專利名稱：一種細胞培養(yǎng)基及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥、生物技術等領域，具體地說是涉及單克隆抗體、抗體人源化等生物技術及醫(yī)藥技術領域的一種用于抗體培養(yǎng)基及其制備方法和用途，更具體地說是涉及一種單克隆抗體培養(yǎng)基及其制備方法和用途，再具體地說是涉及一種用于抗CD20單克隆抗體(簡稱抗CD20單抗)培養(yǎng)基及其制備方法和用途。
背景技術：
(一)抗⑶20單克隆抗體的研究概況
1、概述
腫瘤的死亡率在全世界各種疾病的死亡率居榜首，惡性腫瘤已經成為嚴重影響人類健康和生命的殺手。據不完全統計，在中國，每年有300余萬新發(fā)惡性腫瘤患者，其中130 萬人死于惡性腫瘤。在美國，每年診斷為腫瘤的患者為100萬，死于腫瘤的患者達54. 7萬， 用于腫瘤的治療費用1020億美元。資料顯示，今后10年抗腫瘤生物技術藥物會急劇增加， 2007年美國共有400余種新藥在進行抗腫瘤的臨床試驗，其中生物技術類產品占接近一半，可見，生物技術類抗腫瘤藥物在腫瘤的防治中具有十分重要的意義。
非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’s Lymphoma,或稱非何杰金氏淋巴瘤,簡稱NHL) 是常見惡性血液病之一，且是臨床最常見的淋巴系統惡性腫瘤，是由B淋巴細胞(簡稱B細胞)惡性增長引起的(B細胞來源約占85%)，好發(fā)于青壯年。近年來，NHL發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，嚴重危害著人類健康。本發(fā)明研究的CD20單抗是治療非何杰金氏淋巴瘤的一線藥物，是世界上銷售量最大的抗體之一，2010年全 球銷售額達到66億美元。
B淋巴細胞是體液免疫的起點，大部分的造血惡性腫瘤起源于此。因此，由B細胞和其對應惡性腫瘤表達的細胞表面分子是免疫治療的重要靶標。MS4A基因家族的B細胞特異成員⑶20在未成熟和成熟B細胞以及其對應的惡性腫瘤表達(Tedder and Engel (1994) Immunol. Today 15:450-454)ο近年來針對多種惡性腫瘤表面細胞表面抗原標志物的靶向性治療取得巨大進步，應用單克隆抗體治療非霍奇金淋巴瘤的臨床結果取得重大進展，使得針對CD20的單克隆抗體治療非霍奇金淋巴瘤成為發(fā)展前景良好的一種新型抗腫瘤方法。
2、CD20
目前抗CD20單克隆抗體是治療B淋巴瘤的最有效的治療藥物，在治療NHL中有極其重要的地位。⑶20是一種分子量為33 37kD的磷酸化蛋白質分子，是B淋巴細胞非糖基化四重跨膜磷蛋白，位于B淋巴細胞表面，即B淋巴細胞表面分化抗原，而在其他組織以及多能B淋巴干細胞均不表達。它主要參與調節(jié)B淋巴細胞的增殖與分化，在免疫系統起重要作用，⑶20從前-B淋巴細胞階段開始表達，直到漿細胞階段才無⑶20表達(Stashenko p. , Nsdler LM, Hardy R, et al. Characterization of a human B lymphocyte-specific antigen. J.1mmun. 1980 ；125 :1678_1685)。CD20 和抗 CD20 抗體結合后不發(fā)生內吞作用， 因而細胞表面CD20數量并不因為抗體的結合而減少，在人體血清中無游離的CD20存在。 ⑶20抗原高表達于超過95%的正?；驉夯腂淋巴瘤細胞，沒有顯著內吞和脫落(PressOff,FarrAG,Borroz KI et al. Endocytosis and Degradation of Monoclonal Antibodies Targeting Human B-Cell Malignancies. Cancer Resl989 ；49 :4906-4912),因此CD20是治療B淋巴細胞瘤的理想靶點。
3、CD20基因的表達與調控
⑶20是B細胞的重要分化抗原，首先在前-B細胞中表達。成熟的B細胞也表達 ⑶20，B細胞激活將產生⑶20的高表達，激活的扁桃體B細胞上的⑶20可以被沉降下來， 而靜態(tài)的扁桃體B細胞卻不能，生發(fā)中心B細胞上的CD20分子也表現為高表達。熒光分析證實，處于生長進化的B細胞均為⑶20高表達。B細胞向漿細胞分化時，⑶20的表達為下降趨勢，⑶20在漿細胞中不表達。人⑶20基因為單拷貝基因，位于染色體llql2. 13. 1，長 16kb，有8個外顯子，其中外顯子I含有轉錄的起始位點，外顯子III含有翻譯的起始位點， 外顯子VmRNA在剪接時會被剪切下來，外顯子VIII編碼⑶20分子mRNA的3'端非翻譯區(qū)。 ⑶20分子的mRNA以三種形式存在第一種mRNA長2. 8kb，含有外顯子I到外顯子VIII的完整序列，這種mRNA為主要存在形式；第二種mR2NA由于外顯子I和外顯子III的剪接作用而缺少外顯子II，所以在長度上比前者短263bp ;第三種mRNA長3. 4kb，可能是外顯子I 上游的某一段序列參與了外顯子I內部的剪接而產生的，這種形式的mRNA較少。