專利名稱：一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法。
背景技術(shù)：
檸檬酸是目前可以用微生物代謝生產(chǎn)的重要有機酸，其用途非常廣泛，主要用于食品工業(yè)，其次是醫(yī)藥、紡織、建筑等工業(yè)部門；在各種重要器材的清洗、除銹和日用化工等方面也有重要用途?，F(xiàn)有技術(shù)的檸檬酸發(fā)酵過程中，當(dāng)將黑曲霉種子液培養(yǎng)成熟并移入發(fā)酵罐后，通常在發(fā)酵的整個過程中對發(fā)酵液的pH值不加控制，而在檸檬酸發(fā)酵液中，一方面，由于發(fā)酵原料(例如，玉米粉和甘薯粉等)中含有豐富的碳源、氮源，所以隨著發(fā)酵菌種對發(fā)酵液中 碳源、氮源地利用，以及檸檬酸和其他代謝產(chǎn)物的積累，會導(dǎo)致發(fā)酵液的PH值迅速下降；另一方面由于發(fā)酵液所用的原料各不相同(例如，原料的產(chǎn)地、品種、晾曬程度等)，會導(dǎo)致發(fā)酵液PH值變化的差異性較大，從而導(dǎo)致黑曲霉菌體不能發(fā)揮其最佳效應(yīng)，進而影響發(fā)酵菌種的代謝活動和朽1檬酸的合成。由此可見，發(fā)酵液的pH值是發(fā)酵過程控制的難點，也是導(dǎo)致發(fā)酵效率不穩(wěn)定的重要因素，從而會影響檸檬酸的發(fā)酵酸度、發(fā)酵轉(zhuǎn)換率和發(fā)酵強度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)在檸檬酸發(fā)酵過程中對發(fā)酵液pH值控制的不易，發(fā)酵效率不穩(wěn)定，檸檬酸的發(fā)酵酸度低、發(fā)酵轉(zhuǎn)化率低和發(fā)酵強度低的缺點，提供一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，以達到在發(fā)酵過程中對發(fā)酵液PH值的有效控制，穩(wěn)定發(fā)酵效率，從而提高檸檬酸的發(fā)酵酸度、發(fā)酵轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵強度。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由于黑曲霉朽1檬酸的發(fā)酵適宜在低pH值(一般pH值低于
2.5)的條件下進行，所以現(xiàn)有技術(shù)對整個發(fā)酵過程的pH值不加控制，以致在發(fā)酵前期發(fā)酵液的PH值便迅速下降并接近2. 2，甚至更低，但是，研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉的最適生長的pH值為2. 8-4. 5，而在發(fā)酵前期，黑曲霉正處于生長的對數(shù)期和其自身代謝的糖化酶體系發(fā)揮作用的關(guān)鍵時期，較低的PH值嚴(yán)重地影響了黑曲霉的生長和代謝活動，所以采用現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)朽1檬酸，朽1檬酸的發(fā)酵效率不穩(wěn)定，發(fā)酵酸度、發(fā)酵轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵強度較低的一個重要原因是在發(fā)酵前期發(fā)酵液的PH過低，一方面，使正處于生長對數(shù)期的黑曲霉的生長受到了抑制，從而導(dǎo)致了菌體生長不足和菌體早衰，影響了檸檬酸的發(fā)酵酸度、發(fā)酵轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵強度及后續(xù)對檸檬酸的壓濾、中和提取等程序；另一方面，此階段內(nèi)主要依靠發(fā)酵菌種自身代謝的糖化酶體系將發(fā)酵液進行糖化，因此，過低的PH值也影響了其自身代謝的糖化酶體系對發(fā)酵液進行有效地糖化，從而導(dǎo)致了原料的利用率過低。因此，在發(fā)酵前期對發(fā)酵液的PH值進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，使其有利于菌體的生長和自身代謝糖化酶體系作用的發(fā)揮，可有效地穩(wěn)定發(fā)酵效率，從而提高檸檬酸的發(fā)酵酸度、發(fā)酵轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵強度。因此，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，該方法包括，在生成檸檬酸的條件下，將黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵并產(chǎn)生檸檬酸，其中，在發(fā)酵前期對發(fā)酵液的PH值進行調(diào)節(jié)，并維持所述發(fā)酵液的pH值不低于2. 8 ;所述發(fā)酵前期為將黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中開始至發(fā)酵20小時的時間段。優(yōu)選地，維持所述發(fā)酵液的pH值為2. 8-4. 5，更優(yōu)選地，維持所述發(fā)酵液的pH值為
