊蛋白bPrP。本發(fā)明提供的制備重組牛朊蛋白bPrP的方法，還包括對(duì)復(fù)性后的重組牛朊蛋白bPrP 進(jìn)行 western-blot 鑒定。本發(fā)明還提供了含有重組牛朊蛋白bPrP的試劑盒或診斷試劑。本發(fā)明將定點(diǎn)突變技術(shù)融入到傳統(tǒng)的蛋白表達(dá)技術(shù)中，在按傳統(tǒng)的技術(shù)構(gòu)建好表達(dá)載體后通過(guò)定點(diǎn)突變的方法使目的基因上游的酶切位點(diǎn)進(jìn)行突變消除，從而構(gòu)建重組牛朊蛋白的全真表達(dá)載體，進(jìn)一步獲得重組牛朊蛋白。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明制備得到的重組牛朊蛋白bPrP具有很好的特異性和免疫反應(yīng)性。


圖I為第一次PCR擴(kuò)增得到的牛朊蛋白bPrP基因的電泳圖，其中M :marker ；1 :人朊蛋白DNA序列，含有上下游酶切位點(diǎn)，約630個(gè)堿基；2 :人朊蛋白DNA序列，含有上下游酶切位點(diǎn)，約630個(gè)堿基；3 :綿羊朊蛋白DNA序列，含有上下游酶切位點(diǎn)，約630個(gè)堿基。圖2為pPROEX-htb質(zhì)粒經(jīng)過(guò)雙酶切之后的電泳圖，其中M :marker ；1 :雙酶切之后的質(zhì)粒；2 :雙酶切之前的質(zhì)粒。圖3為表達(dá)載體pPROEX-htb的結(jié)構(gòu)圖譜。圖4為重組表達(dá)載體pPROEX-htb-bPrP酶切位點(diǎn)突變前后的序列對(duì)照?qǐng)D，其中I 為突變前載體序列，2為突變后載體序列，灰色背景的堿基序列為定點(diǎn)突變?nèi)コ牟糠帧D5為在37 °C，160rpm、不同濃度IPTG下牛朊蛋白bPrP表達(dá)情況，圖中，MiMarker ;對(duì)照空白載體；1、2、3 :誘導(dǎo)前IPTGO. 2mM、0. 4mM、0. 6mM ;4、5、6 :綿羊朊蛋白誘導(dǎo)表達(dá)；箭頭示目的條帶。圖6為本發(fā)明純化后的牛朊蛋白bPrP通過(guò)rTEV酶切除組氨酸標(biāo)簽結(jié)果電泳圖，其中，M =Marker, I :未經(jīng)rTEV酶切除的朊蛋白；2、3 :經(jīng)rTEV酶切除后的重組牛朊蛋白bPrPo圖7本發(fā)明復(fù)性后的牛朊蛋白bPrP與朊蛋白特異性單抗AH6western_blot鑒定結(jié)果，其中，M =Marker ；1~2分別為朊蛋白重復(fù)(5 μ L)。圖8為牛重組朊蛋白多抗Western-blot鑒定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)牛員所熟知的常規(guī)手段。若未特別指明，實(shí)施例中所用的試劑為市售。實(shí)施例I重組表達(dá)載體pPROEX-htb-bPrP的構(gòu)建I、PCR擴(kuò)增牛朊蛋白多肽基因(bPrPc基因)引物上游cgcGGATCCcgcGGATCCCTCTGCAAGA AGCGACC (劃線部分為保護(hù)堿基及BamH I酶切位點(diǎn))，下游cccAAGCTTATGCCCCTCGTTGGTAAT (劃線部分為保護(hù)堿基及HindIII酶切位點(diǎn))引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。模板牛全血(采集于內(nèi)蒙古地區(qū)健康牛群)基因?yàn)槟０?所用全血基因提取試劑盒購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)。PCR體系及條件采用高保真PCR試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為50 μ L。反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種重組牛朊蛋白bPrP其氨基酸序列為 a)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；或 b)SEQID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求I所述重組牛朊蛋白bPrP的基因，是如下a)或b) a)其核苷酸序列如序列表中SEQID No. I所示；或 b)由SEQID No. I所示核苷酸序列經(jīng)取代一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，得到編碼bPrP的核苷酸序列。
3.—種重組表達(dá)載體，其為含有權(quán)利要求2所述基因的表達(dá)盒。
4.如權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其為pPROEX-htb-bPrP。
5.含有權(quán)利要求3或4所述重組表達(dá)載體的細(xì)胞系及重組菌。