⑶20的表達受到轉錄因子的調節(jié)，PU.1和Pip是最重要的兩個轉錄因子，二者均結合在⑶20的啟動子區(qū)，只有結合了 Pip和PU.1的啟動子才具有啟動轉錄的功能。CD20的啟動子沒有TATA 框，轉錄需要一個保守序列——NF2Y結合位點，約占啟動子的30%。B細胞分化成為漿細胞時，CD20 和 PU.1 的水平均下降(St eve Alas 等，Clin Cancer Res, 2002，8 (3) :836-845)。 ⑶20的表達因淋巴瘤細胞的不同而有所差異，例如⑶20在慢性B淋巴白血病細胞中的表達遠低于正常的B細胞和其他B淋巴瘤細胞，⑶20的表達高低在一定程度上決定了抗體和補體殺傷瘤細胞的程度(Perz J等，Leuk Lymphoma, 2002，43 (I) : 149-151 )。細胞的生長因子能夠調節(jié)一些瘤細胞中 CD20 的表達(Golay J 等，Blood, 2001，98(12) : 3383-3389)。IL24、 TNF2 a、GM2CSF上調慢性B淋巴白血病細胞的⑶20的表達，Sivaraman等發(fā)現慢性B淋巴白血病細胞與 500u/ml的IFN2 α作用24小時后，細胞表面的⑶20分子明顯增加，作用72 小時CD20增加的程度低于24小時，這說明這種刺激作用經歷一個峰值后將隨著時間的延長而下降。Morikawa等發(fā)現，抗⑶5抗體的加入可以使膜⑶20的數量下降，這說明⑶5可能也參與了 CD20 表達的調節(jié)(Morikawa K 等，Scand J Im munol, 2002，55 (I) :44-52)。亦有研究表明離子射線也可持續(xù)上調CD20的表達。
4、CD20分子的功能
⑶20的生理作用至今尚未闡明，根據⑶20與抗⑶20的抗體結合后B細胞產生的一系列的生物學反應，推測CD20可能參與B細胞的增殖、分化、信號轉導和鈣離子的跨膜傳遞?？笴D20的抗體對B細胞增殖的影響因抗體種類而異，抗體IF5可刺激B細胞由GO期進入Gl期，而抗體BI抑制B細胞由Gl期進入S/G2+M期?？耿?0的抗體還抑制B細胞的分化和EB病毒誘導Ig的分泌。CD20的胞內區(qū)與酪氨酸蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶為非共價結合，⑶20與抗⑶20結合將激活這些激酶，誘導PLC Y的磷酸化。同時上調C2myc 和B2myb的mRNA水平，增加⑶18、⑶58和MHCII家族蛋白的表達。越來越多的證據表明， CD20是調節(jié)B淋巴細胞生命與分化信號轉導的重要分子。抗CD20的抗體可直接抑制B細胞生長并誘導其凋亡的發(fā)生，該凋亡的發(fā)生與鈣離子相關。細胞中鈣離子濃度低時，細胞沿循細胞周期生長，CD20與抗體交聯形成后，在漿膜上形成鈣離子通道，細胞內的鈣離子濃度增加，抑制B細胞從Gl期進入S/G2+M期，從而引起細胞凋亡的發(fā)生(Shan D et al. Cancer I mmu no Im munother, 2000，48 (12) : 73-76)。二級抗體(如羊抗人抗體)或表達 FcRI β 細胞可增強上述B細胞的凋亡的發(fā)生，該凋亡與細胞內的鈣離子濃度增加和PTK及其底物的磷酸化有著密切關系(Bt ephan M 等，Cancer Res, 2000，60:7170-7176)。實驗證明，CD20 與抗CD20抗體及二級抗體的超級結合能夠啟動并增強PTK信號通路，底物PLC Y的磷酸化程度與CD20的交聯程度有密切依賴關系，內質網儲存鈣的釋放使細胞內的鈣離子濃度快速增加，同時胱天蛋白酶(caspase)發(fā)生活化。對于耐藥的B細胞瘤，⑶20與抗⑶20抗體的結合增加活性氧的爆發(fā)(St eve Alas 等，Clin Cancer Res, 2002，8 (3) :836-845)。以上說明CD20分子本身是一個鈣泵，CD20的激活是調節(jié)內源性鈣離子變化的又一個影響因素， 并通過鈣離子變化直接調節(jié)鈣離子通道活性。
5、抗⑶20單克隆抗體研究進展
多數的人B細胞譜系惡性腫瘤表達CD20 (Anderson等，Blood, 198463 :1424)。 基于抗⑶20嵌合體或放射標記單克隆抗體的療法已經用于非霍奇金淋巴瘤(Press 等，Hematology，2001，221-240 ;Kaminski 等，N. Engl. J. Med. 1993329:459-465)。 臨床研究表明抗CD20單克隆抗體治療hia改善類風濕性該關節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜和溶血性貧血以及其他免疫介導的疾病臨床表現(Sliverman等，Arthritis Rheum. , 2002, 48:1484-1492;Enwards 等，Rheumatology,2001, 40:1-7)。