3.0_3· 5 ο通過上述技術(shù)方案來生產(chǎn)檸檬酸，實現(xiàn)了在發(fā)酵前期對發(fā)酵液pH值的有效控制，保證了菌體的正常生長和自身代謝的糖化酶體系作用的發(fā)揮，從而穩(wěn)定了發(fā)酵效率，有效地提高了檸檬酸的發(fā)酵酸度、發(fā)酵轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵強度。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式
部分予以詳細(xì)說明。
具體實施方式

以下對本發(fā)明的具體實施方式
進行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明，所述檸檬酸制備的方法包括在生成檸檬酸的條件下，將黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，其中，在發(fā)酵前期對發(fā)酵液的PH值進行調(diào)節(jié)，并維持所述發(fā)酵液的PH值不低于2. 8 ;所述發(fā)酵前期為將黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中開始至發(fā)酵20小時的時間段。根據(jù)本發(fā)明，在所述發(fā)酵前期，黑曲霉正處于生長的對數(shù)期，也是菌體自身代謝的糖化酶體系發(fā)揮作用的關(guān)鍵時期，但隨著發(fā)酵菌種產(chǎn)檸檬酸速率的加快和其它代謝產(chǎn)物的積累，所述發(fā)酵液的PH值呈迅速下降趨勢，甚至低于2. 2。通常情況下，黑曲霉最適生長的pH值為2. 8-4. 5，而黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的最適pH值為I. 8-2. 8，由于此階段主要用于發(fā)酵菌種的生長和其自身代謝的糖化酶體系的作用，所以，在發(fā)酵前期對發(fā)酵液的PH值進行調(diào)節(jié)是保證黑曲霉生長和其自身代謝的糖化酶體系作用的關(guān)鍵。根據(jù)本發(fā)明，在發(fā)酵前期為了使黑曲霉迅速生長并達到最大量并且使其自身代謝的糖化酶體系發(fā)揮最大的作用，所以，在發(fā)酵前期對發(fā)酵液的PH值進行調(diào)節(jié)后，優(yōu)選情況下，維持所述發(fā)酵液的PH值為2. 8-4. 5 ;更優(yōu)情況下，維持所述發(fā)酵液的pH值為3. 0-3. 5。在此PH值范圍內(nèi)可以確保黑曲霉順利生長和其自身代謝的糖化酶體系作用的發(fā)揮。根據(jù)本發(fā)明，在所述發(fā)酵前期對發(fā)酵液進行pH值調(diào)節(jié)的方法為向所述發(fā)酵液中添加堿性物質(zhì)，所述堿性物質(zhì)的可選范圍較寬，例如，可以選自氨水、碳酸鈣、碳酸氫鈣等堿性或弱堿性物質(zhì)中的一種或多種。根據(jù)本發(fā)明，所述堿性物質(zhì)的加入形式可以以固體形式加入,也可以以其水溶液和/或懸濁液的形式加入，優(yōu)選情況下，以其水溶液和/或懸濁液的形式加入到所述發(fā)酵液中。同時，一方面為了不使所述堿性物質(zhì)水溶液和/或懸濁液加入到發(fā)酵液中時引起發(fā)酵液局部PH值過高而對菌體造成殺傷作用；另一方面，為了不使所述堿性物質(zhì)水溶液和/或懸濁液由于濃度過低而加入的量過多，從而對發(fā)酵液造成稀釋，所以，優(yōu)選情況下，所述堿性物質(zhì)水溶液的濃度和/或懸濁液的固含量，例如，氨水為2-5體積％、碳酸鈣懸濁液的固含量為3-6重量％、碳酸氫I丐懸池液的固含量為4-8重量％。根據(jù)本發(fā)明，所述堿性物質(zhì)水溶液和/或懸濁液的配制方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以在量筒中量取和/或在分析天平上稱取所述堿性物質(zhì)，并將其溶于無菌水中，攪拌將其溶解或使其成懸濁液勻漿。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，從將黑曲霉接種到發(fā)酵液中開始至發(fā)酵3小時的時間段內(nèi)，由于黑曲霉處于對發(fā)酵環(huán)境的適應(yīng)調(diào)整階段，所述發(fā)酵液的PH值變化較小，基本保持在3. 3-3. 6，但隨著適應(yīng)調(diào)整階段的結(jié)束，產(chǎn)酸階段的開始，發(fā)酵液的pH值迅速下降，且不再適合黑曲霉的生長，所以，優(yōu)選情況下，開始向所述發(fā)酵液中添加所述堿性物質(zhì)的時機為發(fā)酵3-5小時之間(包括發(fā)酵至第3小時和第5小時的時間點)，以保證在所述發(fā)酵前期所述發(fā)酵液的pH值一直維持在上述優(yōu)選范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，向所述發(fā)酵液中添加所述堿性物質(zhì)的方法為下述方法中的任意一種方法(I):向所述發(fā)酵液中連續(xù)添加所述堿性物質(zhì)；方法(2):向所述發(fā)酵液中分多次添加所述堿性物質(zhì)，相鄰兩次添加的時間間隔為2-5小時； 方法(3)向所述發(fā)酵液中一次性添加所述堿性物質(zhì)，一次性添加所用的時間為30_60mino根據(jù)本發(fā)明，方法(I)中，當(dāng)以連續(xù)添加的方式加入堿性物質(zhì)時，通常以堿性物質(zhì)水溶液和/或懸濁液的形式加入，并優(yōu)選使所述堿性物質(zhì)水溶液的濃度和/或懸濁液的固含量在上述優(yōu)選范圍內(nèi)，其流速的控制可以根據(jù)發(fā)酵液的pH值，以及通過對發(fā)酵液的pH值進行實時監(jiān)控得到的數(shù)據(jù)進行實時調(diào)整，以使在發(fā)酵前期發(fā)酵液的PH值始終維持不低于