6.一種構(gòu)建權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體的方法，包括以下步驟1) PCR方法擴(kuò)增bPrPc基因； 2)將PCR產(chǎn)物和載體pPROEX-htb分別用內(nèi)切酶BamHI和HindIII雙酶切；酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌落，得到前期表達(dá)質(zhì)粒； 3)以前期表達(dá)質(zhì)粒為模板，以除去bPrPc基因前的酶切位點(diǎn)為目的設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，選取陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒，得到重組表達(dá)載體pPROEX-htb-bPrPο
7.如權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟I)所述的PCR方法中所用的引物序列分別為 上游引物cgcGGATCCCTCTGCAAGA AGCGACC，劃線部分為保護(hù)堿基及BamH I酶切位點(diǎn)， 下游引物cccAAGCTTATGCCCCTCGT TGGTAAT，劃線部分為保護(hù)堿基及Hind III酶切位占. 50yL反應(yīng)體系為10XBuffer 5 μ L，dNTP4 μ L，牛全血基因I μ L，上、下游引物各2 μ L，ddH20 35 μ L,高保真 DNA 聚合酶 IyL; PCR反應(yīng)條件為98°C預(yù)變性5min :94°C變性30s，57。。退火30s，72。。延伸2. 5min，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin。
8.如權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟3)所述引物為PI GAAAACCTGTATTTTCAGGGCAAGAAGCGACCAAAACCTGGAGGP2 CCTCCAGGTTTTGGTCGCTTCTTGCCCTGAAAATACAGGTTTTC ； 50 μ L 反應(yīng)體系為10 X Buffer 5 μ L，dNTP4 μ L，前期表達(dá)質(zhì)粒 I μ L，PU P2 各 2 μ L，ddH20 35 μ L,高保真DNA聚合酶IyL; PCR反應(yīng)條件為98°C預(yù)變性5min :94°C變性40s，65。。退火30s，72。。延伸2. 5min, 18個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin。
9.一種制備權(quán)利要求I所述重組牛朊蛋白bPrP的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將權(quán)利要求3或4所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，制得牛朊蛋白bPrP表達(dá)工程菌； 2)將牛朊蛋白bPrP表達(dá)工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；將表達(dá)產(chǎn)物過(guò)鎳-NTA瓊脂糖樹(shù)脂層析柱，洗脫得到純化的牛朊蛋白bPrP ；3)將純化的牛朊蛋白bPrP復(fù)性后加入rTEV內(nèi)切酶，切除組氨酸標(biāo)簽，然后再次通過(guò)鎳-NTA瓊脂糖樹(shù)脂層析柱除去組氨酸標(biāo)簽和重組rTEV酶，將洗脫收集的液體超濾濃縮，得到重組牛朊蛋白bPrP，。復(fù)性后的蛋白就有生物學(xué)活性。
10.含有權(quán)利要求I所述的重組牛朊蛋白bPrP的檢測(cè)試劑盒或診斷試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組牛朊蛋白bPrP及其制備方法和應(yīng)用，bPrP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明以牛全血基因?yàn)槟０?，以SEQ IDNo3、4所示核苷酸序列為引物通過(guò)PCR方法獲得帶有酶切位點(diǎn)的牛朊蛋白DNA序列，將其連接到pPROEX-htb質(zhì)粒上，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)除去表達(dá)載體中目的基因之前的多余酶切位點(diǎn)，獲得bPrP全真表達(dá)載體。將該載體在大腸桿菌中表達(dá)，過(guò)高親和力層析柱純化、復(fù)性，得到了和天然prion蛋白具有相同構(gòu)象的重組朊蛋白。本發(fā)明所得到的牛朊蛋白氨基酸序列與天然牛朊蛋白高度相似(僅N端多了一個(gè)甘氨酸)，可用于開(kāi)發(fā)牛朊蛋白單克隆抗體、對(duì)牛的朊病毒病診斷試劑盒用。
文檔編號(hào)C12N1/15GK102875662SQ20121037618
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者楊利峰, 趙德明, 楊秀進(jìn), 王伊琴, 宋志琦, 周向梅, 尹曉敏, 趙化粉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)