應用競爭性假設解釋抗⑶20單克隆抗體的體內(in vivo)治療效果。在一個模型中，⑶20作為膜整合的靶標用于通過天然免疫系統的活化或效應子機制的啟動產生單克隆抗體介導的 B 細胞消除(Reff 等,Blood, 1994, 83:435-445;Maloney 等 Blo od, 1998,90 2188-2195;Maloney 等，J. Clin. Oncol. 1997，15:3266-3274)。
目前，經FDA批準上市用于治療NHL的抗CD20的單抗有Rituximab、Zevalin, Bexxar等，Rituximab (利妥昔單抗，商品名美羅華；后簡稱美羅華)是第一個是上市的抗 CD20的單克隆抗體類藥物，是一種嵌合體人IgGl抗人CD20單克隆抗體，能高效誘導補體 (C)激活的經典途徑和對新鮮分離的淋巴瘤細胞和B細胞系的補體依賴的細胞毒性(RefT 等，Blood, 1994，83 :435-445 ；Golay 等，Blood, 98 :3383-3389 ；Cragg 等 Blood, 2003，101 1045-1052 ；Di Gaetano 等 J.1mmunl. 2003, 171:1581-1587;Bellosillo 等，Blood, 2001, 98:2771-2777)。美羅華還在病人(van der Klok 等，Br. J. Hematol. 2001，115:807-811) 和靈長類(Kennedy等，Blood，2003，101 :1071-1079)體內激活補體。此外，包括CD59在內的補體調解蛋白的腫瘤細胞中的表達和抗⑶20治療的抗性相關(Golay等，Blood, 98 3383-3389 ;Treon 等 J.1mmunotheraphy，200124:263-271 )。雖然許多人認為補體依賴的細胞毒性是美羅華在體外(i η V i tr ο )和體內消除人淋巴瘤細胞中所使用的主要用途(Go I ay 等，Blood，98 :3383-3389 ;Cragg 等 Blood，2003，101 :1045-1052 ；Di Gaetano 等 J.1mmunl. 2003，171:1581-1587;Golay 等，Blood,95 :3900-3908 ；Di Gaetano 等 J. Hematol. 2001，11 4:800-809;Weiner Blood2003,101 :788)，但是其他人發(fā)現，根據腫瘤細胞對補體介導裂解的易感性以及補體抑制劑CD46、CD55和CD59在腫瘤細胞上的表達不能預測美羅華的治療效果(Weng和Levy，Blood，2001，98 :1352_1357)。因為與臨床使用的同種型不同的嵌合體抗CD20單克隆抗體不能在非人或靈長類中消除正常的B細胞(Anderson等,Biochem. Soc.Transac.，1997，25 =705-708),并且抗CD20單克隆抗體的抗腫瘤效應部分地依賴通過IgG 的Fe受體(Fe Y R)的免疫激活(Clynes等,Nature Med. ,2000,6 :443-446),所以其他的抗體依賴作用也是重要的。此外，抗⑶20單克隆抗體處理改變了跨膜Ca2+轉運和B細胞功能，這些擾亂了細胞周期進程(Tedder和Engel, Immunol. Today, 1994, 15:450-454)并且能夠誘導B細胞的程序性細胞死亡(Shan等，Blood, 1998，91 :1644_1652)。
單獨使用美羅華治療復發(fā)以及難治的非霍奇金淋巴瘤有效率達50%左右，若與化療藥物聯用，則有效率可達909^100%。同時，美羅華會帶來一系列的不良反應，諸如脫發(fā)、 惡心、嘔吐、血細胞減少等，且有輕微的發(fā)熱、寒顫等。但美羅華仍由其在治療非霍奇金淋巴瘤上表現的良好療效和低毒副作用，已成為美國銷售額最大的抗腫瘤藥物之一，2008年銷售額近30億，年增長率14%。
但這些藥物治療費用較高，致使中國很多患者難以接受治療。因此，研究療效好、 治療成本低的藥物對提高非霍奇金淋巴瘤患者的生活質量具有重大意義。此外，研發(fā)對人免疫原性更小，表達量更高，以及具有其他優(yōu)良特性的抗CD20單克隆抗體或多克隆抗體， 更成為目前的研究重點。
(二)真核細胞基因表達系統
自20世紀70年代基因工程技術誕生以來，基因表達技術已滲透到生命科學研究的各個領域。并隨著人類基因組計劃實施的進行，在技術方法上得到了很大發(fā)展，時至今日已取得令人矚目的成就。隨著人類基因組計劃的完成，越來越多的基因被發(fā)現，其中多數基因功能不明。利用表達系統在哺乳動物細胞內表達目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
在各種表達系統中，最早被采用進行研究的是原核表達系統，這也是目前掌握最為成熟的表達系統。該項技術的主要方法是將已克隆入目的基因DNA段的載體(一般為質粒)轉化細菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過IPTG誘導并最終純化獲得所需的目的蛋白。 其優(yōu)點在于能夠在較短時間內獲得基因表達產物，而且所需的成本相對比較低廉。但與此同時原核表達系統還存在許多難以克服的缺點如通常使用的表達系統無法 對表達時間及表達水平進行調控，有些基因的持續(xù)表達可能會對宿主細胞產生毒害作用，過量表達可能導致非生理反應，目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產物純化困難；而且原核表達系統翻譯后加工修飾體系不完善，表達產物的生物活性較低。