2.8，優(yōu)選pH值為2. 8-4. 5，更優(yōu)選pH值為3. 0-3. 5，通常情況下，以每升發(fā)酵液為基準(zhǔn)，所述堿性物質(zhì)的流速為(O. 4-0. 8) X 10_3L/(L · h)。根據(jù)本發(fā)明，方法(2)中，當(dāng)以分多次添加的方式加入堿性物質(zhì)時，所述堿性物質(zhì)的加入形式可以以固體形式加入，也可以以其水溶液和/或懸濁液的形式加入，但通常以其水溶液和/或懸濁液的形式加入，并優(yōu)選使所述堿性物質(zhì)水溶液的濃度和/或懸濁液的固含量在上述優(yōu)選范圍內(nèi)，其每次的添加量和相鄰兩次添加的間隔時間可以根據(jù)發(fā)酵液的PH值，以及通過對發(fā)酵液的pH值每隔一段時間進行檢測得到的數(shù)據(jù)進行調(diào)整(例如，添加一次后，每隔1-2小時對發(fā)酵液的pH值進行檢測，當(dāng)發(fā)酵液的pH值下降至接近
2.8時，再次進行添加)，以使在發(fā)酵前期發(fā)酵液的pH值始終維持不低于2. 8，優(yōu)選pH值為
2.8-4. 5，更優(yōu)選pH值為3. 0-3. 5，通常情況下，以每升發(fā)酵液為基準(zhǔn)，其每次的添加量為(I. 6-3. 2) X 10_3L/L，相鄰兩次添加的時間間隔優(yōu)選為2-5小時，更優(yōu)選為3_4小時。根據(jù)本發(fā)明，方法(3)中，當(dāng)以一次性添加的方式加入堿性物質(zhì)時，所述堿性物質(zhì)的加入形式可以以固體形式加入，也可以以其水溶液和/或懸濁液的形式加入，但通常以其水溶液和/或懸濁液的形式加入，并優(yōu)選使所述堿性物質(zhì)水溶液的濃度和/或懸濁液的固含量在上述優(yōu)選范圍內(nèi)，一次性的添加量可以為(4-8) X 10_3L/L發(fā)酵液，并在30-60min時間內(nèi)加完所述堿性物質(zhì)，此添加量范圍可保證在發(fā)酵前期發(fā)酵液的PH值始終維持不低于2. 8，優(yōu)選pH值為2. 8-4. 5，更優(yōu)選pH值為3. 0-3. 5。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由于方法(I)采用連續(xù)性的方法向發(fā)酵液中添加堿性物質(zhì)，同時對發(fā)酵液的PH值進行實時監(jiān)控，可使發(fā)酵前期發(fā)酵液的pH值始終維持在本發(fā)明的最優(yōu)范圍內(nèi)。因此，最優(yōu)選情況下，采用方法(I)對發(fā)酵液的pH值進行調(diào)節(jié)。優(yōu)選情況下，在發(fā)酵前期對發(fā)酵液的pH值進行調(diào)節(jié)的同時對發(fā)酵液進行攪拌，以使發(fā)酵液和堿性物質(zhì)快速混合均勻。根據(jù)本發(fā)明，對所述發(fā)酵液pH值進行測定的方法和設(shè)備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以使用PH計(購自梅特勒-托利多，型號為DELTA320)對所述發(fā)酵液的pH值進行測定。根據(jù)本發(fā)明，對發(fā)酵培養(yǎng)基的成分沒有特別的要求，只要可以用于檸檬酸發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基即可。優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物氮源含量為O. 06-0. 14重量％，磷源含量為O. 005-0. 07重量％，無機鹽含量O. 1-2. 6重量％，水含量為77-86重量％ ；所述發(fā)酵液的總糖含量為10-20重量％。一般地，淀粉質(zhì)原料酶解得到液化液，液化液經(jīng)過分離得到淀粉質(zhì)原料酶解殘渣和淀粉質(zhì)原料酶解液化清液，通常可以將淀粉質(zhì)原料酶解液化清液用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基，也可以將淀粉質(zhì)原料酶解液化清液與淀粉質(zhì)原料酶解殘渣混合后用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基，還可以將淀粉質(zhì)原料酶解液化清液與液化液混合后用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明所述淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物優(yōu)選由液化液和淀粉質(zhì)原料酶解液化清液與水混合或不與水混合得到，且進一步優(yōu)選以所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量為100重量份為基準(zhǔn)， 所述淀粉質(zhì)原料酶解液化清液的用量為75-85重量份，所述液化液的用量為15-20重量份，水的用量為0-5重量份。