為克服上述不足，許多學者將原核基因調控系統引入真核基因調控領域，其優(yōu)點是
a)根據原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設計，而靶DNA與真核基因調控序列基本無同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制；
b)能誘導基因高效表達，可達105倍，為其他系統所不及；
c)能嚴格調控基因表達，即不僅可控制基因表達的“開關”，還可人為地調控基因表達量。
因此，利用真核表達系統來表達目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統有酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞表達系統。
1、酵母表達系統
最早應用于基因工程的酵母是釀酒酵母，后來人們又相繼開發(fā)了裂殖酵母、克魯維酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表達系統是目前應用最廣泛的酵母表達系統。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha,Candida Bodini,Pichia Pastris3種。以Pichia Pastoris 應用最多。
甲醇酵母的表達載體為整合型質粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。大部分甲醇酵母的表達載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因-1 (簡稱A0xl)，在該基因的啟動子(簡稱PAX0I)作用下，外源基因得以表達。PAXOI 是一個強啟動子，在以葡萄糖或甘油為碳源時。甲醇酵母中AOxl基因的表達受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時PAXOI可被誘導激活，因而外源基因可在其控制下表達，將目的基因多拷貝整合入酵母染色體后可以提高外源蛋白的表達水平及產量。此外甲醇酵母的表達載體都為E. coli/Pichia Pastoris的穿梭載體，其中含有E. coli復制起點和篩選標志,可在獲得克隆后采用E. coli細胞大量擴增.目前，將質粒載體轉入酵母菌的方法主要有原生質體轉化法、電擊法及氯化鋰法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導表達外源蛋白。這樣可以大大提高表達產量。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質其產量往往可達克級。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細胞，不會發(fā)生超糖基化。
利用PAXOI表達外源蛋白時，一般需很長時間才能達到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危險性化工產品。使得實驗操作過程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生產。因此那些不需要甲醇誘導的啟動子受到青睞包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多種。利用三磷酸甘油醛脫氫酶(簡稱GAP)啟動子代替PAX0I，不需要甲醇誘導。培養(yǎng)過程中無需更換碳源，操作更為簡便，可縮短外源蛋白到達峰值水平的時間。
酵母表達系統作為一種后起的外源蛋白表達系統，由于兼具原核以及真核表達系統的優(yōu)點，正在基因工程領域中得到日益廣泛的應用。
2、昆蟲細胞表達系統桿狀病毒表達系統是目前應用最廣的昆蟲細胞表達系統，該系統通常采用目宿銀紋夜蛾桿狀病毒(簡稱=AcNPV)作為表達載體。在AcNPV感染昆蟲細胞的后期，核多角體基因可編碼產生多角體蛋白，該蛋白包裹病毒顆粒可形成包涵體。核多角體基因啟動子具有極強的啟動蛋白表達能力，故常被用來構建桿狀病毒傳遞質粒。克隆入外源基因的傳遞質粒與野生型AcNPV共轉染昆蟲細胞后可發(fā)生同源重組，重組后多角體基因被破壞，因而在感染細胞中不能形成包涵體，利用這一特點可挑選出含重組桿狀病毒的昆蟲細胞但效率比較低，且載體構建時間長，一般需要4 6周。此外，昆蟲細胞不能表達帶有完整N聯聚糖的真核糖蛋白。