根據(jù)本發(fā)明，所述淀粉質(zhì)原料酶解液化清液可以通過多種方法制備得到，例如，可以通過如下方法制備得到將淀粉質(zhì)原料粉碎，將粉碎后的產(chǎn)物進行酶解，得到酶解產(chǎn)物，將酶解產(chǎn)物固液分離，得到淀粉質(zhì)原料酶解液化清液和淀粉質(zhì)原料酶解殘渣，所述固液分離的條件使淀粉質(zhì)原料酶解殘渣的固含量為5-60重量％，更優(yōu)選為30-50重量％。根據(jù)本發(fā)明，所述淀粉質(zhì)原料可以為本領(lǐng)公知的各種可以用于酶解、發(fā)酵制備檸檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以選自玉米、薯類(如木薯)和小麥中的一種或幾種，優(yōu)選情況下，所述淀粉質(zhì)原料為玉米。所述酶解步驟可以通過本領(lǐng)域常用的方法完成，比如向粉碎產(chǎn)物中添加產(chǎn)酶微生物和/或酶，在產(chǎn)酶微生物的生長溫度和/或酶有活力的溫度下保溫完成。所述產(chǎn)酶微生物為能夠分泌淀粉酶的產(chǎn)酶微生物。所述酶包括淀粉酶。由于微生物生長會產(chǎn)生副產(chǎn)物，因此優(yōu)選直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考慮，優(yōu)選以每克粉碎后的粉碎產(chǎn)物的干重計，所述淀粉酶的用量為15-50個酶活力單位。本發(fā)明所述酶的酶活力單位的定義為在pH值為6. O、溫度為70°C的條件下，I分鐘將I毫克淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。所述酶解的溫度可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選為80_120°C，更優(yōu)選為90_105°C。所述酶解的時間理論上越長越好，考慮到設(shè)備利用率，優(yōu)選所述酶解的時間為90-150分鐘，更優(yōu)選為100-120分鐘。所述酶解的pH值可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選為5. 0-7. 0，更優(yōu)選PH值為5. 6-6.0。淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，其具體選擇為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和異淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用α -淀粉酶和/或異淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明，所述黑曲霉的接種量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，以每毫升發(fā)酵液為基準(zhǔn)，黑曲霉的接種量為I X 104-2. 5 X IO5個孢子，更優(yōu)選3 X IO4-L 5 X IO5個孢子。所述孢子數(shù)可以通過本領(lǐng)域公知的方法測定，例如，通過血球計數(shù)板計數(shù)。本發(fā)明發(fā)酵所使用的黑曲霉可以為商購的黑曲霉固體制劑或黑曲霉菌種，例如，黑曲霉Co827 (上海工業(yè)微生物研究所)和黑曲霉TOl (天津工業(yè)微生物所)。所述黑曲霉可以采用常規(guī)的方法接種，例如，在被接種至發(fā)酵液中之前，將所述黑曲霉經(jīng)過種子培養(yǎng)處理，之后將得到的種子液加入到發(fā)酵液中。黑曲霉種子培養(yǎng)的程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑曲霉的生長進行觀察，當(dāng)pH在2. 0-2. 5、酸度O. 8-2. 0%、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時停止培養(yǎng)。優(yōu)選情況下，所述種子培養(yǎng)處理的方法包括將黑曲霉接種在黑曲霉培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，所述黑曲霉培養(yǎng)液中含有10-17重量％的玉米粉，接種后黑曲霉培養(yǎng)液中黑曲霉的濃度為3X 105-4X 105個孢子/毫升。 根據(jù)本發(fā)明，所述黑曲霉培養(yǎng)液的制備方法沒有特別的限制，只要得到的培養(yǎng)液能夠適用于黑曲霉的培養(yǎng)即可。根據(jù)本發(fā)明，所述黑曲霉種子的培養(yǎng)條件可以在很大范圍內(nèi)改變，例如所述培養(yǎng)的條件可以包括培養(yǎng)的溫度可以為30-42°C，pH值可以為1-7，通氣量可以為O. 1-1. O體積體積 分鐘，壓力可以為0-0. IMpa，培養(yǎng)的時間可以為18-35小時；更優(yōu)選的情況下，培養(yǎng)的溫度為32-40°C，pH值為2-6，通氣量為O. 1-0. 8體積體積 分鐘，壓力為0-0. 08Mpa,培養(yǎng)的時間為20-30小時；進一步優(yōu)選的情況下，培養(yǎng)的溫度為33-38°C，pH值為2_5，為了進一步提高種子的質(zhì)量，在種子培養(yǎng)的0-10小時的時間段內(nèi)，通氣量為O. 1-0. 3體積體積·分鐘，壓力為0-0. 03Mpa，在種子培養(yǎng)的10-16小時的時間段內(nèi)，通氣量為O. 3-0. 5體積體積 分鐘，壓力為O. 03-0. 05Mpa，在種子培養(yǎng)的16小時以后，通氣量為O. 5-0. 8體積體積·分鐘，壓力為O. 05-0. 08Mpa，培養(yǎng)的時間為24-30小時。根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵的條件除發(fā)酵前期的pH值在本發(fā)明所述的范圍內(nèi)之外沒有特別的限制，可以為本領(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵條件，例如，所述發(fā)酵的條件可以包括溫度為30-400C，優(yōu)選為34-38°C ;通氣量為O. 1-1體積體積 分鐘，優(yōu)選為O. 3-1. O體積體積 分鐘，為了進一步縮短發(fā)酵時間以及提高發(fā)酵效率，更優(yōu)選為在發(fā)酵0-6小時的時間段內(nèi)，通氣量為O. 6-0. 8體積體積·分鐘，在發(fā)酵6-24小時的時間段內(nèi)，通氣量為O. 8-1. O體積體積 分鐘，在發(fā)酵24-40小時的時間段內(nèi)，通氣量為O. 6-0. 8體積體積 分鐘,在發(fā)酵的40小時以后，通氣量為O. 3-0. 6體積體積·分鐘；壓力為O. 01-0. 06，優(yōu)選為O. 03-0. 05 ；時間為50-65小時，優(yōu)選為55-62小時。術(shù)語“通氣量”一般以通氣比來表示，通常以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示(V / V · min)，例如通氣比為1:0. 1_1，簡稱通氣量為O. 1-1體積體積·分鐘。所述培養(yǎng)的設(shè)備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以使用發(fā)酵罐進行培養(yǎng)。按照本發(fā)明的方法制備得到的發(fā)酵產(chǎn)物檸檬酸可以用常規(guī)的方法，根據(jù)不同工業(yè)產(chǎn)品的要求分離并精制，比如中和、酸解、脫色、濃縮、結(jié)晶、包裝。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。
另外需要說明的是，在上述具體實施方式
中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合。為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。下面根據(jù)制備例、實施例和對比例詳細(xì)說明本發(fā)明提供的檸檬酸的發(fā)酵方法。其中，發(fā)酵酸度、發(fā)酵轉(zhuǎn)化率及發(fā)酵強度通過如下方法計算。發(fā)酵酸度根據(jù)GB 1987-2007標(biāo)準(zhǔn)檢測發(fā)酵后發(fā)酵液的濃度(簡稱酸度)。發(fā)酵轉(zhuǎn)化率通過上述發(fā)酵酸度計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率(％)=發(fā)酵液的濃度 (簡稱酸度)X發(fā)酵液的體積/總糖的重量X100%，其中，總糖的重量包括種子罐用糖重量和發(fā)酵罐用糖重量。發(fā)酵強度單位體積的發(fā)酵液在單位時間內(nèi)所生成的檸檬酸的質(zhì)量。制備例I發(fā)酵用發(fā)酵液的制備I)原料的粉碎將收獲的玉米在熱水槽浸潤，直至玉米的含水量為15重量％，然后通過粉碎機(江蘇牧羊集團有限公司，968-3型)進行粉碎，得到淀粉質(zhì)原料粉碎產(chǎn)物(粉碎顆粒中50重量％的顆粒直徑小于O. Icm)；2)調(diào)漿將水與在I)中得到的淀粉質(zhì)原料粉碎產(chǎn)物混合進行調(diào)漿得到淀粉漿液，所述淀粉質(zhì)原料粉碎產(chǎn)物與水的重量比為I :3，淀粉漿液的pH值為5. 5 ；3)酶解在2)得到的淀粉漿液與淀粉酶(諾維信公司，α _淀粉酶，本發(fā)明實施例中均為此淀粉酶)混合，在90°C、pH為5. 5的條件下進行酶解100分鐘，相對于每克粉碎后的產(chǎn)物，淀粉酶的用量為40酶活力單位，得到玉米液化液；4)過濾將3)得到的80重量％的酶解產(chǎn)物通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出玉米液化清液和玉米酶解殘渣；5)配制發(fā)酵培養(yǎng)基將上述玉米液化清液和玉米液化液以80 15的體積比混合后加入到發(fā)酵罐中，高溫高壓滅菌后得到發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中總糖的含量為15. 5重量％，氮源含量為O. I重量％,磷源質(zhì)量含量為350mg/L。