在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表達引起昆蟲細胞的裂解，胞質內的物質釋放出來，與目的蛋白混在一起，從而使蛋白的純化工作變得很困難，另外水解酶的釋放會降解重組蛋白。為了克服以上這些困難，科學工作者先后嘗試用絲蛾肌動蛋白基因啟動子或桿狀病毒ie-Ι基因啟動子表達外源蛋白，但效果都不明顯。Farrel等(Farrel等， Biotech, and Bioeng. ,1998,60 (6) :656-663)介紹了一種新型的鱗翅目昆蟲細胞表達系統，該系統主要包括3個調節(jié)外源蛋白表達序列(l)Bombyx mori的肌動蛋白基因啟動子； (2)Bombyx mori的核型多角體病毒(BmNPV)的立早基因ie_l (編碼俄IE-1蛋白，該蛋白是種轉錄激活因子，可在體外激活肌動蛋白基因啟動子)；(3) BmNPV的同源重復序列3 (HR3)可作為肌動蛋白基因啟動子的增強子。三者協同作用，可使轉錄活性提高1000倍以上，從而大大地提高外源蛋白的表達水平。另外目前還有一種新型的宿主范圍廣的雜合核多角體病毒(HyNPV)被應用于昆蟲細胞表達系統的構建，該病毒由AcNPV及Bni’ qP發(fā)展而來。
一般情況下桿狀病毒表達系統所能表達的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分為非分泌性。為了解決這個問題將Hsp70 (熱休克蛋白70)與外源蛋白共表達可明顯提高重組蛋白的分泌水平，這是因為分泌性多肽被翻譯后必須到達內質網進行加工才能被分泌至胞外。如果到達內質網前，前體多肽就伸展開來，暴露出疏水殘基，殘基間的相互作用可引起多肽的凝聚，這對最終的表達水平有很大影響。而Hsp70是一種分子伴侶，能夠與新翻譯的多肽結合，抑制前體肽的凝聚使前體肽順利到達內質網進行加工，從而提高蛋白的分泌水平。
最近，人們又構建了桿狀病毒-S2表達系統，該系統能將重組桿狀病毒轉染果蠅 S2細胞，以前人們認為桿狀病毒僅能在鱗翅目昆蟲細胞(如sf9、sf21)中復制，不能在其他昆蟲細胞(如果蠅細胞)中復制，然而目前研究表明在一定條件下，桿狀病毒也能感染果蠅細胞。在果蠅細胞中，桿狀病毒的多角體基因啟動子幾乎不發(fā)生作用。桿狀病毒-S2表達系統的表達載體利用的是果蠅啟動子如Hsp70啟動子、肌動蛋白5C啟動子、金屬硫蛋白基因啟動子等，其中，Hsp70啟動子的作用最強。重組桿狀病毒感染S2細胞后不會引起宿主細胞的裂解，且蛋白表達水平與鱗翅目細胞相似，因此，桿狀病毒-S2系統是一個很有應用前景的昆蟲細胞表達系統。昆蟲細胞表達系統，特別是桿狀病毒表達系統由于其操作安全， 表達量高，目前與酵母表達系統一樣被廣泛應用于基因工程的各個領域中。
3、哺乳動物細胞表達系統
由哺乳動物細胞翻譯后再加工修飾產生的外源蛋白質，在活性方面遠勝于原核表達系統及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統，更接近于天然蛋白質。哺乳動物細胞表達載體包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等。
將外源基因導入哺乳動物細胞主要通過2類方法一是感染性病毒顆粒感染宿主細胞，二是通過脂質體法、顯微注射法、磷酸·鈣共沉淀法及DEAE —葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因導入到細胞中。外源基因的體外表達一般采用質粒表達載體，如將重組質粒導入CHO細胞可建立高效穩(wěn)定的表達系統，而利用COS細胞可建立瞬時表達系統。目前，病毒載體已成為動物體內表達外源基因的有力工具，在臨床基因治療的探索中也發(fā)揮了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相當大(約187kb)，利用它作為載體可同時插入幾種外源基因，從而構建多價疫苗。另外，逆轉錄病毒感染效率高，某些難轉染的細胞系也可通過其導入外源基因，但要注意的是逆轉錄病毒可整合入宿主細胞染色體，具有潛在的危險性。
由于腺病毒易于培養(yǎng)、純化，宿主范圍廣，故采用該類病毒構建的載體被廣泛應用腺病毒載體的構建依賴于腺病毒穿梭質粒和包裝載體之間的同源重組。但是哺乳動物細胞內的這種同源重組效率很低，利用細菌內同源重組法構建重組體效率會大大提高，即將外源基因插入到腺病毒穿梭質粒中，形成轉移質粒，將其線性化后與腺病毒包裝質粒共轉化大腸埃希菌。另一種方法是通過CrelaxP系統構建重組腺病毒載體，在轉移質粒和包裝質粒中都插入IaxP位點，然后將兩個質粒共轉染表達Cre重組酶的哺乳動物細胞，通過Cre 介導兩個IaxP位點之間的DNA發(fā)生重組，可獲得重組腺病毒，這種重組效率比一般的細胞內同源效率高30倍。最近，人們在桿狀病毒中插入巨細胞病毒的啟動子建立了高效的基因轉移載體。由于桿狀病毒是昆蟲病毒，在哺乳動物細胞中不會引起病毒基因的表達，而且載體的構建容易，因而利用桿狀病毒進行基因轉移為發(fā)明人提供了很好的途徑。利用哺乳動物細胞表達外源基因時，大多數情況下不需要誘導，但當表達產物對細胞有毒性時應采取誘導，這樣可避免表達產物產生早期就對細胞產生影響。哺乳動物細胞中用到的誘導型載體主要與啟動子有關如熱休克蛋白啟動子可在高溫下被誘導，還有重金屬、糖皮質激素誘導的啟動子。但這些系統存在一些共同的缺陷，如誘導表達特異性差； 當系統處于關閉狀態(tài)時表達有泄漏誘導劑本身有毒性，常對細胞造成損傷等。
為此，Gossen等構建了受四環(huán)素負調節(jié)的Tet-on基因表達系統，該系統由調節(jié)質粒和反應質粒組成。調節(jié)質粒中具有編碼轉錄激活因子(簡稱fIA)的序列，在沒有四環(huán)素或強力毒素存在的情況下tTA可引起下游目的基因表達。隨后Gossen等又對tTA的氨基酸序列進行了改造，構建了受四環(huán)素正調節(jié)的Tet-on基因表達系統，該系統在沒有四環(huán)素的情況下啟動子不被激活，而在加入四環(huán)素或強力毒素后目的基因高效表達(Gossen 等，Science, 1995，268 (5218) :1766-1769 ；Gossen 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 1992,89(12):5547-5551)。四環(huán)素誘導的基因表達系統是目前應用最廣泛的哺乳動物細胞誘導表達系統，該系統具有嚴密、高效可控制性強的優(yōu)點。
外源蛋白的表達會對哺乳動物細胞產生不利影響，因此利用哺乳動物細胞表達外源基因時，一個主要問題便是外源基因不能持久穩(wěn)定地表達。Mielke等(Mielke等，Gene, 2000,254 (1-2) :1_8)構建了一種能夠在哺乳動物中穩(wěn)定表達異二聚體蛋白的載體系統， 在這個系統中，編碼抗體重鏈和輕鏈的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被轉錄成三順反子mRNA。 內部的順反子通過內核糖體進入位點(簡稱=IREs)介導進行翻譯，通過持續(xù)選擇壓力，無需繁瑣的篩選過程，便可獲得持久、穩(wěn)定表達抗體分子的重組體。
哺乳動物細胞表達系統常用的宿主細胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等，不同的宿主細胞對蛋白表達水平和蛋白質的糖基化有不同的影響，因此在選擇宿主細胞時應根據具體情況而定。
利用基因工程技術表達外源蛋白。其產量還不高，難以滿足大規(guī)模的實際應用。通過轉基因動物或轉基因植物技術可從動物的乳汁或植物的葉組織中很方便地獲得大量較純的生物活性物質，但目前這項技術還不很成熟，有待進一步研究。
由哺乳動物細胞翻譯后再加工修飾產生的外源蛋白質，在活性方面遠勝于原核表達系統及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統(Mielke等，Gene，2000，254 (1_2):1_8)。Vander Geld等利用不同的表達系統表達了蛋白激酶(簡稱PR30)，并對它們的抗原性進行了比較，結果發(fā)現，在哺乳動物細胞中表達的PR3具有與抗PR3抗體結合的所有表位，在昆蟲細胞中表達的PR3具有大部分表位，而在甲醇酵母中表達的PR3只具有少數幾個表位(Vander Geld 等，J.1mmunol. Meth.，2000，244 (1-2) :117_132)。
哺乳動物細胞產生的蛋白質更接近于天然蛋白質，但其表達量低、操作繁瑣。因此，研發(fā)一種表達量更高，操作簡便的哺乳細胞表達系統，具有巨大的應用空間；并且可以提供成本更低的基因工程類藥物，具有巨大的社會意義和經濟價值。
(三)哺乳動物細胞無血清培養(yǎng)基
1、細胞培養(yǎng)基概述及優(yōu)缺點分析
細胞培養(yǎng)基是細胞體外培養(yǎng)的最重要因素。無血清培養(yǎng)基是繼天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基之后的第三類培養(yǎng)基。與傳統的培養(yǎng)基相比，無血清培養(yǎng)基是一種不含有動物血清或其他生物提取液，但仍可以維持細胞在體外較長時間生長、繁殖的一種培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基由于其組成成分相對清楚，制備過程簡單，在現代生物技術學領域得到廣泛應用。無血清培養(yǎng)技術也是闡明細胞生長、增殖、分化及基因表達調控的基礎研究問題的有力工具。
常規(guī)細胞培養(yǎng)基的制備方法是在基礎培養(yǎng)基中添加相應量的血清或組織提取物， 其中最常用于培養(yǎng)基的血清是一種組分很不明確的混合物。所以常規(guī)血清細胞培養(yǎng)基存在以下缺點
(I)血清來自于動物體，其對細胞在體外培養(yǎng)時的主要作用是提供生長因子、激素、結合蛋白，并提供保護作用，但同時也有細胞生長抑制因子和毒性因子，所以存在潛在毒性。、
(2)由于動物血清提取的局限，使其應用于培養(yǎng)基的價格格外昂貴。