制備例2發(fā)酵菌種種子液的制備將制備例I的步驟3)中的部分玉米液化液加水稀釋至總糖的含量為11重量％，將培養(yǎng)液投入種子罐，加熱到121 °C消毒，維持20分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種(黑曲霉T01，天津工業(yè)微生物所，本發(fā)明實施例中均為此黑曲霉菌種，接種量為每毫升培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，接種IXlO5個孢子)，溫度為37°C，從第0-10小時的時間段內(nèi)通氣量為O. IV /V ·π η、通入的空氣壓力為0-0. 02Mpa，并在此階段內(nèi)維持此罐壓，第10-16小時的時間段內(nèi)通氣量為O. 3V / V · min、通入的空氣壓力為O. 03-0. 04Mpa，并在此階段內(nèi)維持此罐壓，16小時以后的通氣量為O. 3V / V ·π η、通入的空氣壓力為O. 05-0. 06Mpa,并在此階段內(nèi)維持此罐壓的條件下進行菌種培養(yǎng)；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑曲霉的生長進行觀察，24小時之后，當(dāng)pH在2. O、酸度I. Og/L、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養(yǎng)。
制備例3堿性物質(zhì)水溶液和/或懸濁液的制備氨水將液氨和水在通風(fēng)櫥內(nèi)以一定體積比進行混合，配制濃度為3體積％的氨水溶液；碳酸鈣在分析天平上稱取一定量的碳酸鈣粉末，并加入無菌水配制成濃度為5重量％的碳酸I丐懸池液；碳酸氫鈣在分析天平上稱取一定量的碳酸氫鈣粉末，并加入無菌水配制成濃度為7重量％的碳酸氫I丐懸池液；實施例I
本實施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。將制備例2中培養(yǎng)的黑曲霉種子液加入到制備例I的發(fā)酵培養(yǎng)基中開始發(fā)酵，其中，以每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基計，黑曲霉的接種量為3. OX IO4個孢子，發(fā)酵條件包括溫度為37°C，培養(yǎng)的壓力為O. 04Mpa，從第0_6小時的時間段內(nèi)通氣量為O. 8體積體積·分鐘，第6-24小時的時間段內(nèi)為I. O體積體積·分鐘，第24-40小時的時間段內(nèi)為O. 8體積體積·分鐘，40小時以后為O. 6體積體積·分鐘。在發(fā)酵的第3小時開始向發(fā)酵液中連續(xù)性添加濃度為7重量％碳酸氫鈣懸濁液，其中，以每升發(fā)酵液計，碳酸氫鈣懸濁液添加的流速為(O. 4-0. 6) X 10_3L/(L · h)，維持發(fā)酵液的pH值為3. O (整個過程對發(fā)酵液的pH值進行實時監(jiān)控，根據(jù)監(jiān)控數(shù)據(jù)實時調(diào)整添加流速，以保證在整個發(fā)酵前期，發(fā)酵液的PH值均維持在3. O)。在發(fā)酵至20小時的時候停止加入碳酸氫鈣懸濁液，發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結(jié)晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。根據(jù)GB 1987-2007標(biāo)準(zhǔn)檢測實施例I中所得檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)，計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率和檸檬酸的發(fā)酵強度，轉(zhuǎn)化率(％) =檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)X檸檬酸溶液的體積/總糖的重量X 100%,檸檬酸的發(fā)酵強度(單位體積的發(fā)酵液在單位時間內(nèi)所生成的檸檬酸質(zhì)量)，結(jié)果如表I所示。實施例2本實施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。按照與實施例I相同的方法和條件向發(fā)酵培養(yǎng)基中進行接種并培養(yǎng)，其中，不同在于在發(fā)酵的第5小時開始向發(fā)酵液中連續(xù)性添加濃度為3體積％氨水溶液，其中，以每升發(fā)酵液計，氨水溶液添加的流速為(O. 7-0. 8)X 10_3L/(L *h)，維持發(fā)酵液的pH值為3. 5 (整個過程對發(fā)酵液的PH值進行實時監(jiān)控，根據(jù)監(jiān)控數(shù)據(jù)實時調(diào)整添加流速，以保證在整個發(fā)酵前期，發(fā)酵液的PH值均維持在3. 5)。在發(fā)酵至20小時的時候停止加入氨水溶液，發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結(jié)晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。按照與實施例I相同的方法檢測實施例2中所得的檸檬酸溶液的酸度，并計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率和檸檬酸的發(fā)酵強度，結(jié)果如表I所示。實施例3本實施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。按照與實施例I相同的方法和條件向發(fā)酵培養(yǎng)基中進行接種并培養(yǎng)，其中，不同在于在發(fā)酵的第4小時開始向發(fā)酵液中連續(xù)性添加濃度為5重量％碳酸鈣懸濁液，其中，以每升發(fā)酵液計，碳酸鈣溶液添加的流速為(O. 6-0. 7) X IO-3L/ (L-h),維持發(fā)酵液的pH值為
3.2 (整個過程對發(fā)酵液的pH值進行實時監(jiān)控，根據(jù)監(jiān)控數(shù)據(jù)實時調(diào)整添加流速，以保證在整個發(fā)酵前期，發(fā)酵液的PH值均維持在3. 2)。在發(fā)酵至20小時的時候停止加入碳酸鈣懸濁液，發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結(jié)晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。按照與實施例I相同的方法檢測實施例3中所得的檸檬酸溶液的酸度，并計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率和檸檬酸的發(fā)酵強度，結(jié)果如表I所示。實施例4本實施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。按照與實施例I相同的方法和條件向發(fā)酵培養(yǎng)基中進行接種并培養(yǎng)，其中，不同在于在發(fā)酵的第4、8、12、16小時向發(fā)酵液中分4次添加濃度為5重量％碳酸I丐懸池液,其 中，以每升發(fā)酵液計，每次添加的碳酸鈣懸濁液的添加量為(2. 5-2. 8) XlO-VL (保證開始添加時發(fā)酵液的PH值不高于3. 5，下一次開始添加前發(fā)酵液的pH值不低于3. O)并每隔I小時對發(fā)酵液的PH值進行檢測，根據(jù)檢測數(shù)據(jù)調(diào)整添加量，以保證在整個發(fā)酵前期，發(fā)酵液的PH值均維持在3. 0-3. 5之間。發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結(jié)晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。按照與實施例I相同的方法檢測實施例4中所得的檸檬酸溶液的酸度，并計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率和檸檬酸的發(fā)酵強度，結(jié)果如表I所示。實施例5本實施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。按照與實施例I相同的方法和條件向發(fā)酵培養(yǎng)基中進行接種并培養(yǎng)，其中，不同在于在發(fā)酵的第4小時時向發(fā)酵液中一次性添加濃度為5重量％碳酸I丐懸池液,其中，以每升發(fā)酵液計，碳酸鈣溶液的添加量為6X 10_3L/L (保證開始添加時發(fā)酵液的pH值不高于
4.5，發(fā)酵20小時時發(fā)酵液的pH值不低于2. 8)，在60min時間內(nèi)加完添加上述量的碳酸鈣懸濁液，以保證在整個發(fā)酵前期，發(fā)酵液的pH值均維持在2. 8-4. 5之間,發(fā)酵至60小時,對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結(jié)晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。按照與實施例I相同的方法檢測實施例5中所得的檸檬酸溶液的酸度，并計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率和檸檬酸的發(fā)酵強度，結(jié)果如表I所示。對比例I本對比例用于說明現(xiàn)有技術(shù)提供的發(fā)酵檸檬酸制備的方法。按照與實施例I相同的方法和條件向發(fā)酵培養(yǎng)基中進行接種并培養(yǎng)，其中，不同在于整個發(fā)酵過程中均不向發(fā)酵液中添加堿性物質(zhì)，發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結(jié)晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。按照與實施例I相同的方法檢測對比例I中所得的檸檬酸溶液的酸度，并計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率和檸檬酸的發(fā)酵強度，結(jié)果如表I所示。表I
實施例編號酸度(％)轉(zhuǎn)化率(％)發(fā)酵強度(kg/(m3h))
實施例 I15.0597. 102. 595
實施例 215. 1197.482.605
實施例 3 Γ096. 772. 586
實施例 414.8896.002.480
實施例 514.8095.432.420