(3)動物血清提取的局限，也給細胞培養(yǎng)的標準化帶來困難，同時也存在細胞培養(yǎng)表達產品分離純化難的問題，具有潛在的細胞毒性作用，給規(guī)模化培養(yǎng)細胞增加了難度(Even M S，Sandusky C B, Barnard N D. Serum free hydridoma culture : ethical, scientific and safety considerations[J] . Trendsin Biotechnology,2006, 24(3):105-108.)。
由于上述常規(guī)血清細胞培養(yǎng)基存在的諸多問題，促使發(fā) 明人改進培養(yǎng)方法，用無血清細胞培養(yǎng)基來替代。細胞工程中無血清培養(yǎng)技術的應用，在很大程度上可以避免含血清培養(yǎng)所帶來的不利。無血清培養(yǎng)基具有以下明顯的優(yōu)缺點
無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點
①可避免血清批次間的質量變動，提高細胞培養(yǎng)和實驗結果的重復性。
②避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染。
③避免血清組分對實驗研究的影響。
④有利于體外培養(yǎng)細胞的分化。
⑤可提高產品的表達水平并使細胞產品易于純化。
缺點
①細胞在無血清培養(yǎng)基中易受某些機械因素和化學因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應用不如傳統的合成培養(yǎng)基方便。
②成本較高。
③針對性很強，一種無血清培養(yǎng)基僅適合某一類細胞的培養(yǎng)。
2、無血清培養(yǎng)基的發(fā)展概述
從1975年垂體細胞株Gh3在無血清介質中生長獲得成功到現在，無血清培養(yǎng)基的發(fā)展大致經歷了 3代。
第I代無血清培養(yǎng)基不含血清，但含有大量成分不明確的動、植物蛋白。因此，其不利于目標蛋白的分離純化，成本也較高。
第2代無血清培養(yǎng)基是基于生產重組藥物的安全考慮而開發(fā)的，其主要特點是完全不用動物來源蛋白，稱之為無血清，無動物衍生蛋白培養(yǎng)基。它的優(yōu)點是既可降低生產成本，又能加快報批的速度。
由于生物工程的要求，第3代無血清培養(yǎng)基近年已出現，即完全沒有蛋白或含量極低，組成成分全為化學已知物的培養(yǎng)基，稱之為雙無培養(yǎng)基。其優(yōu)點在于細胞培養(yǎng)與生產很容易做到恒定，目標蛋白的分離純化更為容易，細胞培養(yǎng)基的原材料成本大為下降，生產中品質管理更加容易。但其對培養(yǎng)的細胞具有很高的特異性。
目前預測第4代無血清培養(yǎng)基將會進入研究與開發(fā)，這將是一種無血清、無蛋白、 又可以高溫消毒的適合于許多種不同細胞生長的全能型培養(yǎng)基。小結可見表I (陳峰，無血清培養(yǎng)基的主要補充印子及研究進展[J].海峽藥學，2006，18 (4):10-13)。
由上可知，第四代培養(yǎng)基的研制開發(fā)并投入市場將成為發(fā)展趨勢。
表1、無血清培養(yǎng)基的發(fā)展過程
權利要求
1.一種細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的該培養(yǎng)基是無血清無蛋白培養(yǎng)基，由基礎培養(yǎng)基和補充因子構成；所述的補充因子由無機鹽類、氨基酸、維生素、其他物質組成，其含量分別為 O. ΟΟΓΟ. 9%、0· ΟΟΓΟ. 035%,O. ΟΟΓΟ. 06%,O. 00Γ0. 4%。
2.根據權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的無機鹽類是包括無水氯化鈣、七水硫酸亞鐵、氯化鉀、氯化鎂、無水硫酸鎂、氯化鈉、無水磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉或七水硫酸鋅中的一種或多種。
3.根據權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的氨基酸是包括L-精氨酸鹽酸鹽、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、 L-賴氨酸鹽酸鹽、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-天門冬酰胺、L-天門冬氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸或L-纈氨酸中的一種或多種。
4.根據權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的維生素是包括硫辛酸、維生素H、D-泛酸鈣、氯化膽堿、葉酸、i_肌醇、煙酰胺、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺或維生素B12中的一種或多種。