對比例 I14. 5694. 322.249 從上表I的數(shù)據(jù)可以看出，與對比例I相比，實施例1-5采用本發(fā)明提供的檸檬酸的制備方法，在發(fā)酵前期向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加堿性物質(zhì)來對發(fā)酵液的PH值進行調(diào)節(jié)，并將PH值控制在本發(fā)明的范圍內(nèi)，有效地提高了發(fā)酵終點時檸檬酸的發(fā)酵酸度、發(fā)酵轉(zhuǎn)換率和發(fā)酵強度；其中，實施例1-3采用連續(xù)性的方法向發(fā)酵液中添加堿性物質(zhì)，效果最佳；實施例4采用分多次向發(fā)酵液中添加堿性物質(zhì)，效果次之；實施例5采用一次性向發(fā)酵液中添加堿性物質(zhì)，效果最差。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，該方法包括，在生成檸檬酸的條件下，將黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，其特征在干，在發(fā)酵前期對發(fā)酵液的PH值進行調(diào)節(jié)，并維持所述發(fā)酵液的PH值不低于2. 8 ;所述發(fā)酵前期為將黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中開始至發(fā)酵20小時的時間段。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，維持所述發(fā)酵液的pH值為2.8-4. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，維持所述發(fā)酵液的pH值為3.0-3. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，pH值的調(diào)節(jié)方法為向所述發(fā)酵液中添加堿性物質(zhì)，所述堿性物質(zhì)選自氨水、碳酸鈣和碳酸氫鈣中的ー種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，開始向所述發(fā)酵液中添加所述堿性物質(zhì)的時機為發(fā)酵3-5小時之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述堿性物質(zhì)的添加方式為下述方法中的任意ー種 方法(I):向所述發(fā)酵液中連續(xù)添加所述堿性物質(zhì)； 方法(2):向所述發(fā)酵液中分多次添加所述堿性物質(zhì)，相鄰兩次添加所述堿性物質(zhì)的時間間隔為2-5小時； 方法(3):向所述發(fā)酵液中一次性添加所述堿性物質(zhì)，一次性添加所用的時間為.30_60mino
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項所述的方法，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件包括培養(yǎng)的溫度為33-40°C，通氣量為O. 1-1體積體積·分鐘，培養(yǎng)的時間為50-65小吋。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，以每毫升發(fā)酵液為基準(zhǔn)，黑曲霉的接種量為1Χ104-2. 5X IO5 個孢子。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述發(fā)酵液含有淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物，所述淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物中，氮源含量為O. 06-0. 14重量％，磷源含量為O. 005-0. 07重量％，無機鹽含量O. 1-2. 6重量％，水含量為77-86重量％ ;所述發(fā)酵液的總糖含量為10-20重量％。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，該方法包括，在生成檸檬酸的條件下，將黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，其特征在于，在發(fā)酵前期對發(fā)酵液的pH值進行調(diào)節(jié)，并維持所述發(fā)酵液的pH值不低于2.8；所述發(fā)酵前期為將黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中開始至發(fā)酵20小時的時間段；本發(fā)明通過向發(fā)酵液中添加堿性物質(zhì)來對發(fā)酵液的pH值進行調(diào)節(jié)。采用本發(fā)明提供的檸檬酸的制備方法，有效地穩(wěn)定了發(fā)酵效率，從而提高了發(fā)酵終點時檸檬酸的發(fā)酵酸度、發(fā)酵轉(zhuǎn)換率和發(fā)酵強度。
文檔編號C12R1/685GK102851330SQ201210356188
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者夏令和, 盧宗梅, 邵引剛, 楊儒文, 鐘華 申請人:中糧生物化學(xué)(安徽)股份有限公司