5.根據權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的其他物質是包括D-葡萄糖、 次黃嘌呤、酚紅或胸苷等中的一種或多種。
6.根據權利要求1至5任一項所述的細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的該無血清無蛋白培養(yǎng)基的制造流程為(1)稱取所有成分；(2)溶解于10升純水中，攪拌溶解；(3)無菌過濾，即為成品無血清無蛋白培養(yǎng)基。
7.根據權利要求1至5任一項所述的細胞培養(yǎng)基作為培養(yǎng)CHO細胞的培養(yǎng)基的應用。
8.根據權利要求7所述的細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO細胞的具體步驟包括(1)在本發(fā)明所述的無血清培養(yǎng)基中接種CHO細胞；(2)在適合生長的條件下培養(yǎng)CHO細胞一段時間，即得所述的CHO細胞。
9.根據權利要求8所述的細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的適合生長的條件是 37±2°C, 5± 1% 二氧化碳,所述的一段時間是1-3周。
10.根據權利要求8所述的細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的該CHO細胞用于制備抗 CD20單克隆抗體，其制備方法包括如下步驟(O構建一個獨特的PMED高效哺乳動物細胞基因表達系統；(2)建立一個懸浮細胞、無血清培養(yǎng)馴化體系，通過轉染將⑶20單抗基因整合到CHO 細胞的基因組中，通過逐步增加MTX的濃度使整合在細胞內的目的蛋白基因拷貝數大量擴增，篩選CHO細胞亞克隆，獲得高表達工程細胞株，并建立三級種子細胞庫；(3)建立適合哺乳動物細胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，使用該無血清CD培養(yǎng)基培養(yǎng) CHO工程細胞株；(4)建立哺乳動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)及蛋白純化體系，利用哺乳動物細胞大規(guī)模發(fā)酵及純化平臺，獲得外源蛋白的大規(guī)模表達。
11.根據權利要求10所述的細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的該抗CD20單克隆抗體的有關測定情況如下(1)N端氨基酸序列測定測序結果為 Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-Phe-Thr-Pro-Tyr-Ala-Pro-Glu-Pro-Gly，該結果與文獻報道的美羅華一致；(2)C端搭配序列測定測序結果為 Lys-Gly-Pro-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Thr-Tyr-His-Asn-His,該結果與文獻報道的美羅華一致；(3)肽圖分析肽譜與對照品美羅華一致；(4)分子量測定測得的分子量還原型介于6317KD，非還原型約為150KD，與對照品及文獻報道的美羅華一致；(5)等電點測定測得的等電點分布在4. 8±0. 5內，與對照品及文獻報道的美羅華一致。
12.根據權利要求10所述的細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的CHO工程細胞株是中國倉鼠卵巢細胞CHO DG44。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于抗CD20單抗培養(yǎng)基及其制備方法和用途。該培養(yǎng)基是一種無血清無蛋白培養(yǎng)基，由基礎培養(yǎng)基和補充因子構成，補充因子由無機鹽類、氨基酸、維生素、其他物質組成。該培養(yǎng)基上清用于培養(yǎng)基因工程CHO細胞，用于制備價格昂貴的蛋白質藥物如抗CD20單抗、促紅細胞生成素、干擾素等。該培養(yǎng)基具有成本低、細胞培養(yǎng)密度大(可達9x106/L)、活力高、蛋白高表達(可達到3g/L)及易純化等優(yōu)勢。本發(fā)明避免了血清的批次、質量、成分等對細胞培養(yǎng)造成的污染、毒性作用和不利于產品純化等不良影響，同時可以降低細胞培養(yǎng)液的成本，提高生物制品成品率和利潤率，適于醫(yī)藥、生物技術領域等工業(yè)和行業(yè)的大規(guī)模生產和商業(yè)應用，應用前景良好，具有顯著的社會效益、經濟效益。
文檔編號C12N5/00GK102994441SQ20121035281
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權日2012年9月19日
發(fā)明者宋華, 白文, 肖鐘熙 申請人:上海瀚康生物醫(yī)藥科技